Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

Sommario

Questo protocollo fornisce una linea guida completa per l'impostazione e il monitoraggio quantitativo delle co-colture, compresi i cianobatteri fotoautotrofi secernenti zucchero e i lieviti eterotrofi.

Abstract

Con la crescente domanda di biotecnologie sostenibili, si stanno esplorando consorzi misti contenenti un microbo fototrofico e specie partner eterotrofe come metodo per la bioproduzione basata sul solare. Un approccio prevede l'uso di cianobatteri che fissano la CO₂ che secernono carbonio organico per supportare il metabolismo di un eterotrofio co-coltivato, che a sua volta trasforma il carbonio in beni o servizi di valore superiore. In questo protocollo, viene fornita una descrizione tecnica per assistere lo sperimentatore nella creazione di una co-coltura che combina un ceppo cianobatterico secernente saccarosio con uno o più partner fungini, come rappresentato da specie di lievito modello. Il protocollo descrive i prerequisiti chiave per l'instaurazione della co-coltura: definizione della composizione del terreno, monitoraggio delle caratteristiche di crescita dei singoli partner e analisi di colture miste con più specie combinate nello stesso recipiente di crescita. Vengono riassunte le tecniche di laboratorio di base per il monitoraggio della co-coltura, tra cui microscopia, contatore cellulare e citometria a flusso a singola cellula, e vengono forniti esempi di software non proprietario da utilizzare per l'analisi dei dati di file standard di citometria a flusso grezzi (FCS) in linea con i principi FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). Infine, sono inclusi commenti sui colli di bottiglia e le insidie che si incontrano frequentemente quando si tenta di stabilire una co-coltura con cianobatteri secernenti zucchero e un nuovo partner eterotrofo. Questo protocollo fornisce una risorsa per i ricercatori che tentano di stabilire una nuova coppia di microbi co-coltivati che includa un cianobatterio e un microbo eterotrofo.

Introduzione

Con la rapida espansione degli strumenti genomici e delle tecnologie del DNA negli ultimi anni, gli sforzi di bioingegneria sono sempre più in grado di considerare le comunità miste di microbi come praticabili per le strategie di bioproduzione piuttosto che concentrarsi esclusivamente sulle colture axeniche. I consorzi microbici presentano molteplici vantaggi potenziali rispetto alle colture di singole specie, tra cui la specializzazione e la divisione del lavoro, l'adattabilità e la robustezza e l'efficienza dell'utilizzo del substrato¹. Tuttavia, l'ingegneria prevedibile dei consorzi multi-specie è complicata dalle incertezze causate da comportamenti di ordine superiore che emergono dalle interazioni inter-specie². La segnalazione tra specie e lo scambio di metaboliti sono al centro del principio della divisione del lavoro, ma portano anche a sinergie e antagonismi inaspettati tra i partecipanti ai consorzi³. È necessario un notevole sviluppo nel campo se si riesce a realizzare il pieno potenziale dei consorzi microbici misti, compreso l'uso di piattaforme di co-coltura flessibili a 2 e 3 partner, che possono essere utilizzate per caratterizzare e comprendere meglio l'interattività microbica dal "basso verso l'alto".

Alcuni tipi dominanti di piattaforme di co-coltura sono attualmente in uso nel campo, tra cui partner auxotrofici complementari e microbi che secernono metaboliti che sono generalmente benefici per un'ampia gamma di specie microbiche. In quest'ultima categoria, i cianobatteri sono stati ingegnerizzati per diventare produttori primari potenziati attraverso l'introduzione di percorsi che portano alla secrezione di carboidrati facilmente metabolizzati e sono stati ora esplorati in una varietà di consorzi progettati razionalmente. In breve, in tali comunità microbiche ingegnerizzate, il partner cianobatterico è in grado di utilizzare la luce e la CO₂ come input primari e, attraverso il processo di fotosintesi ossigenata, questi ceppi possono secernere zuccheri di carbonio centrale come bene pubblico. Una classe di tali ceppi cianobatterici ingegnerizzati sono quelli che sono stati ingegnerizzati per secernere il disaccaride saccarosio⁴. Tali ceppi hanno probabilmente goduto del loro successo perché il saccarosio è un metabolita che è vicino al metabolismo centrale del carbonio per molte specie ed è anche spesso iper-accumulato come un cosiddetto "soluto compatibile" per adattarsi a una varietà di stress abiotici ambientali⁵. Un numero minimo di interventi genetici può portare a un'efficiente secrezione di saccarosio in una serie di organismi modello cianobatterici⁴.

I cianobatteri secernenti saccarosio sono una piattaforma utile per lo studio di consorzi microbici progettati razionalmente perché un'ampia gamma di specie eterotrofe può metabolizzare il saccarosio come fonte dominante di carbonio ed energia. Infatti, utilizzando alcuni cianobatteri modello con capacità di secernere saccarosio, molti laboratori hanno progettato razionalmente co-colture e consorzi di specie miste che contengono uno o più microbi eterotrofi e che sono in ultima analisi supportati dagli input primari di luce e CO₂ senza l'integrazione di materie prime di carbonio organico⁴. I ceppi eterotrofi possono semplicemente sopravvivere con i carboidrati derivati dai cianobatteri, oppure possono essere utilizzati per convertire la materia prima del saccarosio in bioprodotti di valore superiore (ad esempio, combustibili, polimeri, pigmenti, ecc.). Oltre ad essere una potenziale strategia per la bioproduzione sostenibile, tali co-colture semplicistiche possono anche essere utili come piattaforma per lo studio delle interazioni emergenti tra specie microbiche non correlate.

Questo articolo video si concentra sulle metodologie e sui prerequisiti per l'utilizzo dei cianobatteri produttori di zucchero come piattaforma flessibile per la progettazione di semplici consorzi microbici che possono essere stabili integrando solo la luce e gli input di carbonio inorganico. Mentre l'impostazione e il monitoraggio di colture contenenti singoli microrganismi stabiliti sono per lo più semplici e possono essere facilmente ottenuti utilizzando la metodologia della densità ottica (OD) o della retrodiffusione, ciò non è fattibile una volta che due o più organismi sono combinati in un unico recipiente. La ragione principale è che questi metodi non distinguono tra i diversi microrganismi, quindi forniscono solo un quadro generale della coltura e non risolvono la crescita dei singoli organismi. Inoltre, i cianobatteri hanno un ampio spettro di assorbimento nell'intervallo 400-750 nm, quindi misurare l'OD₆₀₀ di un eterotrofio porterebbe a risultati falsi a causa della ficociani (che assorbe in 620 nm). Pertanto, vengono forniti protocolli specifici per l'impostazione di comunità miste cianobatteri-eterotrofi all'interno del laboratorio nonché protocolli generici utili per l'analisi delle prestazioni di questi consorzi nel tempo. Mentre i protocolli si concentrano su un accoppiamento specifico di una specie cianobatterica modello che secerne saccarosio con uno o più microbi eterotrofi modello, l'intento di questo lavoro è quello di fornire una risorsa per i ricercatori che potrebbero voler progettare nuovi accoppiamenti di specie e di accelerare la fase di ottimizzazione per l'istituzione di tali culture. Pertanto, oltre ai protocolli specie-specifici, sono incluse informazioni e strategie che possono essere utilizzate per adattare e generalizzare questi protocolli per le comunità personalizzate, come definite dalle esigenze del lettore.

A causa della flessibilità della piattaforma di co-coltura qui descritta, vengono descritti i protocolli per una serie di diverse specie eterotrofe che sono state precedentemente riportate in co-coltivazione con cianobatteri secernenti zucchero. Ad esempio, viene fornito il protocollo passo-passo per una co-coltura di Synechococcus elongatus PCC 7942 con il comune lievito di laboratorio Saccharomyces cerevisiae . Tuttavia, l'articolo include anche protocolli appropriati per valutare le prestazioni di co-colture contenenti altre specie modello, tra cui la forma di lievito di Ustilago maydis.

L'articolo si concentra su un nucleo di protocolli necessari per stabilire una co-coltura cianobatterica/eterotrofica ed eseguire la caratterizzazione di base delle prestazioni di questi consorzi misti nel tempo. In particolare, vengono enfatizzati i metodi di citometria a flusso a singola cellula e di conteggio delle particelle adatti a effettuare un censimento accurato di diverse specie, nonché gli approcci microscopici per valutare la morfologia cellulare. Questi protocolli hanno lo scopo di fungere da base per l'adattamento alle esigenze e alle attrezzature disponibili. È importante sottolineare che vengono fornite note tecniche e altre considerazioni importanti per stabilire e monitorare le co-colture all'interno del laboratorio. Infine, sono inclusi esempi di alternative non proprietarie per l'analisi dei dati di file FCS⁶ grezzi utilizzando pacchetti Python. In sintesi, l'obiettivo è quello di rendere le tecniche di co-coltura basate sui cianobatteri più accessibili a un pubblico scientifico più ampio.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate su come impostare e quantificare le co-colture di S. elongatus secernente zucchero e specie di lievito modello eterotrofe. In generale, il protocollo è applicabile a tutte le specie di lievito suscettibili di manipolazione genetica.

1. Costituzione di co-colture che combinano cianobatteri fototrofi e lieviti eterotrofi

1. Preparativi per la co-coltivazione: Substrati e pre-coltivazione
   NOTA: Preparare tutti i terreni e le soluzioni madre utilizzando acqua filtrata ultrapura. Tutti i bicchieri (bicchieri dosatori, cilindri graduati, bottiglie di stoccaggio e fiasche da coltivazione) devono essere puliti e sterilizzati in autoclave. I terreni sterili possono essere conservati a temperatura ambiente (RT). Deve essere disponibile un dispositivo compatibile con i requisiti della coltivazione fotoautotrofica.
   1. Preparare il terreno di co-coltura almeno 3-4 giorni prima dell'inizio previsto della co-coltura. La maggior parte delle ricette di terreni di co-coltura sono variazioni del comune terreno BG-11⁷ utilizzato per la coltivazione di routine di molte specie modello di cianobatteri. Questo protocollo utilizza come esempio il mezzo CoYBG-11 precedentemente riportato (⁸; Vedere la tabella 1). L'autoclave (121 °C, 20 min) o il filtro sterilizzano (dimensione dei pori di 0,22 μm) il terreno preparato, a seconda dei casi.
      NOTA: Vedi la sezione Discussione per suggerimenti sull'adattamento di un mezzo appropriato per altri accoppiamenti di specie.
   2. Preparare reagenti molecolari: per l'induzione dell'espressione di cscB e l'esportazione di saccarosio ^9,10,11, preparare una riserva da 1 M di isopropil-β-tiogalattoside (IPTG).
      NOTA: L'uso di antibiotici durante la co-coltura non è ottimale, ma se tutti i ceppi sono dotati di cassette di resistenza, possono essere utilizzati. In tal caso, preparare le scorte di antibiotici in base alle esigenze dei ceppi impiegati.
   3. Preparare una precoltura di cianobatteri: almeno 3 giorni prima dell'inizio della co-coltura, trasferire le cellule da una precoltura del ceppo di cianobatteri che secernono zucchero che cresce nel terreno BG-11 in un pallone fresco contenente il terreno^{CoY BG-11} (Tabella 1).
      NOTA: Diverse specie e ceppi di cianobatteri sono stati modificati per secernere zuccheri. Per una rassegna completa delle varietà disponibili al momento della stesura di questo articolo, vedere⁴. Questo riferimento elenca anche specie eterotrofe (vedi 1.1.4) per le quali è stata precedentemente riportata la co-coltura cianobatterica.
      1. Misurare il OD₇₅₀ della precoltura. Calcolare il volume richiesto della precoltura per raggiungere una OD_{target di 750} di 0,3 (C₁) utilizzando l'equazione V₁ = C₂ x V₂/C₁ dove C₂ = OD target, V₂ = volume target e V₁ = volume richiesto di precoltura. Ad esempio, quando si inocula una coltura da 30 mL (V₂), la quantità x di coltura liquida da utilizzare è V_{: 1} (mL) = (0,3 x 30)/(OD₇₅₀ misurato).
         NOTA: La densità ottica è un'approssimazione della densità cellulare e dipende dalle condizioni di crescita e dalla morfologia cellulare; Pertanto, è necessario che i ricercatori utilizzino metodi per correlare la densità ottica al numero assoluto di cellule (vedere le sezioni 2.1, 2.2 e 2.3) per una corretta valutazione delle prestazioni della co-coltura. Per i cianobatteri, le lunghezze d'onda della luce all'interno dello spettro fotosinteticamente attivo (cioè 400-700 nm) non devono essere utilizzate per determinare la densità ottica perché vengono assorbite dalla clorofilla e da altri pigmenti; Pertanto, vengono utilizzate abitualmente lunghezze d'onda del rosso lontano (ad esempio, 750 nm).
      2. Incubare la coltura diluita in un apposito fotoincubatore. Incubazione tipica
         le condizioni per i cianobatteri modello sono le seguenti: 30 °C, 150 giri/min (lancio 25 mm), spazio di testa 2% CO₂ , ~200 μmol di fotoni ^m-2·^s-1 Illuminazione a LED, 75% di umidità.
         NOTA: L'integrazione con CO₂ è altamente raccomandata per ottimizzare la quantità di saccarosio rilasciato.
      3. Ripetere questo processo di diluizione ogni giorno per almeno 3 giorni prima di impostare la co-coltura in modo da garantire che i cianobatteri siano in crescita esponenziale. Ciò contribuirà a migliorare la coerenza nelle prestazioni di co-coltura tra esperimenti di giorni diversi.
   4. Almeno 2 giorni prima dell'inizio della co-coltura, preparare una precoltura eterotrofica. Come notato, un certo numero di specie e sottoceppi di lievito sono stati precedentemente coltivati in co-coltura con cianobatteri ^8,12,13.
      1. Trasferire le cellule in una diluizione 1:100 (250 μL) da una coltura liquida di specie eterotrofe che crescono in un brodo di coltura ricco (vedere Tabella 1) in 50 mL di terreno CoY^BG-11 integrato con 20 g/L di saccarosio in un pallone da 250 mL di deflettore.
      2. Incubare per una notte alla stessa temperatura utilizzata per le condizioni di coltivazione del partner cianobatterico.
   5. Controllare OD₆₀₀ almeno 24 ore prima del momento previsto per l'inoculo della co-coltura per assicurarsi che il ceppo eterotrofico sia cresciuto a sufficienza per le esigenze sperimentali (cfr. punto 1.2): diluire in terreno fresco per mantenere la crescita esponenziale, se necessario.
2. Co-coltura, inoculazione e mantenimento
   NOTA: Vedere la sezione Discussione per considerazioni sul rapporto di inoculazione tra i microrganismi foto- ed eterotrofi.
   1. Per l'inoculo della co-coltura, arricchire entrambe le precolture mediante centrifugazione.
      1. Calcolare il volume della sospensione cellulare concentrata per ottenere la densità iniziale desiderata per entrambe le specie utilizzando l'equazione standard C₁ x V₁ = C₂ x V₂ , dove C₁ = OD della coltura arricchita. Ad esempio, per realizzare una coltura di 25 mL di S. elongatus con un OD_{iniziale di 750} di 0,5 (da una coltura axenica di 1,5 OD) e S. cerevisiae con un OD_{iniziale di 600} di 0,05 (da una coltura axenica di 0,7 OD), sulla base dell'equazione di cui sopra, sono necessari 8,33 mL di coltura iniziale di S. elongatus , 1,79 mL di coltura eterotrofica arricchita, e 14,88 mL di terreno CoY^BG-11 .
      2. Centrifugare le colture utilizzando 13.000 x g per 10 minuti a RT. In condizioni sterili, decantare e gettare il surnatante.
         NOTA: Una forza centrifuga relativa inferiore (RCF; xg) può essere utilizzata per pellettare S. cerevisiae poiché sono cellule più grandi (2x-3x volte) rispetto a S. elongatus, ma fare attenzione che il surnatante diventi trasparente. Per la raccolta della biomassa cianobatterica si possono utilizzare anche meno di 13.000 x g , ma richiederebbe un tempo più lungo per la centrifugazione (ad esempio, 4.000 x g possono essere utilizzati per 20 minuti).
      3. Risospendere il pellet di cianobatteri in 25 mL di terreno sterile CoY^BG-11 . Utilizzare le stesse condizioni di centrifugazione di prima, in seguito, scartare e decantare il surnatante.
      4. Ripeti questo processo due volte per S. elongatus e altre 4 volte per S. cerevisiae.
         NOTA: È importante lavare i pellet di cianobatteri e l'eterotrofio (S. cerevisiae) per rimuovere i componenti residui del mezzo. Poiché S. cerevisiae cresceva in precedenza in presenza di saccarosio, l'aumento della quantità di fasi di lavaggio garantirà la rimozione di eventuali residui di zucchero.
      5. Una volta verificata la OD, combinare i volumi di S. elongatus e S. cerevisiae in un pallone da 250 mL in condizioni sterili e aggiungere CoY^BG-11 a un volume finale di 50 mL. Diluire dal brodo di 1 M di IPTG precedentemente preparato a una concentrazione finale di 1 mM (questo serve a indurre i cianobatteri a esportare saccarosio nel terreno). Per una coltura da 50 mL, utilizzare 50 μL dal brodo IPTG da 1 M.
         NOTA: I palloni deflettori sono generalmente migliori perché forniscono una migliore aerazione e miscelazione per i cianobatteri.
      6. Posizionare il pallone del passaggio precedente su un'illuminazione LED da 200 μmol di fotoni·^m-2·^s-1 integrata con il 2% di CO₂ a 30 °C con agitazione orbitale a 150 giri/min (lancio di 25 mm) e 75% di umidità.
         NOTA: Le condizioni sopra menzionate possono variare e devono essere ottimizzate in base al risultato sperimentale.
      7. Monitorare la crescita della coltura mediante campionamento sterile (1 mL) ogni 12 ore o 24 ore (vedere paragrafo 2). Opzionalmente, utilizzare i campioni per eseguire la microscopia standard su cellule vive e per determinare le unità formanti colonie (CFU¹⁴) di cellule di lievito su un terreno adatto per monitorare la morfologia e l'idoneità cellulare e per monitorare la quantità di cellule eterotrofe viventi e la contaminazione.
         NOTA: Le CFU non sono raccomandate come metodo per monitorare l'esatta densità cellulare delle specie cianobatteriche, che possono subire uno stress significativo nel passaggio dalla coltivazione nel terreno liquido a quello solido. Pertanto, dovrebbero essere scelte piastre di agar con un terreno ricco appropriato per la crescita delle specie di lievito partner, come l'estratto di lievito peptone destrosio (YEPD)¹⁵.

Composto chimico	BG-11 (concentrazione mg/L)	CoY BG-11 (concentrazione mg/L)
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
Acido citrico	6	6
Citrato ferrico di ammonio	6	6
EDTA (sale disodico)	1	1
Na2CO3	20	20
Composizione di tracce di metallo
H3BO3	2.86	2.86
ZnSO4·7H2O	0.222	0.222
Co(NO3)2 · 6H2O	0.0494	0.0494
MnCl2·4H2O	1.81	1.81
CuSO4 · 5H2O	0.079	0.079
NaMoO4·2H2O	0.39	0.39
Addizionale
HEPPSO	7160	7160
Lievito Azoto Base (YNB), senza amminoacidi, senza solfato di ammonio	–	3608, 120013
Agente di titolazione pH 8,3	KOH	KOH
KPO3	–	118
Saccarosio (solo per eterotrofi)	–	13690

Tabella 1: Composizione dei media di BG-11 e CoY^BG-11. Date le concentrazioni di lievito-azoto base, le concentrazioni di CoY^BG-11 sono derivate da risorse pubblicate ^8,12,13.

2. Strumenti e metodologia per monitorare la crescita delle co-culture

NOTA: Questo protocollo è una linea guida per l'analisi e il monitoraggio della co-coltura, da tecniche semplici ma ad alta intensità di lavoro come la microscopia e le camere di conteggio alle applicazioni ad alto rendimento come i contatori di particelle e la citometria a flusso a singola cellula. Oltre alla co-coltura vera e propria, è consigliabile includere colture axeniche dei singoli microrganismi per consentire un'analisi completa. Come punto di partenza generale per l'analisi, determinare la dimensione esterna delle impostazioni cultura. In questa sezione, vengono descritte in dettaglio diverse metodologie che possono essere utilizzate per convertire le misure relative della densità cellulare (cioè OD) in valori assoluti del numero di cellule per volume. La misurazione OD₇₅₀ viene spesso utilizzata per determinare la densità cellulare delle colture di cianobatteri (a causa dell'assorbimento di lunghezze d'onda di 400-700 nm), mentre OD₆₀₀ viene utilizzata per gli organismi eterotrofi. Entrambe le misurazioni forniscono valori indicativi approssimativi con unità arbitrarie. Si noti che i valori possono differire notevolmente tra gli strumenti.

1. Quantificazione microscopica con camere di conteggio
   NOTA: Le camere di conteggio (ad esempio, Neubauer (migliorato)/emocitometri) sono un mezzo semplice ed economico per determinare la composizione di co-colture composte da cellule che possono essere facilmente distinte morfologicamente, i.e., in base alla forma delle celle (Figura 1A). È costituito da un vetrino da microscopio in vetro spesso e da un vetro di copertura. Se il vetro di copertura è posizionato correttamente sulla parte superiore del vetrino, crea due camere di volume di precisione con griglie incise (Figura 1B-D). Contando un'area definita di una griglia, è possibile calcolare la concentrazione di celle di una sospensione. Le camere di conteggio sono disponibili in diverse profondità. A seconda dello spessore della cella, è necessario scegliere una profondità della camera adeguata. Per cellule fungine come U. maydis o S. cerevisiae, Una profondità di 0,1 mm funziona bene. Questa profondità della camera è troppo grande per le cellule più piccole come i cianobatteri e le cellule galleggiano nella camera. Una camera con una profondità di 0,02 mm è adatta sia per cianobatteri che per co-colture di cianobatteri e funghi.
   1. Assicurarsi che la camera di conteggio e il vetro di copertura siano privi di polvere e celle.
      NOTA: Si consiglia di pulire con etanolo al 70% (v/v) e fazzoletti privi di lanugine subito prima dell'uso.
   2. Per posizionare correttamente il vetro di copertura, farlo scorrere sulle due barre di supporto con una leggera pressione, ma fare attenzione per evitare rotture.
      NOTA: Per questa applicazione è necessario un vetro di copertura specifico e spesso (fare riferimento al manuale della camera). Poiché il vetro di copertura a volte si rompe durante il montaggio, è bene avere a portata di mano dei ricambi.
   3. Quando il vetro di copertura è posizionato correttamente, osservare i cosiddetti anelli di Newton (Figura 1B) tra le due superfici del vetro e che il vetro di copertura non scivoli più.
      NOTA: Un leggero respiro sul vetro di copertura prima del montaggio spesso migliora il risultato.
   4. Mescolare accuratamente la sospensione cellulare e applicare alcuni microlitri (~2-10 μL a seconda della profondità della camera) della sospensione cellulare sul bordo della camera e lasciarla riempire completamente tramite forza capillare. Utilizzare una diluizione appropriata della sospensione cellulare per consentire un conteggio affidabile, ad esempio ottenendo da 20 a 200 cellule per quadrato grande (Figura 1D, rettangolo rosso).
   5. Utilizzare un obiettivo appropriato (ad es. 10x) di un microscopio ottico (modalità campo chiaro o contrasto di fase) e mettere a fuoco le linee della griglia della camera di conteggio. L'orientamento è fornito dalla griglia. Inizia a contare le celle nei quadrati adatti alla dimensione della cella data.
      NOTA: Utilizzare un ausilio tecnico come un contatore portatile o un'applicazione per smartphone appropriata per il conteggio (ad esempio, "contacose" generico o app per emocitometro specializzate che forniscono funzioni estremamente utili). Definire una regola per il conteggio delle celle situate sui bordi della griglia per evitare doppi conteggi. Ad esempio, le celle situate sui bordi superiore e sinistro di ogni quadrato possono essere contate escludendo quelle sui bordi destro e inferiore. Esistono regole alternative¹⁶. Se si utilizza un microscopio a fluorescenza, le cellule possono essere distinte anche in base alla loro autofluorescenza o ai marcatori fluorescenti.
   6. Dopo aver contato, ad esempio, tutti e quattro i quadrati grandi negli angoli, determinare il valore medio per ogni tipo di cella. Con questi valori medi, l'area del quadrato utilizzato e la profondità della camera data (consultare le informazioni del produttore), calcolare le concentrazioni delle celle (vedere Risultati rappresentativi).
      NOTA: A seconda delle dimensioni della cella, è possibile utilizzare quadrati diversi per il conteggio. Per le cellule di lievito e cianobatteriche, i quattro grandi quadrati agli angoli funzionano bene (Figura 1D, rettangolo rosso).
   7. Dopo l'uso, pulire la camera tenendo conto dei requisiti dei campioni (ad esempio, inattivare in modo appropriato gli organismi geneticamente modificati).
2. Quantificazione con contatori di particelle
   NOTA: A seconda delle caratteristiche delle cellule in una co-coltura, è possibile applicare un contatore di particelle per determinare il numero di cellule dei partner. Per l'applicabilità di questo metodo, le cellule devono differire fortemente nelle loro dimensioni; Ad esempio, è possibile ottenere la discriminazione di cellule batteriche e di lievito. Le colture axeniche dei singoli microrganismi del consorzio devono essere incluse per consentire l'interpretazione dei risultati. Le co-colture che ospitano cellule di dimensioni simili o con più di 2 partner devono essere analizzate con la metodologia descritta nei paragrafi 2.1 o 2.3.
   1. Preparazioni
      1. Regolare il diametro esterno della coltura a 0,1 e diluire il campione di 1.000 volte con un tampone di misurazione isotonico (consultare il manuale del dispositivo) in un volume totale di 10 mL. Preparare i triplicati tecnici di tutti i campioni.
      2. Selezionare una dimensione dei pori del capillare adatta per l'esperimento.
         NOTA: La dimensione dei pori deve rientrare nell'intervallo delle cellule più piccole nella co-coltura, ma deve includere anche le cellule più grandi. Non andare troppo piccolo perché il poro potrebbe ostruirsi a causa dell'aggregazione cellulare, che può verificarsi a causa della divisione cellulare. Le dimensioni dei pori disponibili differiscono. Un capillare di 45 μm, ad esempio, inizia a rilevare cellule con un diametro di 0,7 μm. (U. maydis e S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
   2. Quantificazione di cellule in un contatore di particelle
      1. Avviare il dispositivo. Eventualmente, eseguire un autotest per il controllo qualità (consultare il manuale del dispositivo specifico).
      2. Caricare i campioni nelle coppe dei campioni, fissare il coperchio e mescolare il campione inclinando leggermente la tazza.
         NOTA: Cercare di evitare la formazione di schiuma e le bolle. Utilizzare sempre una tazza per ogni misurazione. Le tazze possono essere pulite e riutilizzate più volte. Gettare le coppette se ci sono residui che non possono essere rimossi. Se il campione rimane nella tazza per periodi più lunghi, mescolarlo nuovamente prima di misurare.
      3. Registrazione in un intervallo compreso tra 0 e 30 μm a causa del potenziale di aggregati cellulari rispetto alle singole cellule.
         NOTA: Innanzitutto, utilizzare ciascuna delle colture axeniche dei partner di co-coltura per avere un'idea delle dimensioni delle cellule e per determinare se possono essere distinte dalle loro dimensioni.
      4. Dopo la valutazione, determinare la composizione della co-coltura allo stesso modo.
3. Quantificazione del consorzio mediante citometria a flusso su singola cellula
   NOTA: La citometria a flusso su singola cellula è un metodo ad alto rendimento che può essere impiegato per determinare il numero di cellule dei singoli partner nella co-coltura, dato che i partner possono essere discriminati in base alle dimensioni/alle loro proprietà di diffusione della luce e/o alla fluorescenza. È importante sottolineare che per l'istituzione del metodo sono necessarie colture axeniche dei partner di co-coltura per analizzare le loro proprietà nel citometro e regolare di conseguenza i gate della popolazione. Per i ceppi che trasportano un reporter fluorescente, i ceppi senza il reporter fluorescente sono necessari come controlli negativi. Una familiarità di base con le applicazioni del citometro faciliterà l'implementazione di successo del protocollo seguente^{17,18,19,20,21}. In questo esempio, viene analizzata una miscela artificiale di 3 microrganismi (vedi Risultati rappresentativi): Synechocystis (che esprime un fluoroforo reporter citosolico, mVenus) e i due lieviti S. cerevisiae e U. maydis. Per una precisa discriminazione S. cerevisiae e U. maydis, sono stati introdotti marcatori di fluorescenza sotto forma di proteina fluorescente verde citoplasmatica (GFP) (U. maydis eGFP) e la proteina fluorescente rossa (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) utilizzando tecniche di clonaggio molecolare di base. Se possibile, i ceppi con integrazione genomica dei reporter dovrebbero essere preferiti per evitare la necessità di continue pressioni di selezione.
   1. Preparazione del campione
      1. Misurare l'OD delle colture in una determinata fase di crescita da analizzare.
      2. Regolare il diametro esterno dei campioni su un intervallo adatto alla misurazione. Utilizzare un OD₇₅₀ approssimativo di 0,05-0,5 per i cianobatteri e un OD₆₀₀ di 0,2-1,5 per il lievito utilizzando terreno di coltura fresco (volume finale: almeno 500 μL). Per le co-colture, puntare a un OD₇₅₀ compreso tra ~0,1 e 0,5 e registrare il fattore di diluizione. Per il calcolo, applicare la formula fornita nel passaggio 1.1.3.1. Ciò garantirà che la conta delle cellule rimanga in un intervallo compreso tra 1.000 e 10.000 cellule/s a una velocità di flusso di 10 μL/min (equivalente a 6.000 - 60.000 cellule/μL).
         NOTA: Per la diluizione, è possibile utilizzare terreni o tamponi senza autofluorescenza e particelle (ad es. BG-11). Prestare attenzione ai terreni contenenti ingredienti complessi come l'estratto di lievito che potrebbero presentarsi come particelle nella misurazione.
      3. Trasferire 300 μl di ciascuna sospensione di cella campione in un singolo pozzetto in una piastra da 96 pozzetti (pozzetto rotondo standard, trasparente, fondo piatto).
         NOTA: In alternativa, trasferire 0,5-2 mL in una provetta di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) se si utilizza la modalità campione semiautomatica invece della modalità di lettura delle piastre.
   2. Misurazione citometrica
      1. Avviare il citometro ed eseguire il programma di avvio e il controllo qualità (QC) secondo le istruzioni del produttore.
      2. Caricare (caricatore di lastre o campionamento semiautomatico) ed eseguire i campioni. Iniziare con i campioni di controllo utilizzando le colture axeniche di ciascun partner di co-coltura per identificare ogni specie in base alle loro proprietà prima di mirare a separarle in un campione di co-coltura.
      3. Grafici a punti aperti e/o istogrammi per i canali di fluorescenza e dispersione (ad esempio, diffusione diretta [FSC] o diffusione laterale [SSC] altezza [-H] o area [-A]) rilevanti per i campioni.
      4. Cerca la popolazione cellulare richiesta e regola la soglia per escludere il rumore tecnico e le piccole particelle dal mezzo.
         NOTA: Si consiglia di cercare la popolazione cellulare in un grafico a punti FSC-H su larghezza FSC o FSC-H su SSC-H e regolare la scala da lineare a logaritmica per piccole cellule come i batteri (tipicamente 1-3 μm). Impostare la soglia nel canale FSC-H o SSC-H. Per celle con diametro inferiore a 1 μm, utilizzare l'SSC viola (VSSC) nel laser viola a 405 nm per una migliore risoluzione.
      5. Regola manualmente il guadagno per ciascun canale di interesse su un intervallo compreso tra 25 e 2.500. Regolare i guadagni in modo tale che il controllo negativo (ad esempio, senza il marcatore fluorescente) sia compreso tra 1 x 10^2-1 x 10³ e il controllo positivo (ad esempio, con il marcatore fluorescente) sia compreso tra 1 x 10^5-1 x 10⁶ per ottenere la migliore separazione e rimanere nell'intervallo di 1 x 10^1-1 x 10⁷.
         NOTA: I guadagni standard del controllo qualità possono anche essere tenuti come un buon riferimento.
      6. Per determinare la concentrazione di cellule nel campione, registrare un volume di campione definito utilizzando la funzione di registrazione (ad esempio, 10 μL a una velocità di flusso di 10 μL/min). Successivamente, dividere la conta delle singole cellule misurata per questo volume per il volume registrato per ottenere una conta delle cellule per μL per ciascuna popolazione.
         NOTA: Tenere presente il fattore di diluizione iniziale quando si calcola la concentrazione di cellule nella coltura/campione.
   3. Gating/selezione di popolazioni cellulari
      NOTA: Indipendentemente dal dispositivo utilizzato per eseguire le misurazioni, l'analisi e il gating possono essere eseguiti nel software operativo del citometro o nel software di analisi commerciale come esemplificato di seguito²². Inoltre, l'analisi dei dati della citometria a flusso utilizzando software non proprietario può essere eseguita in modo efficiente con vari strumenti open source come FlowCytometryTools²³ o FlowKit, utilizzando FlowUtils²⁴ pacchetti in Python. Nello spirito della scienza aperta, questo protocollo condivide un JupyterNotebook esemplare che mostra l'uso di questi pacchetti per l'esplorazione dei dati di base. Naturalmente, i software alternativi possono essere ugualmente adatti per eseguire la bioinformatica della citometria a flusso²⁵.
      1. Selezionare determinate popolazioni cellulari disegnando i cancelli attorno ad esse in un grafico a punti o impostando segmenti di divisore o linea attorno ai picchi in un istogramma (Figura 4).
         NOTA: La funzione di auto-gate del programma può essere utilizzata come riferimento.
      2. Separare i segnali per gli organismi foto- ed eterotrofi in base all'autofluorescenza dell'organismo fototrofico (causata principalmente dalla clorofilla) nella regione rossa dello spettro. Esempio: utilizzare l'istogramma del canale APC-H (eccitazione (es.) a 638 nm, emissione (em.) a 660/10 nm) e impostare un divisore verticale tra il picco destro (fototrofico = popolazione positiva all'autofluorescenza della clorofilla) e il picco/i sinistro/i (eterotrofico = popolazione negativa all'autofluorescenza della clorofilla) (Figura 4A).
         NOTA: I marcatori fluorescenti possono anche essere utilizzati per distinguere due (o più) partner fototrofici all'interno della stessa coltura (ad esempio, mVenus per Synechocystis).
      3. Separare i due organismi eterotrofi in base ai loro marcatori fluorescenti o alle proprietà di scattering (FSC, SSC, se possibile).
         NOTA: La separazione basata sulle proprietà di dispersione è applicabile solo se le cellule hanno, ad esempio, dimensioni o morfologie diverse che si traducono in cambiamenti visibili nella dispersione (ad esempio, Sinecocisti: cellule sferiche con diametro di ~1,5-3 μm rispetto alle celle allungate di U. maydis con una lunghezza di 10 μm e circa 1-2 μm di diametro²⁶).
      4. Esempio: Utilizzare l'istogramma del canale FITC-H (es.: 488 nm, em.: 525/40 nm) che mostra solo la popolazione "eterotrofica" per distinguere tra le cellule eterotrofe contenenti GFP (es. U. maydis eGFP) e quelle senza GFP (es. S. cerevisiae RFP/mKate2) (Figura 4B). In alternativa, utilizzare l'istogramma del canale PC5.5-H (es.: 561 nm, em.: 710/50 nm) che mostra solo la popolazione "eterotrofica" per distinguere tra le cellule eterotrofe contenenti RFP (ad esempio, S. cerevisiae RFP/mKate2) e quelle senza RFP (ad esempio, U. maydis GFP) (Figura 4C).
         NOTA: Tenere presente che due (o più) tipi di celle diversi possono "attaccarsi" insieme durante la misurazione. Questi "doppietti" o "multipletti" possono essere facilmente rilevati nei dot plot di entrambi i marcatori fluorescenti (ad esempio, APC-H su FITC-H per identificare doppietti di fototrofi e partner eterotrofi marcati con GFP).
      5. Per l'analisi dei dati di base in Python, seguire le istruzioni in questo Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
         NOTA: Questo notebook supporta tre fasi di analisi dei dati. i) Importazione dati: Importazione di file FCS. ii) Eseguire il controllo di qualità: verificare l'integrità dei dati e il numero di eventi. iii) Visualizzare i dati: utilizzare grafici come istogrammi, grafici a dispersione e grafici di densità per visualizzare i dati. Inoltre, viene visualizzata la procedura per eseguire il gating per isolare le popolazioni di interesse che riproducono la Figura 4 .
         Per facilitare l'analisi delle co-colture in progetti a lungo termine, si raccomanda al ricercatore di utilizzare i metodi di cui sopra per contare il numero di cellule e creare curve standard per confrontare i valori di OD con la conta assoluta delle cellule. La densità ottica è una misura relativa che può variare in base alla specie, al ceppo, alle condizioni di crescita e allo spettrometro. Pertanto, la generazione di curve standard "in-house" è necessaria per la conversione accurata dei valori OD in numeri di celle.

Figura 1: Quantificazione microscopica di cellule morfologicamente distinguibili. (A) Una camera di conteggio Neubauer. (B) Gli anelli di Newton indicano il corretto posizionamento del vetrino coprioggetto speciale. (C) Rappresentazione schematica dell'architettura della camera con la cavità centrale di volume definito per il conteggio delle cellule. (D) La griglia della camera di conteggio Neubauer raffigurata è composta da nove grandi quadrati con una dimensione di 1 mm² (rosso). I quattro grandi quadrati agli angoli sono ulteriormente divisi in 16 quadrati (blu). Il grande quadrato centrale è diviso in 25 quadrati di gruppo con una dimensione di 0,04 mm² (arancione). Ogni quadrato di gruppo è composto da 16 quadrati più piccoli (verdi). La cifra è stata generata sulla base delle informazioni dei produttori disponibili pubblicamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Instaurazione di co-colture di S. elongatus fototrofico e lieviti eterotrofi
Abbiamo precedentemente riportato risultati dettagliati dalla co-coltivazione di Synechococcus elongatus PCC 7942 con una varietà di sottoceppi di S. cerevisiae. Per una descrizione completa dei risultati della co-coltura con questa coppia cianobatteri/lievito, vedere⁸. Per motivi di brevità e precisione, questi risultati non sono riprodotti qui. In breve, i risultati precedenti indicano una serie di considerazioni importanti per la creazione di co-colture cianobatteriche-lieviti a lungo termine. Di primaria importanza, la capacità del lievito di sopravvivere in condizioni in cui i cianobatteri forniscono le uniche forme di carbonio fisso dipende fortemente dall'efficienza con cui il ceppo di lievito può utilizzare il saccarosio. I ceppi di S. cerevisiae che sono stati evoluti o ingegnerizzati per metabolizzare in modo più efficiente il saccarosio^27,28 avevano maggiori probabilità di sopravvivere alla transizione alla modalità di crescita di co-coltura, hanno raggiunto densità cellulari più elevate e hanno mostrato una maggiore robustezza negli esperimenti di co-coltura cianobatterica a lungo termine (da giorni a settimane)⁸. La fase iniziale dell'inoculazione di una co-coltura è stata particolarmente importante per la vitalità del lievito, probabilmente a causa di stress dovuti alla diluizione della coltura, al cambio di composizione del terreno e/o al ritiro di una fonte di carbonio più concentrata. Pertanto, gli sforzi per facilitare la transizione da un terreno di coltura più ricco a una minima disponibilità di carbonio all'inizio della co-coltura possono migliorare le prestazioni e la coerenza sperimentale (vedi passaggio 1.2.1.1). Inoltre, S. cerevisiae ha mostrato risposte allo stress coerenti con l'iperossia quando inoculato in colture dense di S. elongatus, coerenti con la formazione di O₂ come sottoprodotto primario della fotosintesi ossigenata. Pertanto, gli sforzi per prevenire la crescita eccessiva del partner cianobatterico e/o l'alternanza di cicli di luce "giorno/notte" potrebbero estendere sostanzialmente la vitalità di S. cerevisiae in co-colture a lungo termine. Si veda la sezione Discussione per un ulteriore riassunto dei fenomeni comuni nelle co-colture relative ai campioni di controllo axenico.

Monitoraggio della crescita delle co-colture utilizzando diverse metodologie
Nella sezione seguente, viene descritta la quantificazione esemplare di un consorzio tripartito miscelato artificialmente di Synechocystis e dei due lieviti S. cerevisiae e U. maydis utilizzando tre diversi metodi. Per la miscela, OD₇₅₀ (per i cianobatteri) e OD₆₀₀ (per gli eterotrofi) di singole colture sono stati determinati e regolati a OD 0,1. Le singole colture sono state mescolate in un rapporto di 1:1:1 utilizzando la densità ottica (che è distinta dalla conta delle cellule, vedi sopra). Per facilitare la discriminazione dei lieviti nel citometro, i ceppi reporter di S. cerevisiae geneticamente modificato FY1679-O1B²⁹ che producono costitutivamente mKate2 citoplasmatico (genotipo: URA3Δ/pTDH3::mKate2; ceppo: S. cerevisiae mKate2³⁰) e il ceppo AB33³¹ di U. maydis che producono costitutivamente eGFP (genotipo: pep4Δ/pRpl40::egfp; ceppo: U. maydis eGFP³²). Da notare che il ceppo cianobatterico era dotato di un plasmide replicativo che promuoveva la forte espressione costitutiva della proteina fluorescente gialla mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, ceppo Synechocystis mVenus, simile a³³) e inoltre, mostra la tipica forte autofluorescenza dovuta alla presenza del macchinario fotosintetico.

Quantificazione microscopica mediante camere di conteggio: Tutti i tipi di cellule nella miscela artificiale utilizzata di tre microrganismi possono essere facilmente discriminati al microscopio (Figura 2A): Synechocystis e S. cerevisiae sono rappresentati da cellule sferiche che tuttavia differiscono notevolmente nel loro diametro (Synechocystis: diametro circa 1,5-3 μm, S. cerevisiae: diametro circa 3-6 μm), mentre le cellule U. maydis hanno una morfologia allungata, a forma di sigaro e una lunghezza di almeno 10 μm (Figura 2A). Questi chiari tratti morfologici consentono l'esatta quantificazione di ciascun partner della miscela. Come esempio illustrativo, 37, 18, 36 e 21 cellule di S. cerevisiae sono contate rispettivamente nei quattro grandi quadrati (Figura 2B). Il valore medio è di 28 celle. Poiché un grande quadrato dell'emocitometro utilizzato ha un'area di 1 mm² e la profondità della camera era di 0,02 mm, ciò si traduce in 28 cellule per 0,02 μL. Ciò corrisponde a 1.400 cellule/μL, che equivale a 1,4 x 10⁶ cellule/mL. Gli altri tipi di cellule sono stati contati e le concentrazioni sono state determinate di conseguenza (Figura 2C, Tabella 2).

Figura 2: Quantificazione microscopica di un consorzio tripartito costituito da Synechocystis e dai lieviti S. cerevisiae e U. maydis. (A) Immagine microscopica a contrasto differenziale (DIC) di una miscela combinata artificialmente dei microrganismi indicati. Tutte le specie possono essere facilmente distinte dalla loro morfologia. Barra della scala: 10 μm. (B) Risultati di conteggio esemplari per una miscela assemblata artificialmente dei ceppi indicati sulla base di colture axeniche con una OD di 0,1. Sono stati analizzati i quattro grandi quadrati ai bordi della griglia (segno rosso nella Figura 1D). (C) Il valore medio delle diverse celle contate nei quattro quadrati è stato utilizzato per calcolare la concentrazione delle cellule nella sospensione utilizzando la seguente equazione: Valore medio/(profondità della camera [0,02 mm] x dimensione del quadrato contato [1 mm²] x 1.000). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Quantificazione mediante contatori di particelle: I contatori di particelle determinano il numero di particelle in una sospensione in base alle loro dimensioni. Nel set di dati di esempio, è stato utilizzato un contatore di particelle con un capillare di 45 μm. Poiché le cellule di S. cerevisiae e U. maydis mostrano dimensioni simili, non possono essere distinte nel contatore di particelle, mentre le cellule più piccole di Synechocystis possono essere chiaramente separate. L'analisi delle singole colture mostra quindi picchi in posizioni identiche riferiti a 3-6 μm per i due lieviti (Figura 3A). Durante la misurazione, viene applicata una pressione negativa, che fa sì che le cellule entrino nel capillare. Questo cambia brevemente la resistenza elettrica in modo che il dispositivo possa determinare la dimensione delle particelle in base all'alterazione. Nella coltura mista, possono essere rilevati due picchi distinti, uno associato alle cellule cianobatteriche più piccole e l'altro che rappresenta una frazione congiunta delle due specie di lievito (Figura 3B). È importante sottolineare che, oltre ai picchi che riflettono le cellule viventi, sono stati rilevati ulteriori picchi a circa 1 μm (Figura 3), corrispondenti a detriti cellulari e particelle più piccole. I segnali che apparirebbero a diametri maggiori del previsto possono essere causati da aggregazioni cellulari. Da notare che la forma dei picchi riflette l'omogeneità delle cellule: un picco acuto mostra cellule molto omogenee, il che è improbabile per una co-coltura. In una co-cultura, ci si aspetta di vedere un picco molto ampio o anche due picchi se i partner della co-cultura sono chiaramente di dimensioni diverse. Per le colture axeniche di funghi eterotrofi, il picco potrebbe essere un picco medio largo.

Figura 3: Quantificazione di un consorzio tripartito costituito da Synechocystis mVenus e dai lieviti S. cerevisiae mKate2 e U. maydis eGFP utilizzando un contatore di particelle. (A) Output visivo delle analisi delle colture assiniche dei tre ceppi come indicato nei grafici (contatore cellulare con capillare da 45 μm). (B) File di output visivo esemplare per l'analisi del consorzio tripartito artificiale utilizzando condizioni identiche. Il contatore di particelle non supporta la discriminazione delle due specie di lievito che sono entrambe rappresentate dal secondo picco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Quantificazione mediante citometria a cellula singola: Con il citometro a flusso a cellula singola, è possibile distinguere facilmente le diverse popolazioni cellulari in base alle proprietà di (auto)fluorescenza e diffusione della luce. Le cellule fototrofiche (Synechocystis) possono essere differenziate dalle cellule eterotrofe (U. maydis e S. cerevisiae) in base all'autofluorescenza rossa dei pigmenti fotosintetici che viene misurata nel canale APC-H (Figura 4A). Sulla base di questa separazione iniziale di cellule fototrofe ed eterotrofe, le due popolazioni eterotrofe possono essere distinte in base ai loro marcatori fluorescenti eGFP nel canale FITC-H e mKate2 nel canale PC5.5 (Figura 4B, C). In un grafico a punti che mostra le proprietà di scattering di tutte e tre le popolazioni (FSC-H e FSC-Width), le popolazioni possono anche essere distinte con solo alcune sovrapposizioni minori delle popolazioni (Figura 4D).

Con questo metodo, 10 μL dei campioni diluiti sono stati analizzati con una velocità di flusso di 10 μL/min, consentendo una quantificazione di circa 70.000 cellule in 1 minuto. Circa il 60% di queste cellule è stato assegnato a Synechocystis (4,23 x 10⁶ cellule/mL), mentre il restante 40% è stato equamente distribuito tra U. maydis (1,35 x 10⁶ cellule/mL) e S. cerevisiae (1,36 x 10⁶ cellule/mL, Figura 4E, Tabella 2).

Figura 4: Quantificazione di un consorzio tripartito costituito dal cianobatterio Synechocystis mVenus e dai lieviti U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 utilizzando la citometria a flusso a singola cellula. Esempi di grafici ottenuti dopo la misurazione di una coltura mista di Synechocystis mVenus (verde scuro), U. maydis eGFP (verde chiaro) e S. cerevisiae mKate2 (rosso) in un rapporto di 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ su un citometro (A) che mostra un istogramma del conteggio degli eventi e della fluorescenza nel canale APC-H (es.: 638 nm, em.: 660/10 nm) di tutte le cellule utilizzate per differenziare le cellule fototrofe ed eterotrofe in base alla loro autofluorescenza. (B) Un istogramma del conteggio degli eventi e della fluorescenza nel canale FITC-H (es.: 488 nm, em.: 525/40 nm) di tutte le cellule eterotrofe utilizzate per differenziare le cellule mKate2 di U. maydis eGFP e S. cerevisiae in base alle loro proprietà di fluorescenza verde. (C) Un istogramma del conteggio degli eventi e della fluorescenza nel canale PC5.5-H (es.: 561 nm, em.: 710/50 nm) di tutte le cellule eterotrofe utilizzate per differenziare le cellule mKate2 di U. maydis eGFP e S. cerevisiae in base alle loro proprietà di fluorescenza rossa. (D) Un grafico a punti dei segnali di scattering nell'ampiezza FSC sul canale FSC-H utilizzato per identificare le popolazioni cellulari senza proprietà di fluorescenza. (E) Le statistiche della popolazione, compresi i conteggi degli eventi, le percentuali, le medie aritmetiche e le deviazioni standard (SD) dei canali di fluorescenza pertinenti. La quantità totale di cellule, insieme alle loro dimensioni e fluorescenze, è stata determinata in un volume di 10 μL con una velocità di flusso di 10 μL/min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per visualizzare comparativamente l'output dei diversi metodi di quantificazione, i numeri di cella determinati sono presentati nelle due tabelle seguenti (Tabella 2 e Tabella 3). Le concentrazioni finali delle cellule determinate utilizzando i tre metodi precedentemente descritti sono in un intervallo simile per tutti i metodi. Il citometro fornisce la dimensione massima del campione, seguita dal contatore di particelle e dalla quantificazione microscopica, con una diminuzione di circa un ordine di grandezza tra i metodi.

Co-cultura 1:1:1		Fotometro	Citometro		Contatore di particelle		Camera di conteggio per microscopia
Organismo		OD750/600	Conteggio delle celle	cellule/mL	Conteggio delle celle	cellule/mL	Conteggio delle celle	cellule/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1,36 x 106	1,546*	2,58 x 106*	112	1,40 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1,35 x 106			89	1,11 x 106
PCC 6803 mVenus		0.0333	42,330	4,23 x 106	3,094	5,16 x 106	271	3,39 x 106

Tabella 2: Confronto tra i diversi metodi di quantificazione: Coltura mista artificiale. Si noti che U. maydis e S. cerevisiae non possono essere distinti utilizzando un contatore di particelle (*).

Singola cultura		Fotometro	Citometro		Contatore di particelle		Camera di conteggio per microscopia
Organismo		OD750/600	Conteggio delle celle	cellule/mL	Conteggio delle celle	cellule/mL	Conteggio delle celle	cellule/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3,89 x 106	1,928	3,21 x 106	403	4,03 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3,69 x 106	2,465	4,11 x 106	307	3,07 x 106
PCC 6803 mVenus		0.1	127,864	1,28 x 107	8,186	1,36 x 107	428	1,07 x 107

Tabella 3: Confronto tra i diversi metodi di quantificazione: Taratura con colture singole/axeniche.

Discussione

La manipolazione di microrganismi in singole colture axeniche in un contesto di laboratorio è stata stabilita da decenni per molti modelli microbici. Tuttavia, sebbene la forma di vita prevalente in natura sia costituita dalle comunità microbiche, la combinazione di due o più partner in un unico vaso di coltivazione è meno consolidata e le sfide sono presentate da lacune nelle conoscenze e nella metodologia esistenti. È anche più difficile prevedere il comportamento delle cellule in una comunità, poiché le interazioni emergenti e lo scambio di metaboliti sorgono tra le cellule, influenzando fortemente il destino della co-coltura^34,35. Pertanto, l'instaurazione della co-coltura non è banale, anche a livello di definizione dei terreni di crescita, l'identificazione di condizioni di crescita comuni, lo scambio interspecie di metaboliti/segnali in tracce e la composizione della co-coltura risultante nel tempo. I progressi degli ultimi anni nell'assemblaggio di cianobatteri fototrofi secernenti zucchero con partner eterotrofi hanno ora permesso di dedurre prime regole e metodologie che possono fornire una linea guida utile per la progettazione di nuove coppie di co-coltivazione. Sulla base di tali conoscenze, nella prima parte di questo protocollo viene fornita una linea guida passo dopo passo per l'assemblaggio di co-colture contenenti un cianobatterio a secrezione di saccarosio e uno o più lieviti.

Una considerazione fondamentale quando si tenta per la prima volta di stabilire una co-coltura tra microbi non imparentati è la composizione di un terreno di coltura comune che soddisfi tutti i requisiti nutrizionali per le due o più specie. A causa di limitazioni di spazio, non è possibile fornire un protocollo completamente dettagliato per questo processo, che potrebbe anche richiedere un elevato grado di personalizzazione in alcuni casi, ma quanto segue delinea invece considerazioni importanti da tenere a mente. Un approccio iniziale semplice prevede il confronto del tipico terreno di crescita cianobatterico (ad esempio, BG11; vedi Tabella 1) con qualsiasi terreno minimo stabilito composto per le specie eterotrofe di interesse. L'integrazione del terreno cianobatterico standard con eventuali componenti mancanti contenuti all'interno del terreno minimo eterotrofico è un buon punto di partenza per i test iniziali ^8,36. Tenete presente che, poiché i terreni minimi sono spesso integrati con una fonte significativa di carbonio organico per la crescita eterotrofica (ad esempio, 1%-4% di glucosio), sono spesso progettati per supportare una densità cellulare eterotrofia più elevata di quella che è probabile ottenere negli esperimenti iniziali di co-coltura. Allo stesso modo, alcuni componenti comuni del mezzo possono anche fungere da fonte di carbonio organico indipendentemente dal fotosintetizzato fornito dal partner cianobatterico (ad esempio, citrato), il che può complicare la successiva analisi delle co-colture cianobatteri/eterotrofe. Pertanto, potrebbe non essere necessario integrare il terreno cianobatterico minimo con la piena concentrazione di elementi mancanti durante la progettazione di un terreno di co-coltura. Ad esempio, molti organismi variano nella loro efficienza di utilizzo di diverse forme di azoto ambientale (ad esempio, N₂, nitrato, nitrito, urea) e possono essere completamente incapaci di utilizzare alcune delle fonti di azoto più ossidate. Allo stesso modo, molti microbi possono richiedere l'integrazione di vitamine essenziali (ad esempio, vitamina B₁₂), cofattori o aminoacidi essenziali perché mancano di percorsi biosintetici completi per la sintesi diretta di questi composti. Per questi motivi, può essere più pratico iniziare semplicemente "fondendo" il mezzo minimo stabilito del partner cianobatterico (ad esempio, BG11) insieme a un mezzo minimo ben definito dell'eterotrofio (ad esempio, sintetico definito [SD]). Cicli successivi di rimozione/riduzione ripetuta dei componenti superflui possono essere utilizzati per ottimizzare il mezzo e ridurre l'abbondanza di eventuali composti che possono essere inibitori della crescita di uno dei partner. Un utile punto di partenza è quello di tamponare il terreno a un pH neutro o leggermente basico, poiché queste tendono ad essere le condizioni preferite dalla maggior parte delle specie modello di cianobatteri.

A questo punto, è spesso utile condurre test preliminari della crescita dell'eterotrofio supportato nel nuovo terreno di co-coltura quando viene fornito un eccesso di saccarosio. Naturalmente, quando si seleziona un potenziale eterotrofo, è importante sceglierne uno che sia in grado di catabolizzare la fonte primaria di carbonio organico che verrà fornita dal partner cianobatterico. È utile notare qui che il saccarosio, come carboidrato dominante fornito in molte colture cianobatteriche/eterotrofe ingegnerizzate⁴, non è un carboidrato universalmente utilizzato dai microbi eterotrofi come il glucosio: i trasportatori di saccarosio dedicati devono essere codificati dalle specie eterotrofe o possono essere necessarie invertasi extracellulari per convertire il saccarosio in fruttosio e glucosio che sono spesso riconosciuti dai trasportatori a più alta affinità⁸. Un'osservazione importante comunemente riportata da più laboratori che studiano comunità microbiche miste è che emergono sinergie e antagonismi di ordine superiore tra i partner fototrofi ed eterotrofi ^4,8,13. Ad esempio, altri metaboliti naturalmente secreti (ad esempio, acidi organici, forme ridotte di azoto) o cofattori (ad esempio, siderofori) possono consentire tassi di crescita più elevati di uno o entrambi i partner se coltivati nello stesso terreno rispetto ai controlli axenici. Al contrario, è stato riportato che sottoprodotti metabolici potenzialmente dannosi, come l'iperossigenazione del mezzo mediante scissione fotosintetica dell'acqua, causano l'inibizione della crescita interspecie per uno o entrambi i partner⁸. Pertanto, i controlli axenici possono fornire un utile punto di riferimento, ma le prestazioni di co-coltura possono variare dalle aspettative a causa di queste proprietà emergenti.

A seconda del partner eterotrofico e delle capacità di S. elongatus di espellere saccarosio (in base al livello di induzione, alla concentrazione di IPTG utilizzata), dovrebbero essere testati rapporti diversi di entrambi gli organismi. Il successo delle colture dipende principalmente dalla capacità di S. elongatus di mantenere la crescita del partner eterotrofico (cioè, può produrre abbastanza fonte di carbonio). Mentre la crescita eccessiva del ceppo eterotrofico è tipicamente limitata dalla mancanza di carbonio organico fornito nella composizione del terreno di co-coltura, i cianobatteri possono superare l'eterotrofio, il che può portare a interazioni inibitorie emergenti (ad esempio, condizioni iperossiche ^8,13). Quando si tenta inizialmente di determinare i rapporti appropriati di densità cellulare per il cianobatterio: lievito, una buona regola approssimativa è che il partner cianobatterico può sostenere un volume cellulare uguale delle cellule eterotrofe che lo accompagnano. Poiché i lieviti eucariotici tendono ad avere volumi cellulari considerevolmente maggiori rispetto ai cianobatteri modello che secernono saccarosio, ciò può probabilmente significare che la densità delle cellule cianobatteriche sarà considerevolmente più alta (ad esempio, 50-100 volte per S. cerevisiae) in uno stato stazionario. Pertanto, un buon punto di partenza quando si imposta una nuova co-coltura con il laboratorio specifico del ricercatore e le condizioni della specie sarebbe quello di calcolare il volume cellulare medio sia per il cianobatterio che per il lievito (sulla base di valori pubblicati; ad esempio, vedi B10NUMB3R5³⁷) per stimare il rapporto volumetrico. I palloni iniziali possono essere seminati con questo rapporto di cellule. Per esplorare lo spazio delle soluzioni, il ricercatore potrebbe voler mantenere costante la concentrazione di cianobatteri (ad esempio, OD₇₅₀ = 0,3) variando la concentrazione di cellule di lievito verso l'alto o verso il basso di circa un ordine di grandezza in incrementi basati sulla produttività consentita dallo spazio di coltivazione fototrofico disponibile del ricercatore. Naturalmente, questa "regola empirica" volumetrica dipende dalla velocità con cui il partner fototrofico è in grado di secernere fotosintetizzati organici (ad esempio, saccarosio) che possono essere utilizzati dal partner eterotrofo. Una volta stabilite le condizioni di co-coltivazione, un attento monitoraggio delle prestazioni di crescita di entrambi i partner nel tempo fornirà dati preziosi sui rapporti ideali tra le specie, soprattutto se le co-colture precoci possono essere mantenute per giorni o settimane, consentendo così al ricercatore di identificare il rapporto allo stato stazionario raggiunto verso la fine di una co-coltura. Queste informazioni possono essere utilizzate quando si seleziona la densità di inoculazione iniziale per ciascuna specie partner in esperimenti successivi per aiutare la coltura a raggiungere più rapidamente il rapporto di specie ideale autodeterminato.

Nella seconda parte del protocollo, vengono fornite istruzioni dettagliate per l'analisi della co-coltura. Una quantificazione affidabile delle co-colture è la chiave per la loro implementazione di successo: la crescita (o almeno l'attività metabolica) del partner fototropico che secerne carbonio è essenziale per sostenere gli eterotrofi. Mentre il rapporto cianobatteri/eterotrofi utilizzato per inoculare la coltura potrebbe non essere sempre critico per l'ottimizzazione, poiché le co-colture a lungo termine tendono a convergere verso proporzioni stabili, potrebbe essere importante integrare metodi per controllare la crescita sfrenata di entrambi i partner attraverso la diluizione della coltura o l'incapsulamento di una o più specie 36,38,39,40. Come accennato in precedenza, i sottoprodotti del partner cianobatterico possono essere inibitori dell'eterotrofio ad alte concentrazioni (ad esempio, O₂) e alcuni prodotti del metabolismo eterotrofico possono anche essere dannosi per la salute dei cianobatteri. La maggior parte delle co-colture pubblicate utilizza eterotrofi che hanno un tasso di crescita più rapido rispetto alla maggior parte delle specie cianobatteriche modello; Pertanto, il tasso di crescita eterotrofico tende ad essere limitato dall'apporto di carbonio organico prodotto dal cianobatterio. Ciononostante, la determinazione delle dinamiche di abbondanza delle specie nel tempo è un valore critico per chiarire i fallimenti nella stabilità e ottimizzare le co-colture robuste nelle coltivazioni a lungo termine.

Vengono forniti protocolli per la quantificazione mediante camere di conteggio, contatori di particelle e citometria a flusso a cellula singola. Tutte le tecniche sono strumenti preziosi per la caratterizzazione delle co-culture, ma con diversi prerequisiti, vantaggi e limitazioni. Le camere di conteggio sono ampiamente applicabili per la quantificazione in co-coltura, a condizione che tutti i partner della coltura possano essere distinti visivamente dalla forma delle cellule o da altre proprietà. Il grande vantaggio è il prezzo contenuto di questo dispositivo, tale da renderlo praticamente realizzabile per ogni laboratorio. Oltre alle informazioni sulla composizione della co-coltura e sul rapporto tra i diversi partner, è possibile ottenere un'impressione della morfologia e della fitness della cellula e rilevare potenziali contaminanti. Tuttavia, l'applicazione della camera di conteggio richiede molto tempo, comporta un carico di lavoro elevato e può supportare solo una bassa produttività.

Sia i contatori di particelle che la citometria a flusso a cellula singola offrono gli enormi vantaggi di un'elevata produttività e di una gestione comoda e veloce. Mentre il contatore cellulare si basa su chiare differenze nelle dimensioni delle cellule dei partner nella co-coltura, la citometria a singola cellula può anche discriminare le etichette di fluorescenza, con conseguente capacità di quantificare le co-colture con più di due membri della stessa dimensione o anche due mutanti diversi dello stesso organismo sulla base di diversi marcatori fluorescenti. Nell'esempio fornito di un assemblaggio artificiale di Synechocystis con S. cerevisiae e U. maydis, i reporter di fluorescenza intracellulare mKate2 ed eGFP sono stati utilizzati per discriminare i due lieviti. Gli stessi reporter fluorescenti potrebbero anche essere utilizzati per distinguere due ceppi geneticamente modificati dello stesso organismo (ad esempio S. cerevisiae) che non potrebbero essere separati solo in base alle loro proprietà di diffusione della luce. Strategie simili sono state implementate per rintracciare i consorzi batterici sintetici⁴¹. A seconda del tipo di cellula, del numero di partner in un consorzio e della loro potenziale gamma di autofluorescenze, la selezione dei marcatori fluorescenti richiede un'attenzione particolare per evitare la sovrapposizione delle qualità spettrali, in particolare date le proprietà autofluorescenti dei cianobatteri. ⁴²

Sosteniamo qui come aderire ai principi guida FAIR in termini di archiviazione, gestione e condivisione dei dati scientifici. FAIR è un acronimo che sta per Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable⁴³. Man mano che questi principi ottengono una più ampia accettazione, promettono di trasformare il panorama della ricerca biologica, promuovendo un approccio più aperto, collaborativo ed efficiente alla gestione e all'uso dei dati. Sebbene le componenti critiche dell'accessibilità possano essere garantite depositando i dati su un contesto di ricerca annotato (ARC)⁴⁴, è importante consentire la riproduzione delle fasi di elaborazione dei dati con un software ad accesso aperto. I file FCS grezzi memorizzano sia i dati che i metadati (informazioni su laser e rivelatori, comprese lunghezze d'onda, filtri, ecc.) sugli esperimenti di citometria a flusso⁴⁵. Possono essere caricati e letti al di fuori del software proprietario che consente un'analisi sofisticata dei dati, ad esempio, sono disponibili un certo numero di pacchetti per lavorare con i dati grezzi all'interno dell'ambiente Python. Il pacchetto sviluppato dimostra come caricare, leggere e visualizzare file .fcs grezzi contenenti dati citometrici al di fuori del software proprietario utilizzando uno dei tanti pacchetti disponibili in Python²³. L'utilizzo di software aperti come quello descritto sopra elimina la necessità di costosi costi di licenza associati al software proprietario, fornisce il pieno controllo sull'elaborazione dei dati (ad esempio, trasformazione, compensazione, gating) e consente inoltre l'integrazione di numerosi strumenti in un unico posto.

Un prezioso vantaggio aggiuntivo dell'utilizzo della citometria a cellula singola in combinazione con un selezionatore di cellule è l'opportunità di raccogliere anche cellule di un tipo distinto mediante FACS. Questo può essere estremamente prezioso per l'applicazione di qualsiasi tecnologia -omica per approfondimenti dettagliati sull'interazione delle specie all'interno della co-cultura, come RNASeq o metabolomica. L'evidente svantaggio di questi dispositivi è il loro prezzo elevato, quindi l'accessibilità e la disponibilità di tali macchine potrebbero essere una limitazione apparente in alcuni laboratori.

È interessante notare che un confronto diretto dei metodi presentati per la quantificazione dei tre partner di un consorzio ha rivelato un'ottima concordanza tra le diverse tecniche, indicando che la miscela che è stata assemblata sulla base di misurazioni OD è quantificata in modo affidabile da tutti i metodi descritti. È interessante notare che il numero totale di cianobatteri era circa 3-4 volte superiore al numero delle due specie di lievito, un fenomeno probabilmente dovuto alle loro dimensioni cellulari più piccole. Questa osservazione è in buon accordo con la conoscenza comune che gli OD non forniscono informazioni sul numero effettivo di celle senza calibrazione⁴⁶. I lieviti, tuttavia, hanno mostrato conteggi a un livello comparabile (Tabella 2 e Tabella 3). Inoltre, il confronto con la quantificazione delle singole colture dimostra che tutti e tre i metodi sono strumenti affidabili per discriminare i tipi di cellule, ad eccezione del contatore di particelle che non ha separato le due specie di lievito.

In sostanza, le applicazioni di citometria a singola cellula sono chiaramente lo strumento più potente per monitorare la composizione delle co-colture, consentendo il conteggio di 1.000-10.000 cellule al secondo. Ciò è particolarmente vero se il numero di partner aumenta a più di due o se i partner sono simili per forma e/o diametro. In particolare, ci sono molte alternative che consentono il monitoraggio delle co-colture. La crescita di microbi marcati in fluorescenza nelle co-colture può, ad esempio, essere monitorata continuamente dalla fluorimetria o dai microbioreattori⁴⁷. Tuttavia, questi sono spesso limitati a una co-coltura di due partner e richiedono un'attenta progettazione sperimentale, ad esempio nella scelta dei marcatori di fluorescenza. Il sequenziamento degli ampliconi (sequenziamento dell'rRNA 16S) e altre tecniche di sequenziamento di nuova generazione in combinazione con una sofisticata bioinformatica sono un'altra opzione per la caratterizzazione delle comunità sintetiche 48,49,50. Queste tecniche sono adatte per approcci ad alto rendimento e possono affrontare interazioni consolidate in coltivazioni a lungo termine, questioni evolutive o tracciamento di mutazioni con più partner microbici.

Nel loro insieme, le co-colture microbiche semplicistiche che sono progettate razionalmente forniscono un potente approccio "dal basso verso l'alto" per interrogare le dinamiche inter-specie che possono essere più difficili da affrontare all'interno di comunità multi-specie che dominano il mondo naturale 51,52,53. In questo documento, viene fornito un protocollo semplificato che può essere prontamente adattato dalla comunità scientifica per la creazione e l'analisi di nuove coppie di cianobatteri e partner eterotrofi. È evidente che sono necessarie molte ricerche sia per capitalizzare le potenziali intuizioni fondamentali che possono essere ottenute dalle co-colture microbiche artificiali, sia per determinare se i consorzi microbici progettati sinteticamente possono eguagliare il potenziale spesso attribuito loro in letteratura per le applicazioni biotecnologiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo 10x Ph1	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm Filtro passa-banda	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	Filtro FITC (in laser a 488 nm)
Filtro passa-banda 660/10 nm	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	Canale APC (in laser a 638 nm)
Filtro passa-banda 710/50 nm	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 canali (in laser a 561 nm)
Accuvette per Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Coppe per campioni con coperchi
Tubo di apertura 30 μ M per Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760
Autoclave	Lab Associates	EQM-ARBP	per la sterilizzazione di materiale
Palloni deflettori ROTILABO®, collo dritto, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 componenti	diversi fornitori		vedi Tabella 1
Filtro sterile per flacone	Sigmaaldrich	Z222593	a terreni sterili se non si desidera utilizzare l'autoclave
Capillary 45 & micro; m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Cell Counter Modello TTC	Schaerfe Systems
Tazze CASY	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	Soluzione detergente
CASYton Soluzione	Omni Life Science	OLS 5651808	Soluzione isotonica
Provette da centrifuga (50 mL)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	per l'alimentazione di cianobatteri colture axeniche e co-colture
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Soluzione di pulizia profonda
Vetro di copertura 20 & 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Vetro di copertura per camera di conteggio
Cuvette	Sarstedt	67.742
Cianobatteri BG-11 Soluzione d'acqua dolce	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		Software applicativo per citometro
CytoFLEX Sheath Fluid	Beckman Coulter, Inc.	B51503	per fluido di sheat
CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.		Detergente BE51180
DxH per Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	Soluzione detergente
Eppendorf tube centrifuge (small)	Labstac	CEN16-15	per centrifugare meno di 2mL di coltura
Etanolo	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
FACS provette	Beckman Coulter, Inc.	2523749	tubi per la modalità semiautomatica
FlowClean Cleaning Agent, 500ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Soluzione di pulizia quotidiana
Cilindri graduati	Sigmaaldrich	Z131121	per la preparazione di terreni
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron fotoincubatore	Infors AG		luce LED bianca
IPTG	Merck KGaA	I6758	Preparare le aliquote, conservare a -20° C, scongelare e tenere sul ghiaccio
Isoton II per Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	Soluzione isotonica
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Software di analisi dei dati citometrici
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Tessuti privi di lanugine
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
Becher di misurazione	VWR	213-3747
Piastra per microtest, 96 pozzetti, coperchio slip-on, base piatta, PS, trasparente	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Base per microscopio	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Testa per microsope	Carl Zeiss AG	47 30 14
Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q	Merck Millipore	C85358
Contatore di particelle Mulitisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	B23005	Alternativa al contatore di celle CASY
Neubauer migliorato, profondità 0,02 mm	Assistent Germany		Camera di conteggio
Neubauer migliorata, profondità 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Camera di conteggio
Pronto all'uso Daily QC Fluorospheres	Beckman Coulter, Inc.	C65719	Riferimento per bottiglie QC
SCHOTT	Dutscher	90347	per la conservazione
Specord® 200 Plus Spettrofotometro	Analitico Jena GmbH		OD600/750
Saccarosio	Merck KGaA	84100
Centrifuga da tavolo (grande)	Labstac	CEN18-06R	raccogliere biomassa di coltura
Lievito Base azotata, senza aminoacidi, senza solfato di ammonio	Thermo Fisher Scientific Inc.