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Articolo metodologico

Arricchimento di proteine subcellulari in Leptospira utilizzando un approccio di frazionamento basato su Triton X-114

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DOI:

10.3791/67298

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8 agosto 2025

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1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

In questo articolo

Sommario

Sebbene i procarioti manchino di un sistema organellare, ci sono regioni subcellulari con proteine localizzate. L'analisi quantitativa e qualitativa degli enzimi e delle proteine nelle regioni subcellulari è importante per lo sviluppo di bersagli di farmaci e vaccini. Qui, illustriamo il frazionamento subcellulare delle proteine Leptospiral utilizzando Triton X-114 e la sua analisi.

Abstract

I procarioti mancano di precisi organelli subcellulari, ma mostrano regioni distinte come il citoplasma, la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna, dove sono organizzate la maggior parte delle funzioni biochimiche e fisiologiche. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche funzionali delle proteine richiede di chiarire la loro localizzazione subcellulare. Tuttavia, l'estrazione di proteine subcellulari dai batteri gram-negativi pone sfide a causa del loro complesso doppio strato fosfolipidico. Sebbene Triton X-114 si sia dimostrato promettente nell'estrazione delle proteine della membrana esterna (OMP), un protocollo conciso rimane sfuggente. Questo protocollo dimostra un flusso di lavoro passo-passo per l'estrazione di proteine subcellulari utilizzando la spirocheta Leptospira come modello. Questa tecnica, caratterizzata dal frazionamento subcellulare e dalla separazione di fase, produce frazioni distinte per proteine citoplasmatiche, esterne e di membrana interna. Il detergente Triton X-114 è adatto per la separazione di fase grazie alla sua temperatura ottimale del punto di intorbidamento (~22 °C) e alla bassa concentrazione critica di micelle (CMC), che consente un'estrazione e una purificazione efficienti delle proteine native con una denaturazione minima. In particolare, l'analisi rivela l'efficienza nel discriminare le proteine dalle membrane interne ed esterne distinte dal citoplasma.

Introduzione

Le analisi di proteomica subcellulare (SCP) svolgono un ruolo fondamentale nel chiarire la patogenesi batterica analizzando il proteoma all'interno di specifici compartimenti subcellulari delle cellule batteriche. Questo approccio di proteomica subcellulare caratterizza le proteine batteriche all'interno di compartimenti distinti, riducendo la complessità escludendo proteine altamente abbondanti e fornendo informazioni sulla loro organizzazione e abbondanza proporzionale 1,2. Ad esempio, utilizzando tecniche di frazionamento subcellulare e LC-MS/MS, uno studio su Shewanella oneidensis ha svelato una parte sostanziale del suo proteoma, fornendo dettagli cruciali riguardanti l'architettura compartimentale dell'abbondanza cellulare e proteica. Questo studio funge da quadro di base per le successive indagini sull'organizzazione subcellulare all'interno dei batteri gram-negativi3. Nell'ambito della patogenesi batterica, delineare il proteoma batterico durante l'infezione in vivo è fondamentale per comprendere i meccanismi che guidano la patogenicità4. Lo studio del proteoma della Salmonella intracellulare all'interno delle cellule epiteliali in vari stadi di infezione è stato determinante per svelare le strategie adattative impiegate dai patogeni batterici all'interno del loro ambiente intracellulare 4,5. Le strategie SCP forniscono informazioni complete sulle dinamiche cellulari valutando l'abbondanza e la traslocazione delle proteine all'interno di vari compartimenti cellulari. Questo metodo facilita l'identificazione estensiva di proteine provenienti da diversi compartimenti batterici, migliorando l'analisi approfondita dei proteomi batterici 6,7.

La distribuzione subcellulare delle proteine non solo determina la loro attività funzionale, ma migliora anche la loro diversità funzionale8. Ad esempio, gli enzimi mostrano meccanismi di regolazione e livelli di attività diversi a seconda della loro localizzazione subcellulare. Le transglutaminasi (TGasi), ad esempio, mostrano ruoli distinti o meccanismi di regolazione in diversi compartimenti subcellulari nei tubi pollinici: le TGasi citoplasmatiche incorporano ammine primarie nelle proteine citosoliche (ad esempio, actina e tubulina) in modo Ca(2+)-dipendente, interagendo con il citoscheletro; le TGasi di membrana sono associate al Golgi e alle membrane plasmatiche, suggerendo un ruolo nel rilascio esocitotico; e le TGasi associate alla parete cellulare regolano la crescita apicale colocalizzandosi con i marcatori della parete cellulare. Queste distinzioni funzionali sono mediate da ruoli specifici del compartimento9. Inoltre, la riparazione delle proteine ossidate nell'involucro batterico sottolinea il ruolo critico dei sistemi enzimatici all'interno di specifici compartimenti cellulari esposti a specie reattive dell'ossigeno10. Si consideri l'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), la cui localizzazione subcellulare è modulata da modificazioni lipidiche, influenzando la sua interazione con diverse membrane cellulari11. La compartimentazione enzimatica mantiene ambienti distinti favorevoli alle interazioni tra enzimi e substrati, facilitando così i processi metabolici compartimentali specifici12.

I batteri e gli altri procarioti non hanno organelli subcellulari chiari; Ci sono regioni distinte, tra cui il citoplasma, la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna. La maggior parte delle funzioni biochimiche e fisiologiche dell'organismo sono organizzate in vari compartimenti sottocellari13. Quindi, la localizzazione subcellulare delle proteine è importante per prevedere le loro caratteristiche funzionali. Tuttavia, l'estrazione di proteine subcellulari da batteri gram-negativi pone sfide a causa del loro complesso doppio strato fosfolipidico a doppia membrana. I metodi di estrazione convenzionali, che impiegano detergenti come il dodecil solfato di sodio (SDS) e additivi come l'urea, spesso compromettono l'integrità delle proteine di membrana, influenzando le analisi a valle14,15. Inoltre, la composizione lipidica gioca un ruolo significativo nel modellare le alterazioni conformazionali delle proteine di membrana. Il successo della solubilizzazione dipende da fattori come il rapporto detergente-lipidi-proteine, poiché il processo prevede l'inserimento del detergente nel doppio strato lipidico seguito dalla solubilizzazione delle proteine16. La scelta del detergente è fondamentale per solubilizzare efficacemente le proteine di membrana, considerando fattori come la temperatura del punto di intorbidamento e il tempo di incubazione17. L'ambiente lipidico può influenzare i cambiamenti conformazionali delle proteine di membrana18,19.

I detergenti sono essenziali per estrarre le proteine di membrana dalle membrane biologiche e garantirne la solubilità in soluzioni acquose, prerequisito per la successiva purificazione delle proteine. Tuttavia, la purificazione delle proteine di membrana è spesso impegnativa perché vengono rimosse dal loro ambiente nativo di membrana lipidica e poste in un tampone detergente, che replica solo parzialmente le proprietà fisiche e chimiche della membrana20. Dopo l'estrazione, le proteine di membrana vengono tipicamente purificate in processi successivi utilizzando la dialisi, la precipitazione proteica e alcuni metodi cromatografici come proteine solubili20,21. La separazione di fase offre una potente alternativa o complemento ai protocolli di purificazione basati sulla cromatografia e può essere applicata direttamente alle proteine solubilizzate. Fondamentalmente, la separazione di fase consente alle proteine integrali di membrana di dividersi in fase di arricchimento del detergente e alle proteine citosoliche nella fase acquosa impoverita dal detergente20,22. In studi precedenti sono stati descritti diversi detergenti utilizzati nella solubilizzazione delle proteine di membrana20. Questi includono la famiglia Triton (Triton X-100 e Triton X-114), la famiglia Tween (Tween-20 e -80), i detergenti anionici, i detergenti cationici, i detergenti monoetere di poliossietilenglicole ecc., ma hanno pro e contro in termini di struttura e funzione delle proteine20. Le proprietà fisico-chimiche di questi detergenti influenzano notevolmente la partizione di fase e la solubilizzazione delle proteine di membrana20. I detergenti sono molecole anfipatiche con un gruppo polare e una catena idrofoba idrocarbonica. A basse concentrazioni, esistono come monomeri nell'acqua. Al di sopra della concentrazione critica di micelle (CMC), formano micelle la cui dimensione dipende dal tipo di detergente, con il numero di aggregazione che indica il numero di molecole per micella (chiamato anche peso molecolare delle micelle). Un altro fattore importante è il "punto di intorbidamento" che può essere raggiunto modificando la temperatura di una soluzione acquosa di detergente micellare che diventa torbida e alla fine forma due fasi distinte. Questo processo è noto come separazione di fase o estrazione del punto di intorbidamento. Un'elevata CMC può produrre più proteine di membrana corrispondenti ad alte concentrazioni di detergente con legame più debole, che possono essere dializzati contro un tampone con una concentrazione di detergente definita20. Tuttavia, il raggiungimento di un'elevata CMC nella maggior parte dei detergenti richiede un'elevata temperatura del punto di intorbidamento, che può influenzare la struttura e la funzione delle proteine estratte e influenzare i processi a valle. Anche l'alta concentrazione di detergente in questa fase potrebbe essere dannosa per le proteine e creare problemi nella manipolazione dei liquidi per il pipettaggio di volumi precisi a causa dell'elevata viscosità. Ad esempio, triton X-100 ha un'alta resa di proteine di membrana nella micella detergente al di sopra della temperatura del punto di intorbidamento di 64-65 °C. Per mantenere la temperatura di lavoro, 9%-23% (NH4)2COSÌ4 o l'aggiunta di NaCl al 16%-25% può essere ridotta a temperatura ambiente (RT), ottenendo un'alta concentrazione di detergente, che probabilmente influisce sulla stabilità delle proteine. Analogamente, l'estrazione basata su interpolazione utilizza un'elevata temperatura del punto di intorbidamento (76 °C per l'interpolazione a 20 e 93 °C per l'interpolazione a 80 anni). Il detergente anionico SDS è spesso utilizzato nelle applicazioni proteiche, ma di solito denatura le proteine20. I ricercatori, con l'obiettivo di estrarre in modo efficiente le proteine di membrana, hanno identificato Triton X-114 come un detergente classico grazie alla sua temperatura ottimale del punto di intorbidamento di circa 22 °C, ideale per gli studi sulle proteine di membrana. Introdotto per la prima volta da Bordier nel 1981, Triton X-114 è stato da allora ampiamente utilizzato per l'estrazione e la purificazione di proteine di membrana in diverse fonti, inclusi tessuti animali e vegetali e microrganismi20,22. La bassa CMC di Triton X-114 ne impedisce la rimozione mediante dialisi; Tuttavia, la sua natura delicata riduce al minimo la denaturazione delle proteine di membrana nella fase arricchita di detergenti. Inoltre, Triton X-114 forma micelle più piccole (n = 7-8) rispetto a Triton X-10020. Il protocollo di studio di James G. Pryde ha impiegato Triton X-114 per l'estrazione di proteine di membrana da cellule di mammifero in coltura. Utilizzando una temperatura del punto di intorbidamento superiore a 20 °C (incubazione a 30 °C per 3 minuti), le proteine integrali di membrana sono state suddivise nella fase arricchita di detergente, mentre le proteine periferiche e citosoliche sono state recuperate dalla fase acquosa impoverita di detergente22. Inoltre, David A. Haake et al. hanno utilizzato Triton X-114 per estrarre proteine della membrana esterna (OMP) da Leptospira interrogans, con e senza CaCl2 come additivo23,24. Studi successivi hanno confermato che Triton X-114 estrae efficacemente le OMP dai compartimenti subcellulari senza additivi come glicerolo o CaCl225,26. Tuttavia, l'inclusione di sali può aumentare la concentrazione del detergente, il che può influenzare gli studi sul proteoma su larga scala utilizzando la spettrometria di massa ad alto rendimento20. Nel nostro lavoro sull'analisi del proteoma subcellulare, abbiamo impiegato Triton X-114 accoppiato con la spettrometria di massa tandem, ottenendo un arricchimento significativo in tutti i compartimenti subcellulari, comprese le proteine citoplasmatiche, della membrana interna e della membrana esterna25,26. L'obiettivo principale del presente protocollo è quello di arricchire in modo efficiente i compartimenti subcellulari di una tipica cellula batterica gram-negativa, minimizzando i problemi nei processi a valle. Inoltre, il protocollo è progettato per essere conveniente ed efficiente in termini di tempo. Qui, elaboriamo il protocollo ottimizzato sviluppato in laboratorio per l'isolamento delle proteine subcellulari e discutiamo ogni collo di bottiglia riscontrato durante il processo di estrazione.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo utilizza Leptospira interrogans per l'esperimento di estrazione di proteine subcellulari. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per l'uso con altri batteri gram-negativi, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione a seconda degli obiettivi di ricerca specifici. La Tabella dei Materiali e la Tabella 1 forniscono l'elenco delle sostanze chimiche e delle attrezzature, insieme alle composizioni dei tamponi e delle soluzioni reagenti, rispettivamente, mentre la Tabella 2 delinea le strutture di laboratorio.

1. Ceppo di Leptospira e condizioni di coltura

  1. Ottenere il sierogruppo L. interrogans Icterohaemorrhagiae sierotipo Copenhageni ceppo Fiocruz L1-130.
    NOTA: Questo ceppo è stato ottenuto dall'Indian Council of Medical Research - Regional Medical Research Centre di Port Blair, in India, un centro collaboratore dell'OMS specializzato nella diagnosi, nel riferimento, nella ricerca e nella formazione della leptospirosi.
  2. Coltivare Leptospira (inoculo contenente ~1 × 106 cellule/mL) in 50 mL di terreno Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) integrato con albumina sierica bovina (BSA) all'1%.
  3. Incubare a 30 °C fino a quando la coltura raggiunge la fase di crescita a metà log (3,5 × 108 cellule/mL). Analizzate le aliquote del terreno di coltura su piastre di agar nutriente per garantire che il terreno rimanga incontaminato.
    NOTA: Utilizzare la microscopia a campo scuro e una camera di conteggio Petroff-Hausser per contare le cellule. Per i dettagli, si rimanda a un articolo27 pubblicato in precedenza.

2. Raccolta di cellule

  1. Dopo un periodo di incubazione di 7 giorni, trasferire tre repliche biologiche della coltura di L. interrogans in provette da centrifuga in volumi uguali (25 ml ciascuna).
    NOTA: La coltura di Leptospira è stata gestita all'interno di una cappa a flusso d'aria laminare in una struttura di laboratorio BSL-2 durante il trasferimento.
  2. Centrifugare tutte le provette a 2500 × g per 45 minuti a 4 °C. Travasare con cura il surnatante in un becher contenente disinfettante e gettarlo. Utilizzare il pellet della cella per il passaggio successivo.
  3. Lavare i pellet cellulari tre volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (1 mL ciascuno) integrata con 5 mM di MgCl2, centrifugando a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C dopo ogni lavaggio.
    NOTA: Questo passaggio rimuoverà la BSA indesiderata presente nel mezzo EMJH dalla superficie del pellet della cella.

3. Estrazione di proteine subcellulari

  1. Estrazione Triton X-114
    1. Trattare il pellet cellulare di Leptospira , ottenuto dopo la raccolta, con un tampone di estrazione contenente 10 mM di Tris-Cl (pH 8), 1% di Triton X-114 e 150 mM di NaCl a una velocità di 1 mL per pellet raccolto (Tabella 1) (opzionale: un cocktail di inibitori della proteasi può essere aggiunto in base allo scopo sperimentale).
      NOTA: La procedura prevede semplicemente l'esposizione dei batteri a una soluzione detergente aggiungendo il tampone di estrazione per estrarre le proteine della membrana.
    2. Miscelare delicatamente il tampone di estrazione con il pellet utilizzando una micropipetta a una temperatura inferiore a 25 °C fino a quando la soluzione diventa visivamente torbida.
    3. Incubare la miscela per una notte a 4 °C.
    4. Miscelare nuovamente l'estratto ottenuto con una micropipetta e centrifugare a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
    5. Decantare il surnatante in un'altra fiala e conservare il pellet cellulare per i successivi processi di estrazione.
      NOTA: Questo surnatante contiene una miscela di proteine idrofile e idrofobiche in abbondanza dal citoplasma e dalla membrana esterna e viene utilizzato per la separazione di fase.
    6. Aggiungere 50 μl di tampone contenente 10 mM di Tris-Cl (pH 8), 8 M di urea, un cocktail di inibitori della proteasi e dodecil solfato di sodio (SDS) all'1% al pellet cellulare.
    7. Agitare la miscela continuamente per 5 minuti dopo aver aggiunto il tampone di estrazione, quindi incubare a 4 °C per altri 5 minuti.
    8. Centrifugare nuovamente la miscela a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C e designare il surnatante risultante come frazione di pellet (P).
      NOTA: È stato riscontrato che la frazione di pellet contiene un'elevata abbondanza di proteine della membrana interna in Leptospira 25,26.
  2. Partizione di fase
    1. Regolare la concentrazione di Triton X-114 del surnatante ottenuto dall'estrazione al 2%. Ad esempio, se il volume del surnatante è di 900 μl, aggiungere 9 μl di detergente Triton X-114 per ottenere la concentrazione desiderata.
    2. Incubare la miscela a 37 °C per 1 ora, quindi centrifugare a 2000 × g per 5 minuti a 30 °C. Questa centrifugazione a bassa velocità può accelerare la separazione delle fasi.
    3. Lasciare che la miscela si separi in due fasi distinte: acquosa e detergente. Garantire una corretta centrifugazione a bassa velocità per ottenere una separazione visibile. Se necessario, lasciarlo riposare per 1 minuto prima dell'isolamento. Se la separazione non avviene, ripetere il passaggio 3.2.2 secondo necessità.
      NOTA: La separazione di fase può essere osservata visivamente, mediante misurazioni della torbidità utilizzando uno spettrofotometro o attraverso la diffusione statica della luce. Per aumentare l'accuratezza del saggio del punto di intorbidamento, aggiungere alla soluzione un colorante idrofobico (5-esadecanoil-ammeosina) con una concentrazione di 500 nM e analizzarlo con spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-VIS).
    4. Isolare la fase acquosa superiore perforando l'interfaccia con una siringa sterile e trasferendola in una fiala separata. Isolare la fase di detergente inferiore utilizzando una micropipetta e conservarla in un flaconcino separato.
      NOTA: Maneggiare con cura la fiala contenente entrambe le fasi durante il processo di separazione. Prima di perforare il flaconcino con una siringa, aprire il coperchio per evitare la rottura dell'ago o difficoltà nell'estrazione della fase acquosa superiore. L'uso di una siringa garantisce una misurazione più accurata del volume di ciascuna fase dopo la separazione e riduce al minimo la contaminazione incrociata delle proteine tra le fasi.
    5. Etichettare le fasi come acquose (A) e detergenti (D) e conservarle a -20 °C per un uso futuro.

4. Stima delle proteine

  1. Valutare le concentrazioni proteiche di ciascuna frazione di Triton X-114 (acquosa, detergente e pellet) utilizzando il saggio bicinchoninic28 o qualsiasi altro metodo adatto.

5. Elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)

NOTA: Le proteine di ciascuna frazione (acquosa, detergente, pellet) devono essere trattate con beta-mercaptoetanolo per ridurle, quindi separate utilizzando SDS-PAGE al 10% (tre repliche biologiche). La ricetta per la SDS-PAGE al 10% si trova nella Tabella 1. Per il targeting dei campioni proteici, qualsiasi analisi dell'attività enzimatica deve essere eseguita in una forma nativa che può essere risolta in PAGE nativa.

  1. Risospendere il campione proteico in acetone ghiacciato utilizzando quattro volte il volume del campione. Incubare la miscela a -20 °C per almeno 2 ore, quindi centrifugare a 14.000 × g per 10 minuti. Inoltre, risospendere la frazione del pellet in acetone ghiacciato all'80%, quindi incubare per 5 minuti a 4 °C. Centrifugare a 14.000 × g per 10 minuti per rimuovere i cristalli di sale di urea in eccesso.
  2. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante e porre il pellet proteico in un bagno asciutto fino a quando tutto l'acetone residuo evapora dai flaconcini.
  3. Incubare i campioni proteici in un tampone da 20 μL contenente beta-mercaptoetanolo, quindi riscaldarli a 95 °C per 10 minuti in un bagno d'acqua o a secco.
    NOTA: Qui, i campioni di proteine rappresentano la frazione acquosa (A) contenente proteine citoplasmatiche, la frazione detergente (D) contenente proteine della membrana esterna e la frazione pellet (P) contenente proteine della membrana interna.
  4. Caricare i campioni contenenti A, D e P in ciascun pozzetto del gel SDS-PAGE al 10% insieme a un marcatore proteico prestainato (M) e a una proteina totale (T).
    NOTA: La proteina totale può essere preparata riunendo tutte e tre le frazioni in un'unica fiala utilizzando 20 μl di tampone campione.
  5. Utilizzare 1x tampone per elettrodi nell'apparecchio per elettroforesi (Tabella 1). Impostare i parametri di funzionamento del gel su 6 mA per il gel di impilamento e 12 mA per il gel risolutivo. Eseguire l'elettroforesi a RT.
  6. Colora il gel con Coomassie Brilliant Blue G o altri coloranti proteici disponibili in laboratorio.

6. Immunoblotting

  1. Dopo la separazione del gel, incubare il gel non colorato nel tampone di trasferimento (25 mM di base Tris, 190 mM di glicina, 20% di metanolo) per 5 minuti.
  2. Incubare le carte assorbenti di dimensioni adeguate nel tampone di trasferimento dell'immunoblot per 5 minuti, quindi assemblarle come strato inferiore del sandwich.
  3. Utilizzare membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) o membrane di nitrocellulosa per trasferire le proteine dai gel non colorati. Iniziare immergendo la membrana in PVDF in metanolo assoluto per 30 s, seguita da un'immersione di 5 minuti nel tampone di trasferimento dell'immunoblot. Successivamente, integrarlo nel panino assorbente.
  4. A questo punto, posizionare il gel non colorato che è stato rimosso dal tampone di trasferimento e utilizzarlo nel sandwich di tampone di trasferimento.
  5. Infine, copri il panino posizionandolo sopra altra carta assorbente, rilascia eventuali bolle d'aria intrappolate con un rullo a macchie ed esegui il trasferimento utilizzando un metodo di trasferimento semi-secco.
    NOTA: A seconda delle strutture di laboratorio, è possibile utilizzare altri approcci, tra cui il trasferimento a secco e a umido.
  6. Immergere la membrana in un tampone bloccante (8% di latte scremato in TBS-0,1% Tween 20 [TBS-T]) per 2 ore, seguito da incubazione notturna a 4 °C con antisieri monospecifici* mirati alla lipoproteina LipL41 di Leptospira (1:5000) o alla proteina del nucleo (FlaB) del filamento flagellare da 35 kDa (1:4000) (*anticorpo personalizzato). Risciacquare la membrana tre volte con TBS-T, lasciando procedere ogni risciacquo per 5 minuti.
    NOTA: Utilizzare qualsiasi anticorpo di interesse. Il fattore di diluizione degli anticorpi può variare.
  7. Incubare la membrana con un anticorpo secondario anti-coniglio di topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) IgG (diluizione 1:20000) per 2 ore a RT.
  8. Esporre la membrana al reagente di elettrochemiluminescenza (ECL) per visualizzare le bande proteiche.
  9. Posizionare la membrana sotto una pellicola radiografica sensibile al blu all'interno di una stanza buia.
    NOTA: È possibile utilizzare anche altri metodi di sviluppo.

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Risultati

In questo esperimento, abbiamo impiegato la spirocheta Leptospira come organismo modello per estrarre i compartimenti subcellulari. Abbiamo impiegato una metodologia strategica ancorata al punto di intorbidamento e alla concentrazione miceliale critica (CMC), sfruttando l'efficacia di Triton X-114, un detergente non ionico (Figura 1). Prima di procedere ulteriormente, è stata condotta una stima delle proteine per valutare la concentrazione in ciascuna frazione per una singola replic...

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Discussione

Le tecniche di frazionamento subcellulare svolgono un ruolo fondamentale nell'isolamento di costituenti cellulari discreti per la successiva analisi. Triton X-114, un detergente non ionico, è comunemente usato in queste tecniche a causa della sua capacità di suddividere i campioni in fasi distinte, consentendo la separazione di vari componenti cellulari32. Triton X-114 è stato particolarmente utile nell'estrazione di proteine di membrana (in forma nativa) da una v...

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Dichiarazioni

Gli autori hanno dichiarato di non avere interessi finanziari conflittuali.

Ringraziamenti

Gli autori esprimono la loro sincera gratitudine all'Indian Council of Medical Research, New Delhi, India, per il sostegno finanziario fornito attraverso la sovvenzione n. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 e il Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Science and Engineering Research Board, Nuova Delhi, India, per il loro sostegno finanziario tramite la sovvenzione n. SR/SO/HS/0108/2012 a M.G.M. Inoltre, gli autori estendono il loro apprezzamento all'Indian Council of Medical Research, New Delhi, India, per l'assegnazione di una borsa di ricerca senior attraverso la sovvenzione n. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 rispettivamente a H.P e AS e Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Science and Engineering Research Board, Nuova Delhi, India, Grant No. PDF/2017/000343 alla S.A.D.C.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido acetico  Sigma  695092
Acetone    Sigma  32201
Acrilamide    Sigma  A-3553
Persolfato di ammonio    Sigma  A-3678
Bilancia  SHIMADUZ  Z741079
Bis Acrilammide    Sigma  Codice: M7279
Frazione V dell'albumina sierica bovina (BSA)  Sigma  A-8022
Blu di bromofenolo    Sigma  B-8026
Provetta da centrifuga (50 mL)Tarsons500020
Pallone conico con tappo (150 mL)Tarsons431030
Centrifuga di raffreddamento  Eppendorf  5355316200
Coomassie blu brillante    Sigma1.12553
Microscopio a campo scuro  ZEISS  GmbH37081
Salviette delicate per attivitàKimtech Scienza34155
Bagno secco  Eppendorf  535531620
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) medio, Difco  Difco  279410
Vassoi per gel: i vassoi per gel devono essere di dimensioni larghe di almeno 2 cm e avere una superficie liscia e piatta con coperchio.  Hoefer  Non applicabile
Becco in vetro (150 mL)Tarsons421030
Glicina G8790    Sigma  G-8898
Carta da filtro assorbente ImmobilonMilliporeIBFP0813C
Impostazione semi-secca Immunoblot  ATTA  AE-6675
Incubatore - Per incubare i vassoi di gel per 18 ore a 37 °C.  EYELA  SLI-700
Flusso d'aria laminare  Non applicabile  Non applicabile
Luminol  Sigma  09253
Cloruro di magnesio M8266  Sigma  Codice: M8266
Agitatore magnetico  TARSONI  6040
Metanolo    Sigma  17995-7
Puntali per micropipette (10 & micro; L– 10 ml)AxygenT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Micropipette  Eppendorf  EP2231300010
Microprovette (1,5 mL Safe-Lock)EppendorfEP022363212
Mini giro  Genaxy  GENERAZIONE MINI-6K
Lettore multimodaleBMG LABTECH  S/N 413-3877
Latte scremato in polvere, bovinoSigma-AldrichCodice: M7409
Acido P-cumarico    Sigma  C9008
Soluzione salina tamponata con fosfato    SigmaP4417 
Frigorifero  LG  GC-B217BLJ2
Rocker - Agitatore oscillante o rotante a bassa velocità per colorare il gel.  TARSONI  4080
SDS-PAGE SETUP - Apparecchio per elettroforesi  Hoefer, Inc.  SE300-10A-1.0  Modello Hoefer ' miniVE' che può colare gel di dimensioni 10 cm x 8 cm di spessore 1 mm.
Cloruro di sodio      Sigma  5886
Dodecil solfato di sodio (SDS)    Sigma  L-4396
TEMED    Sigma  T-9281
Tritone X-114    Sigma648468
Trizma Base (TRIS) T6066    Sigma  Codice: T6066
Vortice  TARSONI  3020

Riferimenti

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
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