Le proteinasi sono vitali per la patogenesi batterica, consentendo l'invasione e l'evasione immunitaria. L'estrazione in un'unica fase delle proteine citoplasmatiche e di membrana dei batteri nella loro forma attiva è straziante. Questo articolo video mostra l'estrazione di intere proteine cellulari di Leptospira per l'analisi zimografica per rilevare e caratterizzare le gelatinasi.
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Articolo metodologico
Estrazione in un'unica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteinasi dei batteri patogeni contribuiscono all'invasione e alla patogenesi degradando attivamente i componenti della matrice extracellulare (ECM) dell'ospite e le barriere cellulari, modificando la risposta immunitaria dell'ospite e degradando il sistema di difesa dell'ospite. Ciò rende le proteinasi una delle molecole più virulente e la loro identificazione e caratterizzazione sono essenziali per la prevenzione e il controllo della malattia. Molti batteri possiedono anche proteinasi legate alla membrana esterna. L'isolamento e la caratterizzazione delle proteine della membrana esterna nelle loro forme attive presentano sfide significative a causa della loro localizzazione all'interno della membrana esterna. In questo studio, dimostriamo un metodo in un'unica fase per estrarre da Leptospira gelatinasi sia citoplasmatiche che associate alla membrana esterna e dimostriamo la loro attività enzimatica utilizzando la zimografia. In questo metodo, utilizziamo il desossicolato di sodio per distruggere la membrana cellulare e rilasciare le proteine legate e l'acido 6-aminocaproico per solubilizzare la proteina di membrana rilasciata nella sua forma nativa. Inoltre, mostriamo un'analisi zimografica delle gelatinasi leptospirali. Questo approccio fornisce un quadro versatile per isolare, purificare e caratterizzare metalloproteasi, collagenasi e gelatinasi da vari patogeni batterici.
Introduzione
La maggior parte dei patogeni batterici deve incontrare la matrice extracellulare (ECM) dell'ospite durante l'invasione e la disseminazione agli organi bersaglio durante la patogenesi. Il collagene costituisce il componente principale della MEC dei tessuti animali1. Le gelatinasi sono un gruppo di proteasi che agiscono sul collagene e sulla sua forma idrolizzata, la gelatina. La degradazione della ECM è eseguita principalmente da un gruppo di proteasi, che comprende collagenasi e gelatinasi 2,3. I patogeni batterici utilizzano collagenasi e gelatinasi per rimodellare o abbattere la MEC ospite per la loro comodità nell'invasione e nella patogenesi 4,5. Gli enzimi batterici che degradano la MEC sono potenziali candidati per il targeting di vaccini e farmaci5.
Le proteasi batteriche si trovano in forme secretorie e legate alla membrana 6,7,8,9. Molti metodi per l'estrazione degli enzimi cellulari sono inefficaci per isolare le gelatinasi batteriche e le collagenasi legate alla membrana, poiché queste procedure potrebbero non preservare in modo efficiente la forma nativa delle proteine legate alla membrana. Allo stesso modo, esistono metodi specifici per la membrana che estraggono solo proteasi e gelatinasi legate alla membrana. I metodi convenzionali di estrazione delle proteine totali, comprese le proteine di membrana, spesso coinvolgono detergenti e ioni caotropici, che possono influire sull'attività enzimatica. Una procedura di estrazione che mantiene l'attività e la solubilità dell'enzima è essenziale per la separazione elettroforetica e consente lo sviluppo della zimografia per rilevare l'attività della proteasi.
Il desossicolato di sodio, un detergente ionico in grado di lisare le cellule distruggendo la membrana cellulare, consente il rilascio del contenuto cellulare e delle proteine di membrana. L'acido 6-amminocaproico può solubilizzare la proteina di membrana rilasciata nella sua forma nativa. La solubilizzazione con acido 6-aminocaproico ha il vantaggio di non influenzare l'elettroforesi. Qui, dimostriamo l'estrazione di proteinasi batteriche cellulari e legate alla membrana utilizzando il desossicolato di sodio e l'acido 6-aminocaproico, stabilizzandole nella loro forma solubile nativa 10,11,12. Questo metodo solubilizza efficacemente le proteine della cellula e della membrana che possono essere utilizzate direttamente senza interferire con l'elettroforesi 13,14. Varie caratterizzazioni enzimatiche possono essere eseguite modificando gli inibitori della proteasi e gli ioni metallici utilizzati nel tampone di attivazione, a seconda dell'applicazione.
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Protocollo
1. Estrazione di gelatinasi batteriche
NOTA: Vedere la Tabella 1 per la preparazione di reagenti e materiali.
- Far crescere l'organismo in un terreno Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) contenente 10 mg/mL di albumina sierica bovina a 30 °C. Prelevare 10 mL di coltura di Leptospira nella fase logaritmica intermedia della crescita contenente 3,5 × 108 cellule/mL per le proteinasidi estrazione 13,14. Utilizzare il conteggio microscopico diretto con una camera di conteggio Petroff-Hausser al microscopio a campo scuro per osservare la fase di crescita a metà logaritmica.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6.000 × g per 10 minuti e gettare il surnatante in un contenitore per la decontaminazione mediante sterilizzazione in autoclave a 121 °C per 60 minuti.
- Trasferire il pellet sospendendolo in 1 mL di tampone di lavaggio in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 6.000 × g per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio.
- Estrarre la proteina dal pellet aggiungendo 100 μL di tampone di estrazione per un pellet di Leptospira da 10 mL di coltura e vorticare per 5 minuti. Continuare l'estrazione incubando a 4 °C per 1 ora. Raccogliere la proteina estratta mediante centrifugazione a 15.000 × g a 4 °C per 10 minuti e gettare il pellet in un contenitore per la decontaminazione mediante sterilizzazione in autoclave a 121 °C per 60 minuti.
- Utilizzare l'estratto proteico direttamente per la zimografia aggiungendo un volume uguale di tampone campione 2x.
- Utilizzare il test di stima di Bradford per determinare la concentrazione proteica.
- Se la concentrazione proteica è bassa, precipitarla con acetone mescolando la proteina con un volume 4x di acetone per la precipitazione e incubarla per una notte a -20 °C. Il giorno successivo, centrifugare il campione a 10.000 × g per 10 minuti, asciugare all'aria il pellet risultante e risospenderlo in PBS o scioglierlo nel tampone desiderato e conservarlo a -20 °C per un massimo di 1 mese. Utilizzare la liofilizzazione per lo stoccaggio o il trasporto a lungo termine.
NOTA: A causa delle proteasi attive nell'estratto e dell'assenza di inibitori della proteasi, le proteine possono degradarsi nel campione.
2. Zimografia delle gelatinasi
- Preparazione del gel SDS PAGE copolimerizzato in gelatina
- Gel risolutivo
- Preparare la miscela di gel risolutivo aggiungendo i componenti nelle quantità necessarie per fondere il gel. A 3,86 mL di acqua in un becher da 50 mL, aggiungere 2,5 mL di Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL dalla soluzione madre di gelatina al 10%, 3,34 mL di soluzione di acrilammide-bis acrilammide (ABA), 0,1 mL di SDS al 10%, 0,006 mL di TEMED e 0,1 mL di persolfato di ammonio al 10% e mescolare bene senza formazione di schiuma e bolle. Il sistema menzionato (Piastre di vetro normali; 18 x 8 cm) richiede 10 ml di miscela di gel risolutiva.
NOTA: Se la gelatina proviene da un'aliquota congelata, scongelarla fino a quando non si scioglie per eliminare la soluzione senza grumi. Aggiungere il persolfato di ammonio appena prima della colata perché la polimerizzazione inizierà immediatamente dopo l'aggiunta del persolfato di ammonio. - Versare la miscela di gel risolutore nella camera di colata fino a ~3-5 mm sotto la marcatura per il fondo dei pozzetti. Evitare le bolle d'aria.
- Versare lentamente un po' d'acqua fino ad ottenere uno strato uniforme di 1 mm sulla parte superiore del gel e rimuovere le bolle. Lasciare agire il gel per 1 ora.
NOTA: La formazione di gel può essere confermata cercando una separazione di fase tra lo strato d'acqua e il gel; Il gel non può essere versato anche se la cassetta del gel è inclinata.
- Preparare la miscela di gel risolutivo aggiungendo i componenti nelle quantità necessarie per fondere il gel. A 3,86 mL di acqua in un becher da 50 mL, aggiungere 2,5 mL di Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL dalla soluzione madre di gelatina al 10%, 3,34 mL di soluzione di acrilammide-bis acrilammide (ABA), 0,1 mL di SDS al 10%, 0,006 mL di TEMED e 0,1 mL di persolfato di ammonio al 10% e mescolare bene senza formazione di schiuma e bolle. Il sistema menzionato (Piastre di vetro normali; 18 x 8 cm) richiede 10 ml di miscela di gel risolutiva.
- Gel impilabile
- Preparare il gel da impilare mescolando i seguenti componenti. A 1,84 mL di acqua in un becher da 10 mL, aggiungere 2,5 mL di Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 mL di ABA, 0,03 mL di 10% SDS e 0,006 mL di TEMED. Il sistema 8 x 10 cm di 1 mm di spessore richiede 3 mL di miscela di gel risolutiva.
- Dalla cassetta del gel, decantare l'acqua formata nella parte superiore del gel inclinando la configurazione del gel su un lato e tamponando l'acqua raccolta dall'angolo utilizzando una striscia stretta di carta da filtro.
- Aggiungere 0,03 mL di APS al 10% alla miscela menzionata al punto 2.1.2.1 e mescolare senza formare bolle.
- Versare il gel di impilamento sul gel risolutivo e posizionare immediatamente il pettine in posizione senza formare bolle d'aria sotto i denti del pettine, lasciando uno spessore di 3-5 mm di gel di impilamento tra il gel risolutivo e la parte inferiore dei denti del pettine. Attendere almeno 3 ore per la completa polimerizzazione e reticolazione della gelatina.
- Estrarre il distanziatore inferiore e fissare il gel sull'apparecchio per elettroforesi.
- Posizionare lentamente il gel nel serbatoio contenente 1x tampone per elettrodi, assicurandosi che non vi sia aria intrappolata nella parte inferiore del gel.
- Gel risolutivo
- Preparazione del campione
- Aggiungere un volume uguale di tampone campione all'estratto e incubare a 37 °C per 30 minuti per consentire alla SDS di legarsi alla proteina. Utilizzare un campione contenente 2 μL di siero umano con un volume uguale di tampone campione come controllo positivo.
- Caricamento del campione
- Caricare con cautela il campione nei pozzetti con una pipetta a punta stretta o una siringa Hamilton (0,5-1 mL). Aggiungere gradualmente il tampone dell'elettrodo per riempire le parti rimanenti dei pozzetti, la parte superiore del gel e il serbatoio superiore dell'unità di elettroforesi senza disturbare i campioni caricati.
NOTA: La siringa Hamilton deve essere lavata accuratamente tra i campioni per evitare la contaminazione incrociata.
- Caricare con cautela il campione nei pozzetti con una pipetta a punta stretta o una siringa Hamilton (0,5-1 mL). Aggiungere gradualmente il tampone dell'elettrodo per riempire le parti rimanenti dei pozzetti, la parte superiore del gel e il serbatoio superiore dell'unità di elettroforesi senza disturbare i campioni caricati.
- Esecuzione dell'elettroforesi
- Avviare l'elettroforesi a 6 mA per gel e continuare fino a quando il fronte del colorante non entra nel gel risolutivo. Quindi, aumentare la corrente a 12 mA per gel e continuare fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge 1 cm sopra il fondo del gel.
NOTA: Il tempo di esecuzione può variare a seconda della concentrazione di ABA utilizzata e delle dimensioni della proteina bersaglio.
- Avviare l'elettroforesi a 6 mA per gel e continuare fino a quando il fronte del colorante non entra nel gel risolutivo. Quindi, aumentare la corrente a 12 mA per gel e continuare fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge 1 cm sopra il fondo del gel.
- Marcatura dell'orientamento delle bande della norma
- Dopo aver completato l'elettroforesi, smontare con cura le lastre di vetro utilizzando uno strumento di separazione delle piastre o una spatola di plastica e contrassegnare l'orientamento del caricamento del campione tagliando l'angolo inferiore destro del gel e contrassegnare le bande di marcatura prestate praticando dei fori nelle vicinanze o scansionando il gel.
- Rinaturazione degli enzimi risolti
- Immergere il gel in una soluzione rinaturalizzante contenente Triton X-100 in una vaschetta per gel e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente senza agitare.
NOTA: Triton X-100 rinatura le proteine, poiché il gel dello zimogramma contenente proteine risolte può essere denaturato e perdere attività in presenza di SDS.
- Immergere il gel in una soluzione rinaturalizzante contenente Triton X-100 in una vaschetta per gel e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente senza agitare.
- Incubazione per l'attività della proteasi
- Sostituire la soluzione rigenerante con un tampone di attivazione che immerga completamente il gel e incubare a 37 °C per 18 ore in un incubatore.
NOTA: Modificare il tampone di attivazione aggiungendo inibitori o attivatori delle proteinasi di interesse per caratterizzare l'attività della proteinasi secondo necessità.
- Sostituire la soluzione rigenerante con un tampone di attivazione che immerga completamente il gel e incubare a 37 °C per 18 ore in un incubatore.
- Colorazione dello zimogramma
- Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di attivazione e sciacquare brevemente il gel con acqua per 1 minuto per rimuovere eventuali residui di Triton X-100 e per evitare la formazione di schiuma durante l'agitazione.
- Aggiungere la soluzione colorante al vassoio, assicurandosi che il gel sia completamente sommerso. Agitare delicatamente il gel a bassa velocità per evitare danni. Continua a colorare fino a quando il gel non diventa completamente blu.
- Rimuovere la macchia in eccesso dalla superficie del gel risciacquandola con acqua per 1 minuto. Aggiungere la soluzione decolorante nella vaschetta e agitare delicatamente. Sostituire più volte la soluzione decolorante con una soluzione fresca fino a ottenere il contrasto di banda desiderato sullo sfondo blu.
NOTA: Durante l'esecuzione della decolorazione, monitorare continuamente il gel per assicurarsi che non si decolori completamente, consentendo l'osservazione e la registrazione delle bande proteolitiche. - Scansiona il gel in un sistema di documentazione su gel o in uno scanner di documenti e determina la massa molecolare delle bande proteiche confrontandole con gli standard proteici.
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Risultati
Il risultato mostra lo zimogramma delle proteine leptospirali e delle gelatinasi del siero umano. I risultati, mostrati nella Figura 1, rappresentano le proteasi come bande bianche chiare su sfondo blu. Le bande rappresentano le aree in cui la gelatina copolimerizzata è degradata e quindi non colorata, mentre altre aree dell'intero gel sono colorate di blu a causa della presenza di gelatina. Inoltre, mostra che, anche se la gelatina è anche una proteina, non viene eluita nell'elettroforesi a...
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Discussione
Durante la preparazione del gel di acrilammide, la gelatina copolimerizza con la matrice polimerica di acrilammide. Di conseguenza, la gelatina co-polimerizzata rimane immobilizzata all'interno del gel e non migra durante l'elettroforesi, anche se si tratta di una proteina. Dopo l'elettroforesi, le proteine native estratte utilizzando il desossicolato e il tampone dell'acido 6-aminocaproico si separano in base alla loro massa e carica. Dopo aver rimosso la SDS, queste proteine si rinatur...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori esprimono la loro gratitudine alla Divisione SERB, Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Nuova Delhi, per il loro sostegno attraverso sovvenzioni No.SR/S0/HS/0108/2012, a MGM
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| acido 6-amminocaproico | Merck | Codice: A2504 | |
| Acido acetico | Sigma | 695092 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Acrilamide | Sigma | A-3553 | |
| Persolfato di ammonio | Sigma | A-3678 | |
| Bis Acrilammide | Sigma | Codice: M7279 | |
| Frazione V dell'albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A-8022 | |
| Blu di bromofenolo | Sigma | B-8026 | |
| CaCl2 | Merck | Visualizzazione del materiale C4901 | |
| Coomassie blu brillante | Sigma | 1.12553 | |
| Desossicolato | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) medio, Difco | Difco | 279410 | |
| Gelatina | Merck | G9382 | |
| Glicerolo | Merck | G5516 | |
| Glicina G8790 | Sigma | G-8898 | |
| Leptospira interrogans sierovariante Copenhageni ceppo Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , conservato nel biorepository dell'ICMR-RMRC Portblair | Conservato nel biorepository dell'ICMR-RMRC Port Blair | Temperatura di crescita ottimale 30 gradi C | |
| Cloruro di magnesio M8266 | Sigma | Codice: M8266 | |
| Metanolo | Sigma | 17995-7 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma | P4417 | |
| Strumento di separazione delle piastre | Meraviglia Wedgle | ||
| Rotore | Termoscientifico | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Sigma | L-4396 | |
| TEMED | Sigma | T-9281 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Base Trizma (TRIS) | Sigma | Codice: T6066 |
Riferimenti
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