Forniamo un protocollo passo-passo per valutare la resistenza del pioppo ai patogeni del cancro del fusto utilizzando un metodo di inoculazione fogliare in vivo . Questo metodo è particolarmente adatto per la valutazione su larga scala della resistenza al cancro di Cytospora chrysosperma e Botryosphaeria dothidea nella progenie riproduttiva di pioppo in Cina.
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Articolo metodologico
Inoculazione fogliare in vivo: un metodo alternativo per valutare la resistenza alle malattie dei cloni ibridi nell'allevamento dei pioppi del cancro del fusto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cancro del fusto causato dal patogeno Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) e Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. Sono le due principali malattie forestali nelle piantagioni di pioppo in Cina, a volte che possono distruggere tutte le piantine di pioppo o danneggiare gravemente le foreste di pioppi mature. L'allevamento ibrido è il metodo più diretto ed efficiente per controllare e gestire le malattie degli alberi. Tuttavia, la valutazione della resistenza alle malattie o la selezione di cloni resistenti alle malattie sulla base dell'inoculazione in vitro dello stelo è inefficiente, dispendiosa in termini di tempo e costosa, limitando lo sviluppo dell'allevamento ibrido della malattia del cancro dello stelo di pioppo. In questo studio, abbiamo proposto un metodo alternativo per valutare la resistenza della malattia ai patogeni del cancro dello stelo attraverso l'inoculazione in vivo delle foglie. I materiali di prova utilizzati in questo metodo possono essere su alberelli di pioppo di 1 anno o sui rami annuali di pioppi perenni in serra o sul campo. Il passaggio critico di questo metodo alternativo è la selezione delle foglie inoculanti: le 5-7foglie appena maturate potrebbero essere le più adatte. Il secondo passaggio critico del metodo di inoculazione delle foglie consiste nel praticare ferite sulle foglie delle piante attraverso fori di ago, fornendo lesioni sufficienti per misurare la gravità della malattia. Per il numero adeguato di foglie prodotte nella fase iniziale dell'allevamento del pioppo, questa inoculazione fogliare in vivo contribuisce allo screening rapido, accurato e su larga scala dei cloni di pioppo resistenti alle malattie per i patogeni del cancro del fusto. Inoltre, questo metodo di inoculazione delle foglie servirà anche come metodo efficiente per lo screening dei patotipi del patogeno del cancro del fusto C. chrysosperma, B. dothidea o altri patogeni del cancro del fusto di pioppo.
Introduzione
Cancro del fusto di pioppo, causate principalmente da due patogeni necrotrofi, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. e Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not., minacciano gravemente lo sviluppo e la sopravvivenza delle piantagioni di pioppi nel nord-est, nel nord e nel nord-ovest (Three-north) della Cina. L'allevamento ibrido è il metodo più diretto ed efficiente per controllare e gestire le malattie degli alberi; Tuttavia, rispetto ai progressi nell'allevamento di cloni ibridi di pioppo ad alto rendimento, a crescita rapida o di altro tipo, la ricerca sull'allevamento a resistenza per il cancro del pioppo è scarsa. Sono stati riportati solo studi limitati sull'allevamento di ibridi resistenti alle malattie 1,2,3 e nessun clone ibrido resistente al cancro è stato coltivato nell'imboschimento dei pioppi.
La fase cruciale dell'ibridazione regolare è la selezione dei cloni basata sull'acquisizione del fenotipo della progenie ibrida. Tuttavia, l'acquisizione dell'acquisizione di fenotipi patologici (patotipi) è un processo che richiede tempo, laborioso, faticoso, costoso e che dipende dagli esperti. Per le piante legnose, è più impegnativo a causa della natura dispendiosa in termini di tempo, manodopera ed economia causata dal loro lungo ciclo di vita, dalla crescita lenta e dal corpo massiccio. Ad esempio, nel pioppo, lo screening della resistenza al cancro della progenie ibrida è stato condotto 5-7 anni dopo l'ibridazione attraverso metodi convenzionali di inoculazione in vitro dello stelo 1,2,3. Inoltre, limitati da questo metodo di screening resistente alle malattie a bassa efficienza e ad alto consumo, i ricercatori hanno riselezionato i cloni resistenti al cancro da un piccolo sottogruppo (ad esempio, i cloni di pioppo selezionati ad alto rendimento o a crescita rapida), non da tutta la progenie ibrida. Pertanto, utilizzando i normali metodi di inoculazione degli steli, non è sicuro di identificare i cloni resistenti autentici e non può rivelare la diversità resistente alle malattie della progenie riproduttiva, limitando così l'esplorazione di geni o moduli genici correlati alla resistenza alle malattie. Rispetto al rapido sviluppo dell'allevamento del pioppo a crescita rapida/ad alto rendimento, questi programmi di allevamento possono ottenere ibridi attraverso la selezione fenotipica o anche la selezione genomica nei primi due anni di allevamento4, l'allevamento resistente al cancro del pioppo si è sviluppato lentamente. Lo screening (o rilevamento) della progenie ibrida resistente alla malattia, o il metodo di inoculazione del patogeno, è diventato il passo cruciale per limitare la velocità nell'allevamento resistente al cancro del pioppo.
In questo protocollo, introduciamo un nuovo metodo di inoculazione per i patogeni del cancro del fusto di pioppo, il metodo di inoculazione delle foglie in vivo . Utilizzando questo metodo, possiamo testare in modo rapido ed efficiente la resistenza al cancro di dozzine di specie di pioppo (cultivar o cloni) entro 5-7 giorni. Il test di convalida ha dimostrato che l'inoculazione fogliare in vivo è coerente con l'inoculazione tradizionale in vitro dello stelo per il rilevamento della resistenza della malattia del cancro del fusto, suggerendo che il metodo di inoculazione delle foglie è adatto per lo screening della resistenza su larga scala delle malattie del cancro del pioppo, come l'intera selezione del genotipo della progenie di resistenza nell'allevamento della malattia del cancro del pioppo. Questo metodo risolve il problema patologico della selezione di una prole resistente nell'allevamento ibrido delle malattie del cancro del pioppo.
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Protocollo
1. Coltura fungina per l'agente patogeno del cancro
- Preparare il terreno di coltura per l'agar destrosio di patate (PDA; estrazione di patate 6,0 g, destrosio 20,0 g, agar 20,0 g) per ceppi fungini; sciogliere i materiali di cui sopra in acqua fino a 1000 mL, sciogliere completamente il terreno a 100 °C per 10 minuti.
- Versare il terreno PDA in provette da 25 mL (ciascuna contenente 15,0 mL); sterilizzare tutte le provette a 121,1 °C per 30 min. Versare il terreno nelle piastre di coltura (9,0 cm di diametro) e raffreddare le piastre a temperatura ambiente (RT).
- Tagliare il micelio del patogeno fungino, che viene coltivato in terreno PDA a 28 °C per 7 giorni, in cubetti quadrati di ~0,5 cm; inoculare i cubi fungini al centro delle piastre PDA (i lati del micelio sono rivolti verso il terreno).
- Coltivare i patogeni fungini in un incubatore termostatico (28 °C, al buio) per 7-10 giorni.
- Tagliare il terreno PDA con micelio fungino in cubetti quadrati (lunghezza lato 1,0-1,2 cm).
2. Preparazione dei materiali di pioppo
- Per i cloni di pioppo di 1 anno (coltivati > 3 mesi), selezionare le foglie appena maturate e completamente estese (sempre 5-7foglie , dalla sommità dell'alberello/rami) dei rami principali come materiali inoculati, assicurarsi che siano prive di parassiti, malattie e danni meccanici.
- Per i rami di 1 anno di cloni ibridi di pioppo perenne (coltivati > 2 mesi), selezionare le prime 5-7foglie dei rami selezionati come materiali inoculati. Assicurati che le foglie siano sane e abbiano la stessa condizione di luce (ombra o luce) tra tutti i cloni di pioppo testati.
3. Pretrattamento delle foglie di inoculazione
- Spruzzare le foglie di pioppo con acqua pulita e, dopo l'asciugatura, pulire le foglie selezionate con alcool al 75% 1 ora o 1 giorno prima delle manipolazioni di inoculazione.
4. Inoculazione in vivo delle foglie
- Per le foglie piccole (larghezza fogliare < 8,0 cm), inoculare due cubi quadrati di micelio fungino e cubi PDA (o agar d'acqua, WA) (1,0-1,2 cm di lunghezza laterale) sulla superficie superiore delle 5-7 foglie superiori di cloni di pioppo; Il micelio è rivolto verso le foglie. Assicurarsi che i siti di inoculazione si trovino al centro delle mezze foglie, a ~1-2 cm di distanza dalle nervature centrali, evitando di oscurare le nervature secondarie. Ogni clone inocula 12 siti su 6 foglie (10 siti per il micelio e 2 siti per l'inoculazione del PDA).
- Per foglie grandi (larghezza fogliare ≥ 8,0 cm), inoculare quattro cubi quadrati di micelio fungino e cubi PDA (o WA) sulle 5-7 foglie di pioppo superiori. Ogni clone inocula 12 siti in 3 foglie (10 siti per il micelio e 2 siti per l'inoculazione del PDA).
- Avvolgere le foglie inoculate con del nastro adesivo trasparente (6,0 cm di larghezza) e premerle delicatamente per renderle adesive alle foglie, impedendo il movimento e la perdita d'acqua dei cubi di micelio (o PDA) durante l'esperimento.
- Forare le foglie e i cubi di micelio (o PDA) in cinque siti fino a quando gli aghi penetrano nei cubi dalla superficie superiore a quella inferiore delle foglie di pioppo. Un sito si trova al centro e gli altri quattro giacciono a 1-2 mm vicino ai quattro vertici dei cubi.
NOTA: Si consiglia una collaborazione di team di 3 persone per la manipolazione dell'inoculazione fungina. La manipolazione dell'inoculazione di una popolazione ibrida di pioppo (>100 genotipi) può essere condotta in 4 ore attraverso il lavoro di squadra. Le manipolazioni del piercing sono state condotte dopo che tutte le foglie testate sono state inoculate e avvolte per alleviare l'impatto dei diversi tempi di piercing sulla gravità della malattia. - Ispezionare lo spostamento della posizione e la perdita d'acqua degli inoculanti di micelio e osservare l'insorgenza di lesioni necrotiche attorno ai siti della ferita perforata dalla superficie inferiore delle foglie fino al 3° giorno di inoculazione.
- Entro 3 giorni dall'inoculazione, osservare lo spostamento della posizione e la perdita d'acqua dei cubetti di micelio. Definire e contrassegnare i cubi di micelio spostati ed essiccati come inoculazioni inefficaci e scartarli dall'identificazione finale dei patotipi definendo gli altri cubi come inoculazioni efficaci.
NOTA: Questo protocollo definisce i cloni di pioppo testati con più di cinque cubi di inoculazione efficaci come cloni inoculati non validi; Pertanto, ogni clone di pioppo ha fornito almeno 30 siti di inoculazione efficaci, che si svilupperanno in 30 punti necrotici indipendenti.
- Entro 3 giorni dall'inoculazione, osservare lo spostamento della posizione e la perdita d'acqua dei cubetti di micelio. Definire e contrassegnare i cubi di micelio spostati ed essiccati come inoculazioni inefficaci e scartarli dall'identificazione finale dei patotipi definendo gli altri cubi come inoculazioni efficaci.
- Raccogliere tutte le foglie inoculate alla fine dell'esperimento (~5-7 giorni dopo l'inoculazione), riportarle in laboratorio in sacchetti di plastica per campioni e conservarle a 4 °C.
5. Acquisizione del patotipo fogliare e valutazione della resistenza del pioppo alle oncologie del fusto in laboratorio
- Rimuovere con cura i nastri adesivi trasparenti e gli inoculanti di micelio (o PDA) dalle foglie.
- Osservare e identificare i patotipi fogliari di ciascun clone di pioppo, compresa la forma e il colore delle macchie necrotiche, e può includere la struttura fungina simile alle ife, i picnidi e i conidi che si sono formati sulla superficie delle foglie intorno ai siti di perforazione.
- Fotografa le foglie (con un righello aggiuntivo) con una fotocamera o scansiona le foglie (con un righello aggiuntivo) utilizzando uno scanner per ottenere immagini con una risoluzione superiore a 300 dpi, quindi salva le immagini in formato JPEG, TIFF o PNG.
6. Identificazione e analisi statistica dell'insorgenza della malattia
- Apri le immagini delle foglie malate nel software ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
- Imposta la scala in base al righello nelle immagini delle foglie.
- Identificare e misurare le lesioni con lo strumento a bacchetta (tracciamento).
- Registra ed esporta i valori dell'area come foglio di calcolo dopo aver misurato le aree di tutti i punti necrotici.
- Stabilire i criteri per la determinazione della malattia:
- Se l'area della lesione attorno ai cubi di micelio coperti dai siti di perforazione è significativamente più grande di quella coperta dai cubi PDA, allora definisci questi siti come siti di malattia.
- Se le caratteristiche morfologiche dei cubi di micelio ricoperti di fori sono cambiate significativamente rispetto ai siti ricoperti di PDA, compresi i colori della lesione, che producono strutture simili alle ife, picnidi e conidi, definiscono il sito anche come sito della malattia.
- Calcola le aree medie delle macchie di lesione PDA efficaci di ciascun clone ibrido di pioppo. In base alle aree medie, dividere tutte le macchie di micelio inoculate di un clone di pioppo in due categorie: ad insorgenza e non insorgenza. Quindi, calcolare il tasso di incidenza della malattia del clone di pioppo testato (Formula 1: Tasso di incidenza della malattia (%) = Numero di siti di puntura malati/Numero totale di siti di puntura efficienti × 100).
- Calcola l'area media delle macchie malate nelle foglie (n = 50). In base ai valori delle aree medie di macchie malate delle foglie in tutti i cloni di pioppo testati, stabilire uno standard di classificazione della malattia a 5 livelli.
- Calcolare l'indice di malattia di ciascun clone di pioppo (Formula 2) in base allo standard di classificazione della malattia di cui sopra (Formula 2: Indice di malattia = ∑(Numero di siti di puntura per livello × Valori di gravità a tutti i livelli)/(Valore del livello di gravità più alto × Numero totale di siti di puntura efficienti) × 100).
- Verificare la normale distribuzione del numero di cloni di pioppo attraverso diversi livelli di resistenza utilizzando il test di Shapiro-Wilk utilizzando qualsiasi software di analisi dei dati appropriato.
- In base all'indice di malattia, identificare tutti i cloni di pioppo testati in cinque (o sette) gruppi: resistenza molto alta (VHR), alta resistenza (HR), resistenza (R), nessuna resistenza e nessuna suscettibilità (NRNS), suscettibilità (S), alta suscettibilità (HS) e suscettibilità molto alta (VHS) gruppo5.
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Risultati
In questo protocollo, il flusso di lavoro schematico è stato condotto in 48 cloni ibridi di pioppo infettati dal patogeno del cancro del fusto C. chrysosperma (Figura 1). I cloni ibridi di pioppo fanno parte della progenie di ibridazione di P. deltoides, coltivata nel vivaio presso l'Accademia Forestale Cinese (CAF), Pechino.
L'agente patogeno del cancro del fusto C. chrysosperma isolato CZC è un tipico ceppo fungino (con patogenicità me...
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Discussione
Questo protocollo fornisce un metodo di inoculazione rapido ed efficiente per i patogeni resistenti al cancro del pioppo, adatto per i campi di ricerca che richiedono lo screening della resistenza alle malattie su larga scala, come l'allevamento ibrido della resistenza al cancro del pioppo e lo screening della patogenicità dei patogeni del cancro del fusto.
Il primo punto chiave del metodo è valutare la resistenza alle malattie mediante inoculazione di foglie...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata congiuntamente dall'Istituto Scientifico Centrale di Interesse Pubblico, dal Fondo di Ricerca Base dello Stato, dal Laboratorio Chiave di Genetica e Allevamento degli Alberi (numero di sovvenzione CAFYBB2020ZY001-2) e dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (numero di sovvenzione 32171776) a Jiaping Zhao.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Foglio di alluminio | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. chrysosperma isolato | China Forestry Culture Collection Center | CFCC86775 | Separazione e conservazione da parte del nostro laboratorio |
| Cytospora chrysosperma | Laboratorio di fisiologia vegetale, Istituto di nuova tecnologia, Accademia cinese di silvicoltura | Numero di accesso NCBI: MK994101 per rRNA-ITS e MN025273 per EF1&alfa; gene Numero CGMCC:40575 | Separazione e conservazione da parte del nostro laboratorio |
| Epson Perfection V370 Foto | Epson | Scanner V370 | ; Scansiona le foglie nell'immagine |
| PDA (Potato Dextrose Agar) | Solarbio | P8931 | Fornire nutrimento per la crescita fungina |
| PE film | plastico Per fissare i funghi sulle foglie | ||
| Populus alba var. Pyramidalis | Laboratorio di fisiologia vegetale, Istituto di Nuova tecnologia forestale, Accademia cinese di silvicoltura | Coltivato dal nostro laboratorio | |
| SPSS | IBM | Software di analisi dei dati | |
| Incubatore termostatico | Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | Fornire un ambiente per la crescita fungina |
| Robusta fotocamera TG-6 | OLYMPUS | Per scattare foto di foglie malate |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
