Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.
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Articolo metodologico
Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema CRISPR-Cas9 per l'editing del genoma ha rivoluzionato gli studi sulla funzione genica nelle cellule di mammifero, comprese le cellule staminali. Tuttavia, l'applicazione pratica di questa tecnica, in particolare nelle cellule staminali pluripotenti, presenta alcune sfide, come l'essere dispendiosa in termini di tempo e lavoro e la bassa efficienza di editing. Qui, descriviamo la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR in una linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) che esprime stabilmente sgRNA per il gene L2HGDH, utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente e stabile. Gli sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH sono stati sintetizzati chimicamente e clonati nel vettore lentiCRISPR v2-puro, che combina l'espressione costitutiva degli sgRNA con Cas9 in un sistema a vettore singolo altamente efficiente per ottenere titoli lentivirali più elevati per l'infezione da hESC e una selezione stabile utilizzando la puromicina. Le cellule selezionate con puromicina sono state ulteriormente espanse e sono stati ottenuti cloni di singole cellule utilizzando il metodo di diluizione limitata. I singoli cloni sono stati espansi e sono stati ottenuti diversi cloni knockout omozigoti per il gene L2HGDH, come confermato da una riduzione del 100% dell'espressione di L2HGDH utilizzando l'analisi Western blot. Inoltre, utilizzando MSBSP-PCR, il sito di mutazione CRISPR è stato mappato a monte della sequenza di riconoscimento PAM di Cas9 nei cloni omozigoti selezionati. È stato eseguito il sequenziamento Sanger per analizzare le esatte inserzioni/delezioni ed è stata condotta la caratterizzazione funzionale dei cloni. Questo metodo ha prodotto una percentuale significativamente più alta di delezioni omozigoti rispetto ai metodi di somministrazione genica non virale precedentemente riportati. Sebbene questo rapporto si concentri sul gene L2HGDH, questo approccio robusto ed economico può essere utilizzato per creare knockout omozigoti per altri geni in cellule staminali pluripotenti per studi sulla funzione genica.
Introduzione
Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono cellule staminali con il potenziale di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Queste cellule fungono da strumenti preziosi per lo studio dello sviluppo umano, nonché per la comprensione dei meccanismi alla base di varie malattie, offrendo così un'enorme promessa per la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci. Tali studi implicano l'indagine su come geni specifici contribuiscono allo sviluppo, al funzionamento e alla regolazione degli organismi 1,2
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Protocollo
I dettagli delle sequenze geniche, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Progettazione di RNA guida singola (sgRNA), clonazione e produzione di vettori lentivirali
NOTA: Vengono utilizzate due diverse sequenze di sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH , entrambe adattate da Qiu et al.6con i siti PAM di AGG e TGG rispettivamente per le sequenze 1 e 2. Entrambi gli sgRNA erano lunghi 20 bp e le estremità sono state modificate per a....
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Risultati
Clonaggio di sgRNA L2HGDH in lentiCRISPRv2 puro
Il vettore puro lentiCRISPRv2 è stato ottenuto commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e digerito con BsmB1, che ha portato al rilascio di un frammento di stuffer da 1,8 Kb. Come mostrato nella Figura 2A, è stata osservata una digestione completa del vettore. Per ogni costrutto, sei cloni sono stati sottoposti a screening per verificare la presenza o l'assenza di inserto utilizzando una sequenza di sgRN.......
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Discussione
Questo studio ha standardizzato un metodo che consente delezioni geniche altamente efficienti ed economiche nelle hESC attraverso la tecnologia CRISPR-Cas9. Questo metodo ha raggiunto con successo la delezione omozigote del gene L2HGDH nelle hESC entro 3-4 settimane, a partire dall'infezione da hESC fino alla selezione clonale e alla propagazione di singole cellule (Tabella 1). Sebbene le manipolazioni geniche mediate da CRISPR-Cas9 possano essere ottenute mediante trasf.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di ricerca dell'Università degli Emirati Arabi Uniti (UAEU) - sovvenzione #12M105, sovvenzione #12R167 (Zayed Center for Health Sciences), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)) e ASPIRE, il pilastro della gestione del programma tecnologico dell'Advanced Technology Research Council (ATRC) di Abu Dhabi, tramite l'ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (ASPIREPMRIAD) con il numero di sovvenzione VRI-20-10.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-MERCAPTOETANOLO | Invitrogen | 31350010 | |
| 38,5 mL, sterile + certificato libero Open-Top Provette ultratrasparenti | Coulter Beckman | C14292 | |
| Accutase | Tecnologie delle cellule staminali | 7920 | |
| bFGF Invitrogen umano ricombinante | PHG0261 | ||
| Corpo monoclonale di coniglio | Abclonale | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel Matrice di membrana basale, senza LDEV | Corning | 354234 | |
| Ciclopamina | Tecnologie delle cellule staminali | 72074 | |
| Terreni DMEM | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM MIX DI NUTRIENTI F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS senza: Ca e Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Siero fetale | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Anticorpo mAb di coniglio | CST | 2118S | |
| Reagente di dissociazione cellulare delicata | Tecnologie delle cellule staminali | 7174 | |
| HyClone Aminoacidi non essenziali (NEAA) 100x Soluzione | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Coniglio mAb | CST | 9129 | |
| KnockOut Siero di ricambio | Invitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMMINA, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH Anticorpo policlonale | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 terreno completo | Tecnologie delle cellule staminali | 85850 | |
| Nanog Antibody | CST | 3580 | |
| NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Integratore 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Integratore 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 Anticorpo | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Coniglio mAb | CST | 60433 | |
| PENICILLINA STREPTOMICINA SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Reagente per l'infezione da polibrene | Sigma | TR1003- G | |
| Polietilenimmina, ramificata | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromicina | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR Kit per titoli Lentivirus Abm | LV900 | ||
| Inibitore della roccia Y-27632 dicloridrato | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 Anticorpo | CST | 2748 | |
| Saccarosio | Sigma | 57-50-1 | |
| TRIPSINA .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Kit di purificazione del DNA genomico | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Riferimenti
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., ....
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Ristampe e permessi
