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Articolo metodologico

Definizione di un modello di grave infiammazione corneale nei ratti basato sul curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali

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DOI:

10.3791/67305

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22 novembre 2024

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1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un modello di ratto di grave infiammazione corneale attraverso il curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali. Lo studio ha valutato i modelli di infiammazione corneale, la proliferazione epiteliale e i cambiamenti nelle cellule staminali limbari in condizioni infiammatorie.

Abstract

L'infiammazione corneale, in particolare l'infiammazione corneale grave, svolge un ruolo significativo nello sviluppo della disfunzione delle cellule staminali limbari corneali. La costruzione di modelli animali appropriati può aiutarci a concentrarci sugli effetti di una grave infiammazione sulle cellule staminali limbari corneali. Un antiruggine da 2 mm è stato utilizzato per rimuovere l'epitelio corneale centrale dei ratti Sprague Dawley (SD) per creare una lesione. Quindi, lo stroma centrale della cornea è stato suturato con suture di nylon per indurre un'infiammazione persistente. In questo modo, è stato costruito un modello di infiammazione corneale con abrasione dell'epitelio corneale centrale e sutura dello stroma centrale, che ha indotto una grave infiammazione corneale. Sono stati osservati cambiamenti nell'infiammazione corneale e nelle condizioni delle cellule staminali limbari a 1, 3 e 7 giorni dopo il modellamento. Al 3° giorno dopo il modellamento, il limbus corneale dei ratti era gravemente edematoso, con evidente neovascolarizzazione e iperplasia locale, che sono segni tipici di deficit di cellule staminali limbari. Entro il 7° giorno, l'edema corneale è gradualmente peggiorato e la neovascolarizzazione ha continuato ad aumentare. Attraverso la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e la colorazione in immunofluorescenza, abbiamo scoperto che i fattori infiammatori epiteliali corneali erano significativamente sovraregolati, la differenziazione epiteliale corneale era anormale, le cellule staminali epiteliali corneali erano significativamente ridotte e anche la proliferazione cellulare e la staminalità erano diminuite. Pertanto, questo modello dimostra che una grave infiammazione può indurre danni alle cellule staminali limbari senza danneggiare direttamente le cellule staminali limbari. Il modello è utile per osservare gli effetti di una grave infiammazione sui meccanismi biologici delle cellule staminali e fornisce una piattaforma ideale per studiare i meccanismi della disfunzione delle cellule staminali epiteliali corneali indotta dall'infiammazione.

Introduzione

La disfunzione delle cellule staminali limbari (LSCD) è caratterizzata da difetti epiteliali persistenti, vascolarizzazione corneale, infiammazione cronica, cicatrizzazione e congiuntivalizzazione della cornea 1,2. Può derivare dall'esaurimento o dalla disfunzione delle cellule staminali limbari dopo gravi malattie della superficie oculare, come ustioni chimiche, ustioni termiche, sindrome di Stevens-Johnson e lesioni iatrogene causate da interventi chirurgici oculari 2,3,4. I meccanismi patogenetici della LSCD coinvolgono principalmente alterazioni nelle cellule staminali e disturbi nel microambiente delle cellule staminali 5,6, che colpisce l'omeostasi dell'epitelio corneale 2,7. Ci sono due tipi principali di cambiamenti di destino nelle cellule staminali limbari nella LSCD: 1) Il potenziale di differenziazione direzionale delle cellule staminali epiteliali corneali diventa anormale, portando alla loro differenziazione in cellule epiteliali della pelle. Ciò è evidenziato da una diminuzione dell'espressione del fattore di trascrizione Pax6 e delle cheratine Krt12 e Krt3 specifiche della cornea, insieme a un aumento significativo dell'espressione dei marcatori di metaplasia epiteliale squamosa Krt10, Krt1 e Sprr1b8 correlati alla pelle; 2) La lesione della superficie oculare distrugge direttamente le cellule staminali limbari corneali, provocando necrosi o apoptosi e successivamente causando la proliferazione del tessuto congiuntivale che ricopre la cornea9. È stato riportato che durante lo sviluppo di LSCD, le cellule infiammatorie come i macrofagi, i neutrofili e le cellule dendritiche aumentano significativamente nel microambiente delle cellule staminali epiteliali corneali. Di conseguenza, citochine come l'interferone-gamma (IFN)-γ, il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, l'interleuchina (IL)-1β e le proteine infiammatorie dei macrofagi (MIP)-1α/β mostrano anche aumenti significativi10.

Sono stati stabiliti vari modelli di LSCD, compresi quelli indotti da suture, lesioni chimiche e spotting da cloruro di benzalconio11. Ognuno di questi modelli ha i suoi vantaggi e svantaggi. Le lesioni chimiche possono danneggiare l'intera superficie oculare e distruggere direttamente le cellule staminali limbari12. Il benzalconio cloruro funziona in modo simile alle lesioni chimiche, ma ha un effetto relativamente lento13. Il modello di sutura corneale può indurre una risposta infiammatoria stabile e a lungo termine, ma la reazione infiammatoria è relativamente lieve e non può causare LSCD.

Per studiare il ruolo e i meccanismi dell'infiammazione nello sviluppo della LSCD corneale, è stato stabilito un modello animale che combina il curettage dell'epitelio corneale centrale con le suture corneali. Questo modello induce un'infiammazione persistente dell'epitelio corneale senza danneggiare direttamente le cellule staminali limbari.

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Protocollo

Tutte le procedure sono conformi alle linee guida ARVO per l'utilizzo di animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina di Guizhou (Approvazione n. 2305192). I ratti sono stati ospitati presso il Centro per gli animali dell'Università di medicina di Guizhou, aderendo alle normative pertinenti sulla gestione degli animali.

1. Selezione degli animali

  1. Utilizzare ratti femmina di Sprague-Dawley (SD) di 7-8 settimane. Assicurarsi che non vi siano lesioni della superficie oculare durante l'esame con lampada a fessura.
  2. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore rapido. Gli strumenti necessari includono il dispositivo di rimozione degli anelli di ruggine corneale, il marcatore per il campionamento della pelle da 2 mm, i portaaghi, i coltelli per lo strato di piastre, le forbici chirurgiche oftalmiche e le pinze.
  3. Anestetizzare i ratti con tribromoetanolo all'1,25% tramite iniezione intraperitoneale alla dose di 0,3 ml per 100 g di peso corporeo. Valutare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi. Instillare una goccia di collirio tropicamide per la dilatazione della pupilla. Applicare colliri di bupivacaina cloridrato sull'occhio. Utilizzare un unguento lubrificante oculare sull'occhio controlaterale per mantenere l'umidità.
  4. Disinfettare la pelle e i peli intorno agli occhi con iodophor.
  5. Stabilire il modello di infiammazione.
    1. Posizionare il ratto in posizione di decubito laterale. Esporre il bulbo oculare al microscopio operatorio.
    2. La cornea centrale è stata etichettata utilizzando un marcatore di campionamento cutaneo di 2 mm e l'epitelio corneale centrale etichettato è stato raschiato utilizzando un dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale.
    3. Posizionare tre suture corneali a 120° utilizzando filo di nylon 10-0, portaaghi e forbici e pinze chirurgiche oftalmiche a circa 3 mm dal limbus, non penetrare nella cornea14,15.
  6. Applicare l'unguento per gli occhi Ofloxacina alla fine della procedura per prevenire l'infezione.
  7. Osservare e fotografare la cornea il 1°, 3° e 7° giorno dopo l'operazione utilizzando una lente ingrandita 10x con lampada a fessura. Registrare i sintomi come la guarigione dell'epitelio corneale, l'iperemia congiuntivale, l'edema corneale, l'iperemia limbare e la neovascolarizzazione corneale.

2. Calcolo dell'indice infiammatorio

  1. Calcolare l'indice infiammatorio della superficie oculare dopo aver stabilito il modello animale.
    1. Valutare la congestione del corpo ciliare come segue: nessuna congestione (0 punti); la presenza di congestione inferiore a 1 mm (1 punto); iperemia tra 1 mm e 2 mm (2 punti); iperemia compresa tra 1 mm e 2 mm (3 punti).
    2. Punteggio dell'edema corneale centrale come segue: nessun edema (0 punti); edema con chiara visibilità dell'iride (1 punto); edema con visibilità dell'iride poco chiara (2 punti); edema con l'iride non visibile (3 punti).
    3. Punteggio dell'edema corneale paracentrale come segue: nessun edema (0 punti); edema con chiara visibilità dell'iride (1 punto); edema con visibilità dell'iride poco chiara (2 punti); edema con l'iride non visibile (3 punti).
    4. Calcola l'indice di infiammazione sommando tutti i punteggi e dividendolo per 9.

3. Valutazione della neovascolarizzazione corneale

  1. Osservare la neovascolarizzazione corneale con una lampada a fessura.
    1. Analisi ed elaborazione delle immagini con il software di elaborazione delle immagini con lampada a fessura16.
    2. Registrare la crescita della neovascolarizzazione corneale in ogni punto temporale di osservazione, misurando la neovascolarizzazione corneale più lunga verso la cornea centrale con curvatura minima.
    3. Classificarli come segue: Grado 0: Avascolare; Grado 1: Micro (<1 mm); Grado 2: Delicato (da 1 mm a 1,5 mm); Grado 3: Moderato (>da 1,5 mm a 2 mm); Grado 4: Grave (>2 mm).

4. Analisi della biologia del modello

  1. Preparare campioni di occhi congelati.
    1. Anestetizzare il ratto con isoflurano al 4-5% e sopprimerlo mediante lussazione cervicale.
    2. Nella posizione di decubito laterale, sollevare il bulbo oculare del ratto verso l'esterno con una micro pinzetta e tagliare la congiuntiva lungo la cupola superiore e inferiore dell'occhio con le forbici per gli occhi.
    3. Tagliare il nervo ottico, prestando attenzione a mantenere l'integrità dell'epitelio corneale.
    4. Asciugare le macchie di sangue e l'acqua sulla superficie del bulbo oculare con carta da filtro e metterle nella scatola di inclusione con il mezzo di inclusione della temperatura di taglio ottimale (OCT).
    5. Rimuovere le bolle nella scatola di inclusione con una pipetta da 200 μl, congelarla con azoto liquido e quindi conservare i campioni incorporati nel frigorifero a bassissima temperatura.
  2. Preparare le sezioni congelate dei bulbi oculari.
    1. Prima di preparare la sezione congelata, preraffreddare il criostato a circa -28 °C e il portacampioni a -26 °C.
    2. Togliete i campioni congelati dal congelatore freddo e metteteli nel criotomo per circa 1 ora.
    3. Preraffreddare il campione congelato in un criotomo per 10 minuti. Segnare il campione con una matita, fissarlo sul tampone del campione con OCT e fissarli insieme sulla rastrelliera di sezionamento dopo il raffreddamento.
    4. Regolare la posizione e la direzione del campione congelato e fissarlo. Per prima cosa, tagliare sezioni di 20 μm fino a quando non si vede la cornea centrale. Quindi, ottenere sezioni da 6 μm mediante affettatura continua e raccogliere le sezioni sui vetrini di adesione pre-preparati.
    5. Segnare il nome, il materiale, il tempo di sezione, il nome e il numero del tessuto sul vetrino. Porre a temperatura ambiente (RT) per circa 30 min.
    6. Dopo aver asciugato le sezioni, mettetele in una scatola e conservatele nel frigorifero a bassissima temperatura per la riserva.
  3. Eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina.
    1. Togliere le sezioni congelate pre-preparate dal frigorifero a bassissima temperatura e metterle nella cappa aspirante a RT ad asciugare.
    2. Fissare le sezioni con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a RT. Sciacquare i campioni con 1x PBS per 5 min.
    3. Posizionare le sezioni del campione contenenti i vetrini su un supporto per vetrini e immergerle nel cilindro del colorante con la soluzione di colorante ematossilina a RT per 5 minuti.
    4. Sciacquare lentamente il campione contenente i vetrini con acqua di rubinetto per lavare via il colorante galleggiante, metterli nel serbatoio del colorante con alcol acido cloridrico allo 0,1% e rimuoverli rapidamente dopo 1-2 s.
    5. Sciacquare lentamente il campione con acqua di rubinetto per 15 minuti.
    6. Rimuovere il campione dall'acqua e immergere i vetrini nel serbatoio del colorante eosina; lasciare a RT per 3 min.
    7. Sciacquare lentamente il campione con acqua di rubinetto, lavare via il colorante in eccesso ed eseguire la disidratazione alcolica graduale utilizzando alcol al 75%, alcol all'80%, alcol al 95%, alcol al 100% (uno) e alcol al 100% (due). Immsere le sezioni in ogni concentrazione per 2 min.
    8. Rendere i campioni trasparenti per 2 minuti rispettivamente in xilene (1) e xilene (2).
    9. Asciugare il campione nella cappa aspirante, sigillare le sezioni con un sigillante e fare attenzione a non produrre bolle.
    10. Posizionare i vetrini in una scatola di diapositive a RT. Visualizzare le sezioni utilizzando un microscopio.
  4. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza.
    1. Rimuovere le parti congelate e metterle in una scatola a RT nella cappa ad asciugare.
    2. Segnare il nome dell'anticorpo da colorare nel vetrino grezzo del campione congelato.
    3. Fissare i campioni con paraformaldeide al 4% a RT per 15 minuti. Una piccola quantità di acqua del rubinetto è stata aggiunta alla scatola per evitare che il campione si seccasse.
    4. Rimuovere il fissativo paraformaldeide e lavare il campione tre volte con 1x tampone PBS. Fare attenzione a non sciacquare il campione.
    5. Asciugare il liquido intorno alla sezione di tessuto, coprire il campione con una soluzione di membrana cellulare (TritonX-100 allo 0,2%) e incubare a RT per 20 minuti.
    6. Rimuovere la soluzione della membrana cellulare e lavare le sezioni tre volte per 5 minuti ciascuna con 1 tampone PBS.
    7. Asciugare le sezioni di tessuto, coprire il campione con una soluzione bloccante l'immunofluorescenza (2% BSA) e incubare a RT per 1 ora.
    8. Preparare l'anticorpo primario e il diluente (1% BSA) durante l'incubazione secondo le istruzioni del produttore.
    9. Rimuovere il liquido bloccante e asciugare il campione con una pompa di aspirazione. Aggiungere l'anticorpo primario preparato, coprire la scatola e incubarla in frigorifero a 4 °C per una notte (incubare per circa 12-16 ore) al riparo dalla luce.
    10. Scartare l'anticorpo primario e lavare il campione quattro volte per 10 minuti ciascuna in PBS.
    11. Durante la fase di pulizia, preparare la diluizione dell'anticorpo secondario secondo le istruzioni del produttore.
    12. Rimuovere il PBS, asciugare il campione e aggiungere l'anticorpo secondario preparato al campione. Coprire il campione e incubare a RT per 1 ora al riparo dalla luce.
    13. Rimuovere l'anticorpo secondario, lavare il campione 4 volte con 1 tampone PBS per 10 minuti ciascuno e coprire l'intero vetrino con 1 tampone PBS.
    14. Rimuovere il PBS, asciugare il campione e sigillare le sezioni con un mezzo di montaggio contenente DAPI, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria. Avvolgere i vetrini nella carta stagnola e tenerli a 4 °C al riparo dalla luce.
    15. Scatta foto con un sistema di microscopio confocale laser o con un sistema di fotocamere per microscopio a fluorescenza verticale (velocità di scansione: 4 μs/pixel, risoluzione di scansione: 1024 x 1024).
  5. Preparazione della sospensione unicellulare dell'epitelio corneale di ratto
    1. Dopo l'eutanasia, rimuovere i bulbi oculari con una pinzetta imbevuta di alcol al 75% e immergerli nella soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e il 10% di penicillina-streptomicina preparata in anticipo.
    2. Pulisci i bulbi oculari e usa 1x HBBS contenente il 10% di FBS e il 10% di penicillina-streptomicina due volte per 5 minuti ciascuno.
    3. Rimuovere la congiuntiva lungo il margine sclerale; Lasciare il margine sclerale a circa 1 mm. Ancora una volta, lavare il tessuto corneale due volte con 1x HBBS contenente il 10% di FBS e il 10% di penicillina-streptomicina.
    4. Trasferire il tessuto corneale pulito in un mezzo epidermico ormonale integrato (SHEM) contenente 2U/mL di Dispasi II. Chiudere il sigillo e posizionarlo a 4°C per 14-16 h.
    5. Tieni a portata di mano un paio di pinzette, una pinzetta sdentata, un dispositivo per il recupero dell'iride e uno sterilizzatore chirurgico.
    6. Sotto un microscopio operatorio, separare delicatamente l'epitelio corneale lungo il bordo della cornea.
    7. Lavare l'epitelio corneale con 1x HBSS contenente il 10% di penicillina-streptomicina per 5 minuti.
    8. Trasferire il tessuto epiteliale corneale in una provetta da centrifuga da 1,5 mL contenente 200 mL di tripsina e incubare in un'incubatrice al 5% di CO2, 37 °C. Ogni 5 minuti, agitare la provetta da centrifuga tre volte per digerire il foglio epiteliale corneale in una sospensione unicellulare.
    9. Aggiungere una quantità uguale di terreno SHEM per fermare l'azione della soluzione di digestione della tripsina e posizionarla a RT.
  6. Coltura clone di cellule epiteliali corneali
    1. Preparare le celle del trofoblasto.
      1. Quando la densità di crescita delle cellule di topo NIH 3T3 raggiunge l'80-90%, scartare il terreno di coltura cellulare. Aggiungere 10 mg/mL di terreno di coltura mitomicina NIH 3T3 pre-preparato e incubare a 37 °C per 2,5 ore.
      2. Rimuovere il terreno, sciacquare le cellule con 1x HBSS, sostituirle con un nuovo terreno cellulare NIH 3T3 e continuare l'incubazione in un incubatore di CO2 (5% CO2, 37 °C).
    2. Preparare la sospensione di cellule epiteliali corneali e contare le cellule secondo il rapporto richiesto.
    3. Durante la preparazione della sospensione delle cellule epiteliali corneali, elaborare le cellule NIH 3T3 trattate con mitomicina.
      1. Scartare il surnatante, sciacquare le cellule con 1x HBSS, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubare a RT per 2-3 minuti.
      2. Aggiungere una quantità uguale di terreno epiteliale ormonale supplementare (terreno SHEM: DMEM/F12, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico di topo [EGF], 10 μg/mL di insulina-transferrina-selenio [ITS], 5% FBS, 1% di penicillina-streptomicina, 0,5% di dimetil solfossido [DMSO], 0,5 mg/mL di idrocortisone), pipettare delicatamente per ottenere una sospensione cellulare e contare le cellule.
    4. Utilizzare una piastra a 12 pozzetti e aggiungere 0,5 mL di terreno SHEM a ciascun pozzetto.
    5. Mescolare le cellule epiteliali corneali con le cellule NIH 3T3 a una densità di 500 cellule epiteliali corneali/cm2 e 5 x 105 cellule NIH 3T3/cm2. Aggiungere 1 mL di terreno SHEM a ciascun pozzetto.
    6. Aggiungere 1 mL della miscela di cellule in ciascun pozzetto e pipettare delicatamente per distribuire le cellule in modo uniforme.
    7. Incubare in incubatore (5% CO2, 37 °C), cambiando il terreno ogni 2-3 giorni. Cultura per 12-14 giorni.
  7. Colorazione cristallovioletto
    1. Dopo circa 12 giorni, quando i cloni epiteliali corneali stanno per fondersi, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 1 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto, coprendo completamente le cellule. Fissare le celle per 15 minuti a RT.
    2. Rimuovere il 4% di paraformaldeide e lavare i pozzetti tre volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
    3. Rimuovere 1 tampone PBS e aggiungere una soluzione di colorante crystal violet allo 0,4% in ciascun pozzetto. Macchiare per 30 minuti a RT.
    4. Rimuovere o riciclare la soluzione di colorante cristallovioletto e lavarla tre volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuna.
    5. Asciugare i pozzetti all'aria a RT fino a completa asciugatura.
    6. Utilizzare un normale sistema fotografico al microscopio verticale (velocità di scansione: 4 μs/pixel, risoluzione di scansione: 1024 x 1024).
  8. Estrazione dell'mRNA corneale
    1. Raccogli forbici oftalmiche, forbici corneali, pinze dentate, raschietto epiteliale corneale elettrico, Trizol, provette da centrifuga da 1,5 ml prive di RNasi e una ghiacciaia.
    2. Acquisizione epiteliale
      1. Anestetizzare il ratto con isoflurano al 4-5% e sopprimerlo dopo la lussazione cervicale. Posizionare l'animale in posizione laterale. Taglia i baffi del mouse con le forbici per gli occhi per evitare di bloccare la visuale.
      2. Posiziona il ratto sotto un microscopio operatorio e regolalo a un'altezza appropriata per mettere a fuoco il bulbo oculare. Usa una pinza dentata per spingere ed esporre delicatamente il bulbo oculare. Sollevare la congiuntiva del ratto e utilizzare un raschietto epiteliale corneale elettrico pulito per raschiare l'area centrale di 2 mm dell'epitelio corneale.
      3. Raccogliere l'epitelio corneale raschiato con una pinza dentata pulita spruzzata con alcol. Mettere il tessuto raccolto in una provetta da centrifuga contenente 1 mL di Trizol.
      4. Lavorare il più rapidamente possibile per sciacquare il tessuto raccolto in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente acqua a doppia deionizzazione. Assorbire l'acqua in eccesso con carta da filtro. Spruzzare con alcool al 75% e procedere al passaggio successivo.
      5. Sollevare nuovamente la congiuntiva del ratto usando una pinza dentata. Usa le forbici corneali con il lato concavo rivolto verso l'alto per tagliare la congiuntiva lungo il limbus, lasciando circa 0,5 mm di congiuntiva bianca.
      6. Raschiare l'epitelio corneale entro un intervallo di 2 mm al limbus corneale utilizzando il raschietto elettrico. Raccogliere il fazzoletto come descritto in precedenza. Raccogli l'epitelio corneale centrale da tre bulbi oculari e l'epitelio limbare da tre bulbi oculari.
      7. Posizionare i tessuti raccolti in provette reagenti separate da 1 ml di Trizol RNA. Eseguire l'intera operazione sul ghiaccio per preservare l'integrità dell'RNA. Procedere immediatamente con i passaggi successivi o conservare i campioni in un congelatore a bassissima temperatura a -80 °C per un uso successivo.
    3. Scongelare il campione con ghiaccio, utilizzare un omogeneizzatore tissutale a ultrasuoni per lisare le cellule. Impostare la potenza dell'omogeneizzatore a ultrasuoni su 25%, il tempo su 2 s per burst, il tempo di intervallo su 5 s e il tempo totale su 2 min. Lasciate riposare sul ghiaccio per 10 min.
    4. Aggiungere cloroformio (1/5 del volume totale, circa 200 μl) a ciascun campione, mescolare accuratamente capovolgendo per 30 s e centrifugare a 400 x g per 10 minuti a 4 °C.
    5. Precipitazione dell'RNA
      1. Dopo la centrifugazione, il liquido all'interno della provetta da centrifuga viene stratificato in tre parti. Lo strato superiore chiaro è l'RNA, lo strato medio bianco torbido è il DNA e le proteine e lo strato inferiore è il Trizol. Pipettare con cura circa 500 μl dello strato superiore trasparente in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL, facendo attenzione a non aspirare il precipitato bianco nello strato intermedio. Se aspirato inavvertitamente, ripetere la centrifugazione per raccogliere nuovamente lo strato trasparente.
      2. Aggiungere una quantità uguale di isopropanolo pre-raffreddato alla provetta da centrifuga contenente lo strato trasparente, circa 500 μl, capovolgere la provetta più volte per mescolare accuratamente, quindi metterla immediatamente in un congelatore a bassissima temperatura a -80 °C per 20-30 minuti. Questo passo mira ad accelerare la precipitazione dell'RNA.
    6. Estrarre il campione e centrifugare immediatamente a 400 x g per 10 minuti a 4 °C. Una piccola quantità di precipitato bianco e traballante è visibile sul fondo del tubo da centrifuga; Eliminare il surnatante.
    7. Aggiungere etanolo al 70% pre-preparato e raffreddato a ghiaccio in ogni tubo. Centrifugare immediatamente a 4 °C in centrifuga refrigerata a 400 x g per circa 10 min; Ripetere i passaggi precedenti una volta per lavare accuratamente il precipitato. A questo punto, pre-sterilizzare la cappa con luce UV per 15 minuti.
    8. Dopo aver rimosso le provette da centrifuga e aver eliminato il surnatante, centrifugare nuovamente a 4 °C a circa 250 x g per 2 minuti. Utilizzare un puntale per pipetta da 200 μl per aspirare con cura l'alcol in eccesso dal lato opposto al precipitato, asciugandolo il più accuratamente possibile. Mettere ad asciugare in una cappa aspirante pre-sterilizzata con raggi UV, asciugare il precipitato all'aria per circa 15 minuti.
    9. Preparare la soluzione aggiungendo 1 mL di inibitore della RNasi a 40 mL di acqua di Dietil pirocarbonato (DEPC). Aggiungere una quantità appropriata di miscela di acqua DEPC/inibitore della RNasi, circa 20-30 μL, per sciogliere il campione. Se c'è molto precipitato, aggiungere 30-50 μL. Procedere immediatamente con la PCR a trascrizione inversa.
  9. PCR a trascrizione inversa
    1. Assicurati che siano presenti questi elementi: macchina per PCR, provette da centrifuga da 1,5 ml prive di RNasi, provette per PCR da 0,2 ml, bagno di ghiaccio o scatola di ghiaccio, pipetta e puntali privi di RNasi.
    2. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando lo spettrofotometro a microvolumi. Per ogni campione, assicurarsi che venga aggiunto 1 μg di RNA al sistema di reazione.
    3. Il sistema di trascrizione inversa ha un volume totale di 20 μl. Calcolare la quantità totale di reagenti necessari in base al numero di campioni. Mescolare secondo il rapporto specificato nelle istruzioni.
    4. Preparare il sistema di reazione sul ghiaccio, agitarlo e centrifugarlo brevemente. Incubare a 42 °C per 15 min e a 90 °C per 30 s.
    5. Utilizzare il cDNA ottenuto dal processo di trascrizione inversa direttamente per l'analisi PCR quantitativa in tempo reale o conservarlo in frigorifero a -80 °C.
  10. Reazione di PCR quantitativa in tempo reale
    1. Utilizzare un kit di reagenti PCR quantitativo in tempo reale17 con un sistema di reazione da 10 μl. Utilizzare le sequenze di primer mostrate nella Tabella 1.
    2. Aggiungere il sistema di reazione sopra descritto in una piastra a 96 pozzetti o in una provetta a otto strisce specifica per RT-PCR. Assicurarsi che i campioni siano ben miscelati. Verificare la presenza di bolle nelle provette prima di posizionarle sulla macchina per PCR.
    3. Amplificare il gene utilizzando il ciclo PCR (95 °C per 5 min), 40 cicli (95 °C per 10 s, 60 °C per 30 s) e completare i dati per calcolare il valore di 2-ΔΔ Ct. Elabora, analizza e traccia i dati utilizzando un software di analisi dei dati appropriato.

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Risultati

Come mostrato nella Figura 1A, attraverso l'osservazione con una lampada a fessura, abbiamo scoperto che la guarigione dell'epitelio corneale era compromessa. In circostanze normali, l'epitelio corneale centrale guarirebbe completamente entro 24-48 ore dalla rimozione, ma nell'escissione dell'epitelio centrale corneale combinata con un modello di sutura, continuavano ad esistere nuovi vasi sanguigni. Il terzo giorno dopo la definizione del modello, sono stati osservati un significativo edema...

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Discussione

L'infiammazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo del deficit di cellule staminali limbari18, ma i suoi meccanismi ed effetti specifici richiedono ulteriori esplorazioni. Per risolvere questo problema, abbiamo indotto LSCD raschiando l'epitelio corneale centrale e suturando lo stroma corneale centrale per causare una grave infiammazione corneale. Abbiamo osservato l'evoluzione dell'infiammazione corneale e lo stato delle cellule staminali limbari nei giorni 1,...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto in parte dai progetti provinciali di scienza e tecnologia del Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), dal Fondo scientifico provinciale del Fujian per giovani studiosi illustri (2023J06053 [a S.O]); la Natural Science Foundation of China (No.82101084 [a S.O.] e il China Scholarship Council (CSC, 202306310049 [a Y.W.]).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
linea di sutura 10-0Alcon, Inc., USA8065698001
trephine corneale da 2 mmSuzhou XVI Vision Company, Cinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, teste per pistole per pipette da 1 mL, piastre per colture cellulari, piastre per colture cellulari, provette per centrifugaGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Cinahttps://www.jetbiofil.com/index.html-20
/-80 Frigorifero CQingdao Haier Company, Cinahttps://www.haier.com/cn/
Una siringa da 10 ml  Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Cinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
aderire alla diapositivaShiTai Company188105
alcol amileneShanghai. Macklin Biochemical, Cinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, Regno Unitoab76318
Anticorpo anti-cheratina 12 EPR17882Abcam, Regno Unitoab185627
Anticorpo anti-PAX6Abcam, Regno Unitoab195045
Vetrini anti-stripping, vetrini coprioggettiJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Cinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Giapponehttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Cinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
CloroformioShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Cinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Forno incubatore, frantoio ad ultrasuoni, centrifugaThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Microscopio confocaleShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Cinahttps://www.clinx.cn/about
Pinze epiteliali cornealiSuzhou XVI Vision Company, Cina53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
Acqua DEPC  Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Cinahttps://www.siobp.com/web
Crema per gli occhi Dicuro (ofloxacina crema per gli occhi)Santian Pharmaceutical Corporation, Giapponehttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, terreno di coltura, doppio anticorpo e PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, Regno Unito 
Bilancia elettronicaShanghai Ohaus Biotechnology Company, Cinahttp://shbio.com/company
Involucro della membranaParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
La striscia reattiva del sodio fluoresceina è stata utilizzata in oftalmologiaTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Cinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Sistema micrografico fluorescente a contrasto di fase invertitoTE-2000U, Nikon, Giapponehttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Centrifuga da tavolo surgelataEppendorf, Germaniahttps://www.eppendorf.sh.cn 
Telaio in lastra di vetroXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Cinahttp://www.tagene.net/
H-1200 con sigillante DAPIXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., CinaKit
HEAuragene, CinaKit di
ematossilina-eosinaAURAGEN, StatiUnitiP032IH
Bilancia elettronica ad alta e bassa precisioneSdolis, Germaniahttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanoloShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., CinaAnticorpo https://en.reagent.com.cn/
Ki-67Abcam, Regno Unitoab16667
azoto liquidoXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Cinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Supporto per micromaniSuzhou XVI Vision Company, Cinahttp://www.66vision.com/
Polvere di multiformaldeideSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Centrifuga a temperatura normale 46Eppendorf, Germaniahttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Cina4583
Sistema micrografico biologico ordinarioEclipse 50i, Nikon, Giapponehttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, CinaSH30256.01
PCR e l'apparato del reattoreBiometra Thermocycler, Germaniahttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipette di varie specificheEppendorf Company, Germaniahttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primer per Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaina cloridrato 0,5% collirioAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN anticorpoFitzgerald, Stati Uniti20R-PR020
PCR quantitativa a fluorescenza in tempo realeApplied Biosystems,  Stati Unitihttps://www.thermofisher.cn
Kit di trascrizione inversaTAKARA, Giapponehttps://www.takarabiomed.com.cn/
Lampada a fessuraTOPCON, Giapponehttps://topconchina.cn/
Pinze lisceSuzhou XVI Vision Company, Cinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Cinahttp://chuangdianbio.com/
Banco SupercleanNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Pinze dentateSuzhou XVI Vision Company, Cinahttp://www.66vision.com/
Collirio Toppicamide (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Traccia di proteina dell'acido nucleico tester di concentrazioneThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen Gli Stati Unitihttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, con un microscopio operatorioCarl ZEIS, Germaniahttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
MCA341GA di colorazione https://www.bosonbio.com.cn/ soluzione colorante http://jushengwu.com/a048/

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