Articolo metodologico

Un test tossicologico ed ecotossicologico basato sulla motilità degli emociti delle cozze (Mytilus galloprovincialis)

1.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67285

⸱

13 dicembre 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

In questo articolo

Sommario

L'articolo propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti, basato sulla motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis . Il metodo mira a contribuire allo sviluppo di test di esposizione tossicologica ed ecotossicologica più etici e sensibili.

Abstract

Gli emociti sono le cellule immuno-competenti circolanti nei molluschi bivalvi e svolgono un ruolo chiave in diverse importanti funzioni dell'immunità innata cellulo-mediata. Durante le prime fasi della risposta immunitaria, gli emociti migrano attivamente verso il sito dell'infezione. Questa motilità intrinseca è una caratteristica fondamentale di queste cellule. Rappresenta una funzione cellulare chiave che integra molteplici processi, come l'adesione cellulare, la segnalazione cellulare, la dinamica del citoscheletro e i cambiamenti nel volume cellulare. Pertanto, le alterazioni della motilità cellulare in seguito all'esposizione a farmaci o inquinanti possono fungere da utile endpoint tossicologico. Nonostante il ruolo fondamentale della motilità cellulare nella fisiologia cellulare, è stata scarsamente studiata da un punto di vista tossicologico. Questo lavoro propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti, basata sulla valutazione della motilità emocitaria di Mytilus galloprovincialis. Abbiamo sviluppato un saggio di motilità cellulare su emociti che aderiscono al fondo di una micropiastra di polistirene a 96 pozzetti. A seguito dell'esposizione a concentrazioni crescenti di farmaci, le traiettorie e le velocità cellulari sono state quantificate mediante tracciamento cellulare al microscopio time-lapse, permettendoci di misurare gli effetti sulla motilità degli emociti. A causa della facilità di raccolta degli emociti dagli animali in modo relativamente non invasivo, il metodo proposto offre un test alternativo per lo screening degli effetti e dei meccanismi d'azione di inquinanti e farmaci. Si allinea con i criteri 3R (Replacement, Reduction, and Refinement), affrontando le preoccupazioni etiche e contribuendo alla riduzione dei test sugli animali in vivo sui vertebrati.

Introduzione

I metodi basati sugli effetti, come i biosaggi in vitro e in vivo, rappresentano strumenti innovativi per la rilevazione degli effetti degli inquinanti chimici ambientali negli organismi viventi e per il loro utilizzo come strumenti nel monitoraggio ambientale e nella valutazione del rischio 1,2,3,4. Completano l'approccio chimico analitico classico superando alcuni dei suoi limiti. Ad esempio, i metodi basati sugli effetti possono valutare la biodisponibilità degli inquinanti, il loro impatto sulla salute degli organismi e gli effetti tossicologici combinati delle miscele. Questi effetti combinati potrebbero non essere prevedibili basandosi esclusivamente sull'analisi chimica5.

Negli ultimi anni, l'ecotossicologia degli inquinanti di preoccupazione emergente (inquinanti emergenti) rappresenta un campo in cui i metodi basati sugli effetti possono essere strumenti utili per rilevare l'esposizione e valutare l'impatto sul biota 1,5,6,7. Diversi metodi basati sugli effetti utilizzano i molluschi bivalvi come organismi di prova nel monitoraggio e nella valutazione ambientale 8,9. Alcune caratteristiche rendono questi organismi adatti agli studi ecotossicologici, come la loro ampia distribuzione, la loro natura filtratrice, il loro stile di vita sesilile, la capacità di bioaccumulo di un'ampia gamma di inquinanti ambientali e di sviluppare risposte rilevabili agli inquinanti, la possibilità di lavorare con diverse fasi di vita e di mantenere in condizioni di laboratorio7. Sono altamente sensibili all'esposizione all'inquinamento e mostrano una varietà di risposte ai contaminanti tossici a seconda della specie, della fase di vita e delle condizioni ambientali 8,9,10. Pertanto, diverse linee guida ambientali utilizzano le specie bivalvi come specie di prova standardizzate10,11.

Tra i molluschi bivalvi, il diffuso Mytilus galloprovincialis è una delle specie più utilizzate in campo ecotossicologico per la sua capacità di sviluppare risposte precoci rilevabili all'esposizione all'inquinamento chimico, tra cui l'induzione di metallotioneina, l'alterazione enzimatica antiossidante, la destabilizzazione della membrana lisosomiale, la perossidazione lipidica, l'accumulo di lipofuscina, l'aumento della frequenza dei micronuclei, l'induzione dell'anidrasi carbonica 12,13,14, 15. Gli emociti, le cellule emolinfatiche immunocompetenti, sono ampiamente utilizzati per studiare gli impatti tossicologici degli inquinanti ambientali nei molluschi bivalvi 4,13,16,17. Queste cellule sono cruciali per la risposta immunitaria dell'organismo, svolgendo diverse importanti funzioni dell'immunità innata cellulo-mediata. Questi includono l'eliminazione dei microbi attraverso la fagocitosi e varie reazioni citotossiche, come il rilascio di enzimi lisosomiali, peptidi antimicrobici e la produzione di metaboliti dell'ossigeno durante lo scoppio respiratorio 18,19,20. Gli emociti sono cellule intrinsecamente mobili 21,22,23 in grado di migrare verso il sito di infezione durante la fase iniziale della risposta immunitaria dell'organismo. In generale, la motilità è una caratteristica fondamentale che caratterizza tutte le cellule immunitarie poiché consente l'immunosorveglianza di queste cellule per proteggere l'organismo24. La ricerca su varie specie di molluschi dimostra che la motilità degli emociti è una componente fondamentale della loro risposta immunitaria, della guarigione delle ferite e dell'interazione con gli agenti patogeni. Questa motilità è regolata da specifiche vie molecolari, evidenziando la complessità e la specializzazione delle funzioni degli emociti nei molluschi 21,25,26,27.

Nonostante l'importanza fondamentale della motilità nella fisiologia degli emociti, pochissimi studi hanno indagato la sensibilità della motilità degli emociti agli inquinanti chimici ambientali 23,28,29,30. Recentemente, il nostro gruppo ha caratterizzato il movimento spontaneo degli emociti di Mytilus galloprovincialis in una micropiastra di polistirene a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale e ha esaminato la sensibilità della motilità degli emociti all'esposizione in vitro al paracetamolo23. Gli emociti di M. galloprovincialis hanno mostrato un movimento cellulare casuale basato su lamellipodi e rapidi cambiamenti di forma, come precedentemente trovato in un'altra specie di cozza, Mytilus edulis 21,22,23,28, e già descritto in cellule immunitarie umane31. Recentemente è stato dimostrato che la motilità degli emociti è sensibile ai fattori di stress chimico23,28. Sulla base di questi risultati precedenti, questo lavoro propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti basata sulla valutazione della motilità degli emociti di M. galloprovincialis e delle sue alterazioni, attraverso l'analisi velocimetrica della motilità cellulare (quantificazione della velocità media, della distanza migrata, della distanza euclidea e dell'immediatezza). Il metodo offre la possibilità di eseguire lo screening in vitro della tossicità di diverse sostanze sia in saggi a breve termine (della durata di 1-4 ore) che in saggi di esposizione prolungata, della durata di 24-48 ore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto della normativa italiana sul benessere degli animali (D.L.26/2014) che ha recepito la Direttiva del Consiglio del Comitato Europeo (2010/63 CEE). Mytilus galloprovincialis è un bivalve filtratore, comunemente noto come cozza mediterranea. È originario del Mar Mediterraneo e della costa atlantica dell'Europa meridionale. È stato introdotto ed è diffuso nel Nord America occidentale, in Asia e in Sud Africa. È un'importante specie di pesca commerciale in diverse parti del mondo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di acqua di mare artificiale (ASTM) o acqua di mare naturale filtrata

  1. Per la preparazione di acqua di mare artificiale ASW secondo ASTM D1141-98 (2021)32, sciogliere i seguenti sali in acqua distillata (g per 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. La soluzione ASW ha un pH di 7,80.
  2. Per la preparazione di acqua di mare naturale filtrata (FSW), filtrare l'acqua di mare naturale 37 PSU, raccolta da un sito non interessato da attività antropiche con filtri da 0,2 μm.

2. Acclimatazione degli animali

  1. Prima dell'uso sperimentale, acclimatare gli esemplari adulti di cozze (Mytilus galloprovincialis Lam.) per 24 ore in vasche statiche (in fase di fame) contenenti ASW o FSW aerati (1 L/animale) a 15 °C in un locale termostatico.

3. Preparazione del reagente per la valutazione della motilità degli emociti

  1. Preparare acqua di mare filtrata (FSW) come sopra o soluzione fisiologica standard (SPS). Sciogliere HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etansolfonico) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g in circa 800 mL di acqua distillata, quindi portare a 1 L con l'aggiunta di altra acqua distillata. Regolare il pH a 7,36 con 1 M NaOH.
  2. Preparare una soluzione madre di Rosso Neutro di 20 mg/mL in dimetilsolfossido (DMSO).
  3. Preparare la soluzione di colorazione Neutral Red: aggiungere 5 μl di una soluzione madre di Neutral Red a 995 μl di FSW o SPS.
  4. Preparare FSW o SPS integrati con 2 mM di L-glutammina, 40 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina come segue: Aggiungere 100 μL di 2 mM di L-glutammina e 100 μL di miscela Penicillina/Streptomicina a 10 mL di FSW/SPS.
  5. Preparare lo 0,4% di tripano blu in FSW o SPS.
    NOTA: La soluzione madre di Rosso neutro è stata preparata secondo Martínez-Gómez et al.33. La soluzione madre di Neutral Red dura circa 2-3 settimane se conservata a 4 °C. La soluzione colorante di colore rosso neutro e il blu di tripano allo 0,4% devono essere preparati appena prima del test.

4. Prelievo di emolinfa

  1. Preriempire una siringa con 0,5 mL di FSW di acqua di mare filtrata o SPS fisiologico standard (a 15 °C).
  2. Sollevare leggermente e con attenzione le valvole lungo la superficie ventrale con un bisturi. Mantenere il bisturi in posizione o utilizzare una punta per pipetta. Lasciare che l'ago di una siringa ipodermica entri nello spazio tra le valvole.
  3. Raccogliere delicatamente 0,5 mL di emolinfa dal muscolo adduttore posteriore con la siringa preriempita secondo UNEP/RAMOGE34.
  4. Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire il contenuto della siringa in una microprovetta.
  5. Raccogliere l'emolinfa da 3-4 cozze e raccogliere i campioni di emolinfa in una provetta a 15 °C utilizzando lo stesso rapporto tra gli individui.
    NOTA: Il preriempimento della siringa viene utilizzato per diluire immediatamente l'emolinfa 1:1 durante il prelievo. La diluizione dell'emolinfa con FSW o SPS in un rapporto 50:50 è comunemente usata per prevenire l'aggregazione degli emociti, secondo Martínez-Gómez et al.33.

5. Placcatura e coltura degli emociti

  1. Contare le cellule con un emocitometro.
  2. Diluire l'emolinfa alla concentrazione di 1 × 106 cellule/mL con FSW o SPS.
  3. Valutare la vitalità degli emociti in sospensione mediante colorazione con blu di tripano: aggiungere 100 μl di blu di tripano allo 0,4% disciolto in FSW o SPS a 100 μl di sospensione di emociti. Incubare per 5 minuti a 15 °C.
  4. Quindi, aggiungere una goccia di sospensione in un emocitometro e contare le cellule non colorate (vitali) e colorate (non vitali) sotto osservazione microscopica.
  5. Valutare la vitalità degli emociti come percentuale di cellule vitali calcolata sul numero totale di cellule contate35.
  6. Utilizzare la seguente formula per la valutazione della vitalità cellulare35:
    Cellule vitali (%) = [numero di cellule vitali/numero totale di cellule (vitali + non vitali)] x 100
  7. Assicurarsi che la vitalità degli emociti sia superiore al 95% per procedere ulteriormente nel protocollo.
  8. Aggiungere 50 μl di emolinfa diluita in ciascun pozzetto di una micropiastra in polistirene a fondo piatto a 96 pozzetti trattata con TC per colture cellulari. Coprite il piatto con il suo coperchio.
  9. Lasciare che gli emociti aderiscano al fondo dei pozzetti per 30 minuti a 15 °C per formare un monostrato.
  10. Rimuovere l'emolinfa in eccesso aspirando delicatamente con una micropipetta.

6. Saggio a breve termine

  1. Per saggi a breve termine (entro 1-4 ore), incubare immediatamente le cellule aderenti al fondo dei pozzetti con 100 μL della sostanza di interesse disciolta in FSW o SPS a diverse concentrazioni a 15 °C. Utilizzare almeno tre pozzetti per tre determinazioni di replica di ciascuna condizione sperimentale.
  2. Dopo l'incubazione, valutare la motilità cellulare seguendo il passaggio 8.

7. Saggio di esposizione prolungata

  1. Per esposizioni prolungate, ossia saggi di esposizione di 24-48 ore, incubare le cellule aderenti in coltura con concentrazioni crescenti della sostanza in esame disciolta nel terreno di coltura (FSW o ASW) integrata con 2 mM di L-glutammina, 40 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina) a 15°C. Utilizzare almeno tre pozzetti per tre determinazioni di replica di ciascuna condizione sperimentale.
  2. Dopo l'incubazione, valutare la motilità cellulare seguendo il passaggio 8.

8. Valutazione della motilità cellulare mediante microscopia time-lapse

  1. Inserire la piastra multipozzetto contenente gli emociti viventi aderenti in un lettore multimodale.
  2. Valutare la motilità delle cellule viventi aderenti mediante imaging in tempo reale sulla piastra mediante microscopia time-lapse: acquisire immagini della stessa regione di interesse (ROI) (dimensione del ROI utilizzato: 720μm x 720μm) in ciascun pozzetto a una velocità di 1 immagine ogni 1 minuto per 10 minuti utilizzando il lettore multimodale con ingrandimento 20x e visualizzazione in campo chiaro a colori.
  3. Per una migliore visualizzazione degli emociti, colorare le cellule con il colorante vitale Neutral Red appena prima della microscopia time-lapse come segue:
    1. Rimuovere il terreno di incubazione da ciascun pozzetto.
    2. Aggiungere 100 μl di soluzione colorante di rosso neutro disciolto in soluzione fisiologica standard contenente la sostanza di interesse nei pozzetti della piastra contenente le cellule aderenti.
    3. Incubare le cellule a 15 °C per 15 minuti. Lavare via il colorante in eccesso.
    4. Aggiungere 100 μl della sostanza di interesse risolta in FSW o SPS. Visualizzare le cellule per la valutazione della motilità.
      NOTA: L'utilizzo di un lettore multimodale consente l'acquisizione simultanea di immagini da un elevato numero di pozzetti, consentendo la rilevazione simultanea della motilità di tutte le condizioni sperimentali e delle repliche contenute nel pozzetto. Il colorante rosso neutro viene trattenuto all'interno dei lisosomi, che appaiono come piccole macchie arancioni nel citoplasma, mentre il nucleo appare come un foro traslucido poiché il colorante vitale acidophilus non lo macchia. L'acquisizione dell'immagine è stata effettuata per 10 minuti a una temperatura ambiente di 20 °C.

9. Inseguimento delle celle e calcolo dei parametri velocimetrici

  1. Analizzare i frame della stessa regione di interesse acquisiti al microscopio time-lapse mediante l'immagine J per ciascun pozzetto.
  2. Salva le immagini in una cartella senza spazi nel nome. Le immagini possono essere in formato JPEG o PNG.
  3. Aprire ImageJ. Fare clic su File > Importa > sequenza di immagini.
  4. Eseguire il tracciamento delle celle su singole celle utilizzando il plug-in Tracciamento manuale di ImageJ. Le posizioni delle singole celle sono contrassegnate in immagini consecutive, consentendo il monitoraggio dei cambiamenti di posizione nel tempo.
  5. Analizzare almeno 40 celle per pozzetto, escluse le celle che fuoriescono dal campo registrato dall'analisi.
  6. Importa i set di dati dal plug-in ImageJ, "Tracciamento manuale", nel software Chemotaxis e Migration Tool disponibile gratuitamente.
  7. Quantificare i parametri velocimetrici come la velocità media, la distanza euclidea, la distanza migrata e la direttività utilizzando il software Chemotaxis and Migration Tool secondo le istruzioni dettagliate riportate nella guida per l'utente disponibile gratuitamente del software36o i passaggi forniti di seguito:
    1. Importa i set di dati dal plug-in ImageJ "Tracciamento manuale" nel software Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Selezionare il numero di sezioni desiderato (ad esempio, il numero di immagini utilizzate per il tracciamento).
    3. Calibrare il software impostando la dimensione dei pixel x/y e l'intervallo di tempo. La calibrazione x/y indica la lunghezza del bordo di un pixel in μm, mentre l'intervallo di tempo rappresenta la durata tra ogni fetta.
    4. Dopo aver regolato i valori e i parametri, fare clic su Applica impostazioni.
    5. Traccia le traiettorie ed esporta come immagine. Fare clic sul pulsante Valori misurati per visualizzare i valori misurati. Salvalo.
    6. Fare clic sul pulsante Statistiche e salvare la velocità e l'immediatezza della serie di tracce.
  8. Confrontare i parametri velocimetrici calcolati per le cellule di controllo con quelli degli emociti esposti alla sostanza in esame a diverse concentrazioni.
    NOTA: La distanza migrata (misurata in μm) si riferisce alla lunghezza del percorso di migrazione durante il periodo di osservazione (10 min). La distanza euclidea (misurata anche in μm) rappresenta la distanza in linea retta tra il punto iniziale e il punto finale della cella. La velocità media (espressa in μm min-1) è calcolata come il rapporto tra la distanza migrata e la durata dell'inseguimento delle celle per ciascuna cella. L'immediatezza è definita come il rapporto tra la distanza euclidea e la distanza accumulata per ciascuna traiettoria.

Risultati

Lo studio introduce un nuovo metodo in vitro per valutare in modo rapido e sensibile la tossicità e l'ecotossicità degli inquinanti, utilizzando la motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis. La Figura 1A-C mostra l'imaging time-lapse rappresentativo degli emociti dopo 30 minuti di attacco al fondo del pozzetto. Le cellule nella figura sono state colorate con rosso neutro appena prima della valutazione della motilità. I movimenti delle cellule sono stati monitorati utilizzando la microscopia ottica a una velocità di un'immagine al minuto per 10 minuti, con un ingrandimento inferiore a 20x, con un lettore multimodale. La Figura 1A-C mostra tre degli 11 fotogrammi acquisiti dalla stessa regione di interesse (ROI) a 0 min, 5 min e 10 min. Le stesse celle sono numerate in tutte e tre le figure per evidenziare il loro movimento e la numerazione rimane coerente tra le figure per illustrare chiaramente le loro traiettorie.

Le cellule mostrano movimenti unicellulari basati sull'attività dei lamellipodi e sui rapidi cambiamenti di forma. Le cellule sono state etichettate con il colorante vitale rosso neutro per migliorare la loro visualizzazione durante il tracciamento. Il rosso neutro è un colorante cationico anfifilico e debole che può facilmente permeare la membrana cellulare. Una volta all'interno delle cellule, il colorante rimane intrappolato nei lisosomi a causa della protonazione. Gli emociti delle cozze, in particolare i granulociti, mostrano un sistema lisosomiale ben sviluppato; pertanto, sono ben visualizzati mediante colorazione con rosso neutro, con il citoplasma ricco di diversi lisosomi marcati in rosso e il nucleo (non marcato dal colorante) che appare come un foro traslucido.

Attraverso l'applicazione del protocollo, si possono osservare due principali morfotipi di emociti secondo Udayan et al.23: (1) cellule diffuse con una forma di fagiolo bipolare e talvolta un contorno ameboide, e cellule più piccole a forma di stella rotonda (celle n = 3 e 10). In entrambi i tipi di cellule, il movimento era caratterizzato da continui cambiamenti di forma, con continua estensione e retrazione di pseudopodi e filopodi.

L'applicazione del protocollo consente di valutare con successo la motilità degli emociti costruendo grafici di traiettoria, come riportato in Figura 2, e calcolando i principali parametri velocimetrici come la velocità media e l'immediatezza. Questi corrispondevano rispettivamente a 6,46 ± 0,2 μm/min e 0,56 ± 0,02 (SEM medio ±) per le cellule diffuse e a 5,18 ± 0,34 μm/min e 0,37 ± 0,03 per le piccole cellule, rispettivamente in condizioni fisiologiche basali dopo 30 minuti di attacco al fondo del pozzetto. Pertanto, il protocollo consente la classificazione di diverse popolazioni di emociti in base a parametri velocimetrici.

Attraverso l'applicazione del protocollo, è possibile rilevare alterazioni del parametro velocimetrico della motilità degli emociti in seguito all'esposizione a farmaci o inquinanti. La Figura 3A-D mostra i risultati rappresentativi dell'esposizione in vitro degli emociti delle cozze al paracetamolo, che è uno dei farmaci rilasciati nell'ambiente (PiE) con la più alta concentrazione e le più alte frequenze di rilevamento nei fiumi di tutto il mondo31.

Secondo Udayan et al.23, nelle cellule di controllo, è stato osservato un aumento significativo della velocità con il tempo in entrambi i morfotipi cellulari, suggerendo l'attivazione degli emociti durante la coltura di 24 ore, presumibilmente evocativa della risposta infiammatoria indotta sperimentalmente dal ritiro e dalla placcatura nell'ambiente di coltura. Quando le cellule sono state esposte al farmaco, l'attivazione della motilità degli emociti è risultata significativamente ridotta nelle cellule diffuse (Figura 3A) dopo 24 ore, ma non nelle piccole cellule rotonde (Figura 3C), caratterizzate da una velocità basale media inferiore (valutata al tempo 0). Inoltre, il protocollo ha permesso di rilevare alterazioni della traiettoria cellulare in seguito all'esposizione al farmaco, come indicato dall'aumento significativo dell'immediatezza delle piccole cellule dopo 24 ore e dalla diminuzione dell'immediatezza dopo 1 ora di esposizione nelle cellule diffuse (Figura 3C, D).

figure-results-1
Figura 1: Imaging time-lapse rappresentativo di emociti neutri colorati in rosso dopo 30 minuti di attaccamento al fondo del pozzetto. Le cellule sono state colorate con il colorante vitale Neutral Red appena prima della valutazione della motilità. I movimenti delle cellule sono stati monitorati utilizzando la microscopia ottica al ritmo di un'immagine al minuto per 10 minuti con un ingrandimento inferiore a 20x. Per brevità, i pannelli A, B e C visualizzano tre degli 11 fotogrammi acquisiti dalla stessa area di interesse (ROI) a 0 min, 5 min e 10 min. Le stesse celle sono numerate in tutte e tre le figure per illustrare il loro movimento e le frecce indicano gli intervalli di tempo. Le barre della scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Grafico rappresentativo della traiettoria degli emociti di M. galloprovincialis . Le traiettorie mostrate provengono da un singolo pozzo. Vengono mostrate le traiettorie di 25 celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Effetto dell'esposizione al paracetamolo (24 ore) sulla velocità e l'immediatezza delle cellule di diffusione (A,B) e delle piccole cellule rotonde a forma di stella (C,D). I dati sono espressi come media ± SEM. La significatività statistica dei dati è stata valutata mediante ANOVA unidirezionale e post-test di Tukey. *P < 0,05 rispetto a controllo (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo descritto in questo lavoro rappresenta un nuovo metodo in vitro adatto per la valutazione rapida e sensibile della tossicità di farmaci e inquinanti basata sulla valutazione della motilità degli emociti di M. galloprovincialis e delle sue alterazioni. La motilità è un aspetto peculiare della funzione immunitaria di queste cellule 21,22,23,37,38, quindi qualsiasi alterazione della motilità cellulare può far presagire alterazioni della funzione immunitaria di queste cellule. La motilità è una funzione cellulare essenziale che integra diversi processi cellulari, come l'adesione cellulare, la segnalazione cellulare, l'attività del citoscheletro, la segnalazione intracellulare e la regolazione del volume cellulare, e richiede l'integrazione e il coordinamento di segnali biochimici e biomeccanici complessi 39,40,41. Ognuno di questi processi o i componenti di ciascun processo possono essere potenziali bersagli dell'azione tossica di farmaci e inquinanti. Pertanto, le alterazioni della motilità sia nella velocità cellulare che nella traiettoria rappresentano endpoint sensibili che integrano gli effetti su più bersagli cellulari.

Il protocollo è adatto per la valutazione in vitro degli effetti delle sostanze in esame sia in saggi a breve termine (della durata di 1-4 ore) che in saggi di esposizione prolungata, della durata di 24-48 ore, consentendo uno screening rapido di inquinanti e farmaci per potenziali effetti tossici. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, il metodo facilita l'analisi simultanea di più sostanze o concentrazioni variabili di una singola sostanza, risparmiando così tempo e reagenti. Inoltre, il protocollo può anche essere adattato per essere utilizzato con altre apparecchiature, come un microscopio a contrasto di fase o un microscopio a fluorescenza. In questo caso, le cellule potrebbero essere visualizzate senza alcuna colorazione o utilizzando coloranti vitali fluorescenti.

Sebbene il metodo offra alternative nuove e sensibili per lo screening tossicologico, alcune limitazioni del metodo devono essere prese in considerazione per applicazioni più ampie. Innanzitutto, un aspetto critico dell'applicazione del protocollo è la temperatura. È noto che gli emociti delle cozze sono sensibili agli sbalzi di temperatura. Gli effetti della temperatura sugli emociti sono complessi, con temperature alte e basse che influiscono negativamente sulle loro funzioni immunitarie 42,43,44. Come osservato durante la messa a punto del metodo, la fase critica riguardante l'effetto della temperatura sulla motilità cellulare è la fase preliminare di raccolta, adesione e coltivazione delle cellule sul substrato, che deve seguire la temperatura di acclimatazione degli organismi. Aumenti di temperatura di alcuni gradi durante questa prima fase al di sopra della temperatura di acclimatazione possono essere critici per acquisire la forma e la motilità della cellula diffusa. Pertanto, per la coltura degli emociti si consiglia una temperatura di 15 °C. L'acquisizione dell'immagine in time-lapse per la valutazione della motilità è stata eseguita per 10 minuti a una temperatura ambiente di 20 °C. Sulla base dell'osservazione preliminare durante l'impostazione del metodo, l'esposizione delle cellule in coltura per questo intervallo di tempo a 20 °C non altera significativamente la motilità degli emociti. Un'altra limitazione del metodo riguarda il tracciamento manuale degli emociti, che può introdurre una variabilità dipendente dall'utente e richiedere molto tempo e attenzione ai dettagli. Tuttavia, l'uso del colorante vitale rosso neutro migliora la visualizzazione delle cellule e, a sua volta, il tracciamento delle cellule attraverso la visualizzazione del sistema lisosomiale ben sviluppato. Il nucleo non è macchiato dal colorante e appare come un foro vuoto che è facilmente riconoscibile e facilmente puntabile durante il tracciamento manuale della cellula. Un altro limite del metodo è legato alla sua natura in vitro. Sebbene la condizione in vitro fornisca un ambiente controllato per la valutazione della motilità, potrebbe non replicare completamente le complesse interazioni e risposte che si verificano in vivo, in particolare all'interno delle risposte immunitarie dell'intero organismo.

Negli ultimi anni nuovi approcci e metodologie sono entrati nell'uso comune nelle scienze della vita, con l'obiettivo di migliorare i risultati e ridurre la dipendenza dalla sperimentazione animale45. Il protocollo offre un test sensibile alternativo per lo screening in vitro degli effetti e dei meccanismi d'azione di inquinanti e farmaci per lo screening rapido degli effetti tossicologici dei contaminanti chimici presenti, singolarmente o in miscele, in matrici ambientali. Si concentra su un nuovo endpoint, la motilità delle cellule del sistema immunitario, che può fornire una risposta integrata agli effetti tossicologici esercitati da farmaci e inquinanti su vari bersagli cellulari. In questo senso, amplia la gamma di test in vitro disponibili in letteratura, anche nell'ottica di un approccio integrato multi-assay per l'applicazione nel biomonitoraggio ambientale. Alcune caratteristiche del protocollo lo allineano con i criteri delle 3R (Replacement, Reduction, and Refinement), contribuendo alla riduzione dei test in vivo su animali vertebrati e allo sviluppo di saggi di tossicità da esposizione tossicologica ed ecotossicologica più etici ed efficienti. Queste caratteristiche includono la facile raccolta dell'emolinfa dalle cozze in modo poco invasivo, la piccola quantità di emolinfa necessaria per il test e l'uso di una piastra multipozzetto, che consente l'esposizione simultanea di più concentrazioni tossiche e si replica offrendo un notevole risparmio di tempo e reagenti.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal progetto "Dipartimento di Eccellenza" assegnato al DiSTeBA dal Ministero dell'Università e della Ricerca, CUP: F85D18000130001, e da NBFC (National Biodiversity Future Center) finanziato dall'Unione Europea NextGenerationEU, PNRR, progetto n. CN00000033. Si ringrazia inoltre l'infrastruttura BIOforIU presso il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali dell'Università del Salento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ m filtro (diametro 25 mm)ABLUO materiale da laboratorio
siringa ipodermica da 2,5 ml needdle 22GRays2522CM32da laboratorio
96 pozzetti in polistirene a fondo piatto trattato TC micropiastraCorning3916materiale da laboratorio
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KG
Software per strumenti di chemiotassi chimica e migrazione (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Apparecchiature: Lettore multimodale per imaging cellulare
Dimetilsolfossido (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tubo Fondo Conico Corning352196articoli da laboratorio
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394
Emocitometro chimico a lettura rapida 102BiosigmaBVS100materiale da laboratorio
HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etansolfonico)Merk (Sigma - Aldrich) Software H3375-500G
Chemical ImageJSoftwareNIH
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chimico
KClMerk104936Chimico
L-glutamminaMerk (Sigma - Aldrich) G7513Aminoacido essenziale per terreno di coltura cellulare
MgCl2· 6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) Microscopio chimicoM7506
Nikon Eclipse E600NikonAttrezzatura: Imaging cellulare 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chimico
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChimico
NaFFluka71519 500gChimico
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGMerk
rosso chimico neutro(Sigma - Aldrich) N4638-1GColorante a cellule vitali
Penicillina/StreptomicinaMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotici per colture cellulari
SrCl2· 6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521
Chimico Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Colorante cellulare
materiale

Riferimenti

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

Ristampe e permessi

Tag

Motilit degli emocitiEmociti di mitileSaggio di tossicitSaggio di ecotossicologiaTracciamento cellulareMicroscopia time lapseBiomonitoraggio ambientaleMigrazione cellulareRisposta immunitaria
Un test tossicologico ed ecotossicologico basato sulla motilità degli emociti delle cozze (Mytilus galloprovincialis)
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.