Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.
Articolo metodologico
Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema CRISPR-Cas9 per l'editing del genoma ha rivoluzionato gli studi sulla funzione genica nelle cellule di mammifero, comprese le cellule staminali. Tuttavia, l'applicazione pratica di questa tecnica, in particolare nelle cellule staminali pluripotenti, presenta alcune sfide, come l'essere dispendiosa in termini di tempo e lavoro e la bassa efficienza di editing. Qui, descriviamo la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR in una linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) che esprime stabilmente sgRNA per il gene L2HGDH, utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente e stabile. Gli sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH sono stati sintetizzati chimicamente e clonati nel vettore lentiCRISPR v2-puro, che combina l'espressione costitutiva degli sgRNA con Cas9 in un sistema a vettore singolo altamente efficiente per ottenere titoli lentivirali più elevati per l'infezione da hESC e una selezione stabile utilizzando la puromicina. Le cellule selezionate con puromicina sono state ulteriormente espanse e sono stati ottenuti cloni di singole cellule utilizzando il metodo di diluizione limitata. I singoli cloni sono stati espansi e sono stati ottenuti diversi cloni knockout omozigoti per il gene L2HGDH, come confermato da una riduzione del 100% dell'espressione di L2HGDH utilizzando l'analisi Western blot. Inoltre, utilizzando MSBSP-PCR, il sito di mutazione CRISPR è stato mappato a monte della sequenza di riconoscimento PAM di Cas9 nei cloni omozigoti selezionati. È stato eseguito il sequenziamento Sanger per analizzare le esatte inserzioni/delezioni ed è stata condotta la caratterizzazione funzionale dei cloni. Questo metodo ha prodotto una percentuale significativamente più alta di delezioni omozigoti rispetto ai metodi di somministrazione genica non virale precedentemente riportati. Sebbene questo rapporto si concentri sul gene L2HGDH, questo approccio robusto ed economico può essere utilizzato per creare knockout omozigoti per altri geni in cellule staminali pluripotenti per studi sulla funzione genica.
Introduzione
Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono cellule staminali con il potenziale di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Queste cellule fungono da strumenti preziosi per lo studio dello sviluppo umano, nonché per la comprensione dei meccanismi alla base di varie malattie, offrendo così un'enorme promessa per la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci. Tali studi implicano l'indagine su come geni specifici contribuiscono allo sviluppo, al funzionamento e alla regolazione degli organismi 1,2.
Vengono impiegate varie tecniche e approcci per decifrare la funzione genica, tra cui la manipolazione genetica, come il knockout o la sovraespressione genica, e l'editing del genoma. Tra questi, la tecnologia CRISPR-Cas9 è emersa come l'approccio più efficiente per gli studi di knockout genico e di editing genetico 1,2,3. Il sistema CRISPR-Cas9 funziona utilizzando una singola molecola di RNA guida (sgRNA) specificamente progettata per identificare e legarsi a una particolare sequenza di DNA di interesse. Agendo come guida molecolare, l'sgRNA dirige l'enzima Cas9 verso la posizione precisa nel genoma che richiede la modifica. Una volta legato, Cas9 avvia una rottura a doppio filamento nel DNA nel sito designato. Dopo la scissione del DNA, vengono attivati i meccanismi di riparazione intrinseci della cellula. Questi includono due principali percorsi di riparazione: l'unione delle estremità non omologa (NHEJ) e la riparazione diretta dall'omologia (HDR). L'NHEJ spesso provoca inserzioni o delezioni (indel) nel sito di rottura, portando alla distruzione o all'inattivazione del gene. Al contrario, l'HDR consente l'inserimento di nuove sequenze di DNA nel sito di rottura, facilitando l'introduzione di alterazioni genetiche mirate4.
Data l'importanza delle delezioni geniche nelle cellule staminali pluripotenti, sono stati pubblicati diversi protocolli sui knockout genici mediati da CRISPR-Cas9 nelle hESC/iPSC. Tuttavia, molti di questi protocolli devono affrontare limitazioni significative, come essere estremamente dispendiosi in termini di tempo, laboriosi e avere una bassa efficienza a causa dell'uso di metodi di consegna genica non virali5. Queste sfide sono ancora più pronunciate nelle hESC/iPSC, poiché è noto che queste cellule hanno un'efficienza di editing inferiore rispetto ad altri tipi di cellule5. Alcune di queste limitazioni possono essere affrontate aumentando l'efficienza della somministrazione di plasmidi contenenti Cas9 e sgRNA. Questo può essere ottenuto con successo utilizzando un sistema di vettori lentivirali, che può migliorare significativamente i risultati dell'editing genetico. I protocolli di confezionamento dei lentivirus sono consolidati e semplici, consentendo una facile adozione nei laboratori, anche da parte di ricercatori con esperienza limitata. I lentivirus mostrano un'elevata efficienza di infezione in vari tipi di cellule, tra cui hESC e iPSC. Pertanto, l'utilizzo di un sistema lentivirale per l'espressione di Cas9-sgRNA è ideale per esperimenti di editing genico di routine in hESC/iPSC per studi di funzione genica.
Qui, forniamo un metodo semplice e diretto per delezioni geniche altamente efficienti basate su CRISPR-Cas9 nelle hESC in una durata di tempo relativamente più breve rispetto ai protocolli convenzionali (Figura 1). Sebbene sia stato utilizzato un vettore lentivirale con espressione costitutiva di Cas9 e sgRNA, potrebbe essere facilmente sostituito con l'espressione di Cas9 inducibile da farmaci per l'espressione controllabile di Cas9.
Protocollo
I dettagli delle sequenze geniche, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Progettazione di RNA guida singola (sgRNA), clonazione e produzione di vettori lentivirali
NOTA: Vengono utilizzate due diverse sequenze di sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH , entrambe adattate da Qiu et al.6con i siti PAM di AGG e TGG rispettivamente per le sequenze 1 e 2. Entrambi gli sgRNA erano lunghi 20 bp e le estremità sono state modificate per aggiungere sequenze linker per l'enzima di restrizione Bsmb1 da clonare nel vettore bersaglio (LentiCRISPRv2) come descritto nel precedente rapporto6. Le sequenze linker sono state aggiunte durante la progettazione di sgRNA a scopo di clonazione.
- Ricottura chimicamente sintetizzato sgRNA6 e clonazione nel vettore lentivirale a taglio singolo Bsmb1, LentiCRISPRv2 utilizzando un protocollo ottimizzato come precedentemente riportato7.
- Procedere con il confezionamento e la concentrazione dei lentivirali utilizzando il protocollostandardizzato e ottimizzato 7.
- Per la produzione di lentivirus, seminare HEK293T cellule (1 × 105 cellule/cm2) utilizzando DMEM, FBS al 10% e 1x penicillina/streptomicina (P/S) e incubare per una notte in incubatore di coltura tissutale a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% in condizioni umide.
- Quando il 90% è confluente, co-trasfetta HEK293T cellule con vettore di ingresso (spina dorsale vuota o plasmidi che esprimono sgRNA) e impacchetta i plasmidi utilizzando il polimero cationico a basso costo PEI come descritto in precedenza7.
- Raccogliere il terreno condizionato contenente particelle di surnatante lentivirale (LVS) a 48 ore e 72 ore dopo la trasfezione e procedere con l'ultracentrifugazione utilizzando un cuscino di saccarosio e centrifugare le provette a 1,25.000 x g per 2 ore a 4 °C.
- Procedere con la concentrazione di particelle LVS ad almeno 200 volte il volume originale in PBS, aliquotare e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
- Determinare il titolo delle particelle lentivirali utilizzando il kit per il titolo qPCR Lentivirus seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
2. Infezioni lentivirali e propagazione clonale unicellulare
- Per le infezioni da particelle LVS, seminare una sospensione cellulare hESC (H9) avente 1 × 105 cellule/0,5 mL di terreno di coltura hESC (terreno basale + P/S + 10 μM di Rock Inhibitor) su piastre complete a pozzetti Matrigel (1:50) rivestite in P24 in 500 μL di terreno e incubare durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi. Seminare pozzetti extra che non sarebbero stati infettati da LVS ma trattati con puromicina per fungere da controllo non infetto.
NOTA: Il conteggio delle cellule può essere eseguito utilizzando un emocitometro manuale o un contatore di cellule automatizzato. - Il giorno seguente, infettare le cellule con una molteplicità di infezione (MOI) di 10 insieme a 8 μg/mL di polibrene e incubare a 37 °C per 8 ore, seguita dalla sostituzione del terreno con terreno hESC fresco + P/S senza Rock Inhibitor e continuare la coltura fino a quando le cellule non sono confluenti al 90%.
- Iniziare la selezione della puromicina integrando il terreno con una concentrazione di 0,8 μg/mL di puromicina quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, che di solito è 48-72 ore dopo l'infezione, e continuare la selezione fino a quando tutte le cellule muoiono nelle cellule non infette (gruppo di controllo).
- Al termine della selezione (di solito 4-6 giorni), dividere le celle stabili (1:4) ed espanderle per la crioconservazione e ulteriori analisi.
- Eseguire la selezione di singole cellule e l'espansione clonale utilizzando cellule che esprimono L2HGDH-sgRNA-16.
- A tale scopo, preparare una sospensione cellulare equivalente a 500 cellule/10 mL di terreno di coltura completo e seminare 100 μL di questa sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Lasciare le cellule indisturbate per 3 giorni e poi osservare.
- Contrassegnare i pozzetti che producono singoli cloni e cambiare il terreno a giorni alterni fino a raggiungere una dimensione sufficiente per consentire alle colonie (di solito 2 settimane) di espandersi ulteriormente, crioconservare e analizzare.
3. Estrazione del gDNA, MS-BSP PCR e sequenziamento Sanger
- Isolare il gDNA dalle cellule utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Procedere con la mappatura dei siti di mutazione a monte delle sequenze di riconoscimento PAM utilizzando l'analisi MS-BSP (Mutation Sites Based Specific Primers)8.
- Per questo, un primer destro imparziale L2H-UMSBSP-R1 è progettato per amplificare la regione al di fuori dell'esone1 per amplificare qualsiasi bersaglio.
- Progettare un primer sinistro polarizzato L2H-BMSBSP-F1 con una sequenza identica a sgRNA per amplificare la sequenza bersaglio vicino alle sequenze di riconoscimento PAM.
NOTA: In condizioni molto rigorose di PCR, il prodotto sarà osservato sul gel in cloni non mutati. Nessun prodotto sarebbe stato osservato nei cloni knockout per CRISPR che presentavano mutazioni vicine a monte delle sequenze di riconoscimento PAM. - Al fine di mappare le mutazioni di una singola coppia di basi, la PCR amplifica una sequenza di 468 bp che copre l'intero esone 1 di L2HGDH e la sottopone a sequenziamento Sanger seguito da analisi di allineamento di sequenze multiple utilizzando clustalw8.
4. Saggio di differenziazione delle hESC e di formazione di corpi embrioidi (EB)
- Procedere con la differenziazione diretta del controllo e dei diversi cloni CRISPR di hESC (H9) verso il destino del neuro-ectoderma seguendo protocolli stabiliti come precedentemente descritto utilizzando il metodo di inibizione dual smad 9,10,11.
- Quando si raggiunge la confluenza del 90%, trattare le cellule con LDN193189 (200 nM) e SB431542 (10 μM) per le prime 24 ore in terreno KSR al 100%, seguite dall'aggiunta di XAV939 (2 μM) per altri 2 giorni.
- Dopo 3 giorni, ridurre la percentuale di terreni KSR (Knockout DMEM integrato con 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutammina, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM e 0,1% (v/v) 2-mercaptoetanolo (75%, 50%, 25%) combinandolo con terreni N2 (DMEM/F12 integrato con 1x integratore di N2, 1x P/S, ) al 100% di N2 per un periodo di 8 giorni.
- All'inizio del 12° giorno, fissare le cellule per l'immunocolorazione utilizzando PAX6 come marcatore del neuro-ectoderma.
- Per gli studi sul mesoderma e sulla determinazione del destino endodermico, utilizzare un approccio basato sulla CHIR99021 di piccole molecole descritto in pubblicazioni precedenti12,13.
- Per questo, quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, trattare con 3 μM di CHIR99021 in terreno di comunicazione dell'endoderma definitivo (DE) per 24 ore, seguito da fissazione per l'immunocolorazione utilizzando Brachuary come marcatore specifico del mesoderma.
- Per la fase endodermica, coltivare le cellule per ulteriori 24 ore nel solo terreno DE senza l'aggiunta di CHIR99021 prima di fissare per l'immunocolorazione utilizzando FOXA2.
- Per il saggio di formazione di EB, seminare le cellule su superfici cellulari a basso attaccamento senza utilizzare Matrigel per coltivare cellule in condizioni di sospensione per 24 ore prima di eseguire micrografie.
5. Analisi del Western blot
- Lavare le cellule due volte con PBS e lisare con 1 tampone RIPA contenente l'1% di SDS e 1 cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi.
- Eliminare i lisati mediante centrifugazione a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C, seguita dalla raccolta dei surnatanti.
- Quantificare la proteina cellulare totale utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA seguendo le istruzioni del produttore. Regolare i campioni a 2 μg/μl utilizzando il tampone del campione di colorante caricato al 4×.
- Denaturare i campioni di proteine a 70 °C per 10 minuti, caricare quantità uguali di ciascun campione e risolvere utilizzando gel SDS-PAGE7 con gradiente 4%-12%, quindi trasferirli su membrana PVDF a una tensione costante di 100 V per 1 ora a 4 °C.
- Bloccare le membrane con latte scremato al 5% e incubare in diluizioni di anticorpi primari a 4 °C durante la notte con rotazione.
- Successivamente, lavare le membrane 5 volte utilizzando il tampone PBST e incubare in anticorpi secondari appropriati coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare nuovamente le membrane con PBST 5x, incubare con substrato chemiluminescente e sviluppare utilizzando pellicole radiografiche.
6. Immunocolorazione
- Seminare le cellule su piastre a pozzetti P4 e incubare per almeno 24 ore prima del fissaggio per consentire il corretto fissaggio delle cellule alle superfici.
- Lavare le celle 3 volte con PBS per rimuovere eventuali cellule morte e componenti del terreno, quindi fissarle con PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Permeabilizzare le cellule utilizzando tritone X-100 allo 0,3% seguito dal blocco per legame aspecifico utilizzando il 2% di BSA in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare i campioni con anticorpi primari (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) diluiti in BSA all'1% per una notte a 4 °C.
- Lavare le cellule 3 volte con PBS e incubare con opportuni anticorpi secondari (Capra anti-topo 488, Capra anti-coniglio 488, Capra anti-topo 546, Capra anti-coniglio 546) diluiti all'1% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente.
- Infine, lavare i campioni con PBS 3x e colorarli con DAPI e acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Risultati
Clonaggio di sgRNA L2HGDH in lentiCRISPRv2 puro
Il vettore puro lentiCRISPRv2 è stato ottenuto commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e digerito con BsmB1, che ha portato al rilascio di un frammento di stuffer da 1,8 Kb. Come mostrato nella Figura 2A, è stata osservata una digestione completa del vettore. Per ogni costrutto, sei cloni sono stati sottoposti a screening per verificare la presenza o l'assenza di inserto utilizzando una sequenza di sgRNA inversa come primer e un primer diretto (U6-459F) dall'interno della sequenza vettoriale. Utilizzando questo approccio, solo i cloni che avevano l'inserto hanno prodotto un prodotto PCR di 288 bp e i cloni negativi che non contenevano la sequenza inversa di sgRNA non hanno prodotto alcun prodotto PCR, come mostrato nella Figura 2B.
Infezioni da H9, selezioni stabili e Western blot
Le hESC sono state infettate con particelle lentivirali che esprimono due diversi sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH e selezionate con puromicina. L'analisi del western blot è stata eseguita da popolazioni eterogenee di cellule sgRNA e Cas9 stabilmente co-esprimenti per stabilire quale dei due sgRNA utilizzati fosse più efficiente nell'indurre la delezione genica. Come mostrato nella Figura 3A, L2HGDH-sgRNA-1 è risultato più efficiente dell'altra sequenza nel ridurre l'espressione di L2HGDH in popolazioni cellulari eterogenee.
Selezione clonale, espansione e analisi delle proteine
La selezione di singole cellule e l'espansione clonale sono state effettuate per le cellule che esprimono L2HGDH-sgRNA-1. I pozzetti che hanno prodotto singoli cloni sono stati contrassegnati e cresciuti fino a raggiungere una dimensione sufficiente per consentire alle colonie (di solito 2 settimane) di espandersi ulteriormente, crioconservare e analizzare (Figura 3B). Un totale di 22 cloni sono stati analizzati utilizzando l'analisi Western blot, che ha prodotto cinque knockout omozigoti (23%) per L2HGDH. Questo risultato mostra un'elevata efficienza del knockout genico utilizzando la consegna genica mediata da lentivirali per una co-espressione stabile di sgRNA e Cas9 da una singola cassetta. La Figura 4 mostra un'analisi Western blot dei cinque cloni knockout omozigoti insieme alle cellule di controllo, mostrando un'espressione ridotta del 100% rispetto al controllo nei cloni selezionati.
Analisi a livello del DNA
Al fine di mappare il sito di mutazione CRISPR a monte della sequenza di riconoscimento PAM di Cas9, è stata eseguita la reazione a catena della polimerasi basata su primer specifici basati su siti di mutazione (MS-BSP PCR) utilizzando DNA genomico da cellule di controllo e da cinque diversi cloni. Come mostrato nella Figura 5, due cloni (A5 e B4) hanno mutazioni immediatamente vicine alla sequenza di riconoscimento della PAM, mentre gli altri tre cloni (A1, A9 e B12) hanno mostrato che la mutazione potrebbe non essere molto vicina al sito PAM ed è più a monte della sequenza di sgRNA da 20bp all'interno dell'esone 1 del gene L2HGDH .
Al fine di trovare le mutazioni esatte nel DNA, i prodotti di PCR purificati da cellule di controllo (H9 infettato solo dal vettore) e tre diversi cloni CRISPR, A5, A1 e B4, sono stati sottoposti a sequenziamento Sanger e i siti di mutazione sono stati mappati utilizzando lo strumento di allineamento multiplo clustalw a monte del sitoPAM 8. I risultati hanno rivelato una mutazione di delezione nel clone A5 a monte del sito PAM. Gli altri due cloni, A1 e B4, hanno mostrato mutazioni inserzionali a monte del sito PAM, come evidenziato nella Figura 6.
Analisi funzionale dei cloni
Dopo la generazione di linee cellulari knockout CRISPR nelle hESC, il passo successivo è confermare la loro pluripotenza e il loro potenziale di differenziazione. A tale scopo, abbiamo testato diversi marcatori di pluripotenza per tre diversi cloni, A1, A5 e B4, e abbiamo confrontato i risultati con le cellule di controllo (H9 infettate solo da vettori). I risultati non hanno mostrato alcun cambiamento nel potenziale di pluripotenza delle linee cellulari knockout come determinato dall'immunocolorazione per i marcatori OCT4, NANOG e SOX2. Successivamente, le linee cellulari di controllo e knockout sono state colorate anche per il marcatore di proliferazione cellulare, KI67, che non ha mostrato alcun cambiamento nelle linee cellulari knockout rispetto al controllo. Questi risultati mostrano che il knockout CRISPR non ha influenzato le proprietà di autorinnovamento di queste cellule. Inoltre, anche l'EB e la formazione di colonie non sono state influenzate (Figura 7). Utilizzando metodi in vitro stabiliti nel nostro laboratorio, tutti i cloni sono stati differenziati con successo in tre cellule dello strato germinale, come confermato dall'immunocolorazione per PAX6 (marcatore del neuroectoderma), Brachyury (marcatore del mesoderma) e FOXA2 (marcatore dell'endoderma). Non è stato osservato alcun cambiamento nel potenziale di differenziazione delle linee cellulari knockout rispetto alle cellule di controllo, il che ha dimostrato che le cellule knockout hanno mantenuto il loro potenziale di differenziazione (Figura 8).
Figura 1: Diagramma schematico che mostra il disegno dello studio in 5 fasi. Fase 1: Progettazione e clonazione di sgRNA nel vettore CRISPR V2 digerito Bsmb1. Fase 2: Generazione di particelle lentivirali utilizzando il vettore di ingresso che trasporta l'sgRNA insieme ai plasmidi di imballaggio mediante co-trasfezione delle cellule HEK293T utilizzando polifezioni e concentrazione virale mediante ultracentrifugazione. Fase 3: Infezione delle hESC utilizzando particelle lentivirali con MOI di 10-20 e selezione cellulare stabile utilizzando la puromicina seguita da analisi di popolazioni cellulari eterogenee per vedere l'efficienza degli sgRNA. Fase 4: Clonazione di singole cellule mediante metodo di diluizione limitante dalle cellule che hanno mostrato il massimo knockdown in popolazioni eterogenee e selezione di singoli cloni. Fase 5: Espansione di singoli cloni e analisi a livello di DNA, proteine e analisi funzionale dei cloni per la staminalità e il potenziale di differenziazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Clonaggio di sgRNA nel vettore lentiCRISPR V2.puro. (A) Digestione del vettore lentiCRISPR V2.puro con l'enzima di restrizione BsmB1. La freccia indica un frammento di insaccatrice di 1,8 Kb rilasciato dopo la digestione del vettore. (B) Analisi PCR di colonie per diversi cloni di costrutti 1 e 2 di sgRNA L2HGDH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Western blot e propagazione clonale mediante selezione di singole cellule. (A) Analisi Western blot da due diverse repliche biologiche (S1 e S2) di popolazioni eterogenee di sgRNA (L2H-1 e L2H-2) e Cas9 stabilmente co-esprimenti insieme a hESCs H9 di controllo (C). (B) Selezione di singole cellule ed espansione clonale di cellule H9 che esprimono stabilmente L2HGDH-sgRNA-1. Le frecce indicano pozzetti di piastre a 96 pozzetti che mostrano solo singoli cloni. Barra della scala = 100 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi del Western blot da diversi cloni di H9. (A-C) L'analisi del Western blot da lisati cellulari totali di 22 cloni ha prodotto cinque knockout omozigoti (23%) per L2HGDH. (D) Conferma dei knockout per L2HGDH da un diverso esperimento di replicazione biologica utilizzando Western blot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi PCR MSBSP di diversi cloni di H9. (A) Analisi della sequenza dell'esone 1 di L2HGDH utilizzato per l'analisi MSBSP PCR. (B) Ottimizzazione della temperatura di ricottura per l'analisi MSBSP PCR utilizzando il controllo e il clone H9 V2 L2HGDH KO B4. A 96,8, il controllo mostra una banda, ma B4 non mostra una banda, come mostrato dalle frecce. (C) L'analisi di tutti i cloni KO omozigoti ha portato alla seguente mappatura del sito di mutazione all'interno dell'esone 1. A1 = In/Del non vicino al sito PAM; A5 = In/Del vicino al sito PAM; A9 = In/Del Abbastanza vicino al sito PAM; B4 = In/Del Molto vicino al sito PAM B12 = In/Del non vicino al sito PAM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Allineamento dei prodotti PCR sequenziati Sanger con la sequenza di riferimento dell'esone 1 L2HGDH . Sono stati eseguiti allineamenti multipli di prodotti PCR sequenziati con Sanger da A1, A5 e B4 e cellule di controllo insieme a una sequenza di riferimento all'interno del primo esone di L2HGDH dal database NCBI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Caratterizzazione funzionale di linee cellulari knockout per CRISPR. (A) Le cellule sono state immunocolorate per marcatori di pluripotenza (OCT4, NANOG, SOX2), autorinnovamento (KI67), EB e formazione di colonie rispetto alle hESC H9 infettate dal controllo. Barre della scala: 100 μM. (B) La percentuale di cellule che esprimono positivamente (+ve) è stata calcolata rispetto alla colorazione DAPI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Potenziale di differenziazione di linee cellulari knockout per CRISPR. Caratterizzazione funzionale di linee cellulari knockout CRISPR in termini di potenziale differenziativo utilizzando marcatori per PAX6 (neuroectoderma), Brachiuria (mesoderma) e FOXA2 (endoderma) rispetto alle cellule H9 infettate dal controllo. Barre di scala: 100 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passaggio del protocollo | Tempo necessario |
| Clonaggio di sgRNA in LentiCRISPRv2 | 4 giorni |
| Produzione di lentivirus e determinazione del titolo | 5 giorni |
| Infezioni da hESC, selezioni cellulari stabili ed espansione | 2 settimane |
| Selezione clonale a singola cellula ed espansione | 2 settimane |
| Analisi funzionale dei cloni | 2 settimane |
Tabella 1: Sequenza temporale per i passaggi del protocollo e tempo stimato richiesto.
Discussione
Questo studio ha standardizzato un metodo che consente delezioni geniche altamente efficienti ed economiche nelle hESC attraverso la tecnologia CRISPR-Cas9. Questo metodo ha raggiunto con successo la delezione omozigote del gene L2HGDH nelle hESC entro 3-4 settimane, a partire dall'infezione da hESC fino alla selezione clonale e alla propagazione di singole cellule (Tabella 1). Sebbene le manipolazioni geniche mediate da CRISPR-Cas9 possano essere ottenute mediante trasfezioni transitorie nella maggior parte delle cellule, ciò diventa difficile nelle cellule staminali a causa della scarsa efficienza di trasfezione e dell'elevata tossicità cellulare. Diversi studi hanno riportato che fino al 10% dei cloni recuperati mostrava delezioni. Ad esempio, Mali et al. hanno riportato un'efficienza di editing del genoma dal 2% al 4% nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane dopo aver preso di mira il locus3 di AAVS1. Un altro studio ha riportato efficienze di editing dell'1,3%-8,4% nelle hESC naive per colpire il TUNA, un lungo RNA non codificante coinvolto nella pluripotenza e nella differenziazione neurale14. Ocana et al.15 ha riportato un'efficienza fino al 10% dopo aver preso di mira il gene CFTR nelle cellule staminali pluripotenti umane.15Pertanto, è necessario un metodo di somministrazione efficiente di Cas9-gRNA per ottenere un editing genico efficiente, e questo è particolarmente vero per le cellule staminali poiché queste cellule mostrano un maggiore livello di sensibilità e resistenza ai metodi di somministrazione transitori rispetto alle tipiche cellule somatiche e alle linee cellulari immortalizzate5.
Nel presente studio, un modo altamente efficiente per ottenere linee cellulari knockout CRISPR omozigoti è riportato utilizzando la somministrazione lentivirale mediata di sgRNA nelle hESC. L'uso di vettori lentivirali per somministrare CRISPR-Cas9 nelle hESC si è dimostrato molto più efficiente e meno dispendioso in termini di tempo per ottenere la delezione genica rispetto all'utilizzo di trasfezioni di vettori non virali attraverso mezzi chimici o meccanici (dati non mostrati). Ciò ha comportato un'efficienza di editing del genoma significativamente più elevata (~23%) dopo la selezione clonale e la propagazione dei singoli cloni. Pertanto, combinando la somministrazione lentivirale mediata di sgRNA e Cas9 nelle hESC e un approccio economico per la produzione di lentivirus, il metodo attuale non è solo altamente efficiente e meno dispendioso in termini di tempo, ma anche economico.
Ecco alcune delle raccomandazioni per un approccio di successo: (1) Utilizzo di un singolo sistema vettoriale lentivirale che esprime sia Cas9 che sgRNA. (2) La presenza di un marcatore di selezione antibiotica, come la puromicina, sullo stesso plasmide che esprime Cas9 e sgRNA assicura che quasi il 100% delle cellule sia positivo per l'espressione di Cas9-sgRNA. Ciò aumenta significativamente la probabilità di successo degli eventi di editing genetico. (3) Per essere utile per le infezioni nelle hESC, è indispensabile concentrare i vettori lentivirali per produrre alti titoli di virus. Tra le varie tecniche utilizzate, l'approccio più economico consiste nell'utilizzare grandi volumi di LVS e concentrarli da 100 a 500 volte il volume originale per ottenere titoli compresi tra 107 e 108 UI/mL. (4) Per il metodo economico ed efficiente di HEK293T trasfezioni cellulari con i plasmidi, l'uso di PEI (polietilenimmina) per la trasfezione del vettore lentivirale per il confezionamento del virus è altrettanto efficiente e, quindi, conveniente rispetto al reagente di trasfezione lipofectamina7 comunemente usato. (5) I titoli medi dei lentivirali devono essere compresi tra 5 × 107 UI/mL. (6) La propagazione clonale mediante selezione di singole cellule è necessaria per ottenere delezioni omozigoti del gene di interesse in queste cellule. (7) Sebbene studi precedenti abbiano indicato che l'editing genico mediato da CRISPR-Cas9 nelle cellule staminali pluripotenti umane provoca pochissime mutazioni off-target16,17, è comunque prudente verificare la presenza di siti off-target. Ciò può essere ottenuto attraverso efficienti strumenti di progettazione del gRNA per ridurre al minimo gli effetti off-target e il sequenziamento dell'intero genoma di linee cellulari modificate18, in particolare per esperimenti di importanza clinica. (8) Infine, il cariotipo normale dei cloni selezionati dovrebbe essere verificato utilizzando metodi quali la banda G e l'analisi ad alta risoluzione per garantire che non vi siano cambiamenti genomici su larga scala. Un test del micronucleo può anche essere eseguito per valutare la frequenza di formazione dei micronuclei, che può indicare instabilità genomica.
Uno dei principali limiti di questo metodo è l'uso di un sistema vettoriale lentivirale, che ha portato all'integrazione genomica stabile di Cas9 e sgRNA, portando alla loro espressione costitutiva post-editing, che è indesiderabile. In futuro, questo metodo può essere migliorato sostituendo i promotori costitutivi con un promotore inducibile da farmaci che guida l'espressione del gene Cas9, come il sistema Tet-on con trattamento con doxiciclina per l'espressione controllata di Cas9.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di ricerca dell'Università degli Emirati Arabi Uniti (UAEU) - sovvenzione #12M105, sovvenzione #12R167 (Zayed Center for Health Sciences), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)) e ASPIRE, il pilastro della gestione del programma tecnologico dell'Advanced Technology Research Council (ATRC) di Abu Dhabi, tramite l'ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (ASPIREPMRIAD) con il numero di sovvenzione VRI-20-10.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-MERCAPTOETANOLO | Invitrogen | 31350010 | |
| 38,5 mL, sterile + certificato libero Open-Top Provette ultratrasparenti | Coulter Beckman | C14292 | |
| Accutase | Tecnologie delle cellule staminali | 7920 | |
| bFGF Invitrogen umano ricombinante | PHG0261 | ||
| Corpo monoclonale di coniglio | Abclonale | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel Matrice di membrana basale, senza LDEV | Corning | 354234 | |
| Ciclopamina | Tecnologie delle cellule staminali | 72074 | |
| Terreni DMEM | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM MIX DI NUTRIENTI F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS senza: Ca e Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Siero fetale | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Anticorpo mAb di coniglio | CST | 2118S | |
| Reagente di dissociazione cellulare delicata | Tecnologie delle cellule staminali | 7174 | |
| HyClone Aminoacidi non essenziali (NEAA) 100x Soluzione | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Coniglio mAb | CST | 9129 | |
| KnockOut Siero di ricambio | Invitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMMINA, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH Anticorpo policlonale | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 terreno completo | Tecnologie delle cellule staminali | 85850 | |
| Nanog Antibody | CST | 3580 | |
| NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Integratore 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Integratore 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 Anticorpo | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Coniglio mAb | CST | 60433 | |
| PENICILLINA STREPTOMICINA SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Reagente per l'infezione da polibrene | Sigma | TR1003- G | |
| Polietilenimmina, ramificata | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromicina | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR Kit per titoli Lentivirus Abm | LV900 | ||
| Inibitore della roccia Y-27632 dicloridrato | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 Anticorpo | CST | 2748 | |
| Saccarosio | Sigma | 57-50-1 | |
| TRIPSINA .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Kit di purificazione del DNA genomico | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Riferimenti
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
- Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
- Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
- Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
- Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
- Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
- Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
- Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
- Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
- Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
- Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
- Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
- Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).
Ristampe e permessi
