Disegni microfluidici di laminazione in polietilene tereftalato a basso costo per l'imaging multiplexato di zebrafish

Sommario

Un metodo innovativo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici utilizzando la laminazione in polietilene tereftalato (PET) riduce significativamente il costo e la complessità dell'intrappolamento e dell'imaging di più embrioni vivi di pesce zebra.

Abstract

Gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e quindi particolarmente adatti per l'imaging intravitale non invasivo di processi fondamentali, come la guarigione delle ferite e la migrazione delle cellule immunitarie. I dispositivi microfluidici sono utilizzati per l'intrappolamento per supportare l'imaging a lungo termine di organismi multicellulari, incluso il pesce zebra. Tuttavia, la fabbricazione di questi dispositivi utilizzando la litografia morbida richiede strutture specializzate e competenza nella stampa 3D, che potrebbero non essere accessibili a tutti i laboratori. Il nostro adattamento di un metodo di laminazione in polietilene tereftalato a basso costo sviluppato in precedenza per la costruzione di dispositivi microfluidici aumenta l'accessibilità consentendo la fabbricazione e l'iterazione del progetto per una frazione dell'investimento tecnico delle tecniche convenzionali. Utilizziamo un dispositivo realizzato con questo metodo, il Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), per consentire il trattamento farmacologico, le ferite manuali e l'imaging a lungo termine di un massimo di quattro embrioni nello stesso campo visivo. Con questo nuovo design, siamo riusciti a catturare le caratteristiche morfologiche macroscopiche del segnale del calcio intorno all'ablazione laser e alle ferite di trassezione manuale per più embrioni nelle 2 ore immediatamente successive alla lesione, nonché il reclutamento dei neutrofili sul bordo della ferita per 24 ore.

Introduzione

La capacità di rispondere adeguatamente alle lesioni è fondamentale per la sopravvivenza di ogni organismo su ogni scala, da una singola cellula a più tessuti. La ferita e le sue risposte associate, come il reclutamento dei fagociti nelle aree danneggiate¹ sono, quindi, argomenti significativi nella biologia cellulare e tissutale. Le ferite vengono rilevate immediatamente dopo la rottura della barriera tissutale, causando una risposta del gradiente tissutale che coinvolge la contrazione della ferita ^2,3 che coordina la guarigione della ferita e la successiva ricrescita⁴. A causa della natura meccanica di questa contrazione, gli strumenti utilizzati durante la sperimentazione non devono ostacolare fisicamente il movimento delle cellule vicino al sito della lesione.

Gli embrioni di zebrafish sono un modello eccellente per studiare lo sviluppo e la malattia, compresa la risposta della ferita dei vertebrati, grazie alla loro facilità di cura, trattabilità genetica e trasparenza ottica ^5,6. Tuttavia, è necessario immobilizzare l'intero organismo per un periodo prolungato per studiare il comportamento a lungo termine delle cellule vicino a un sito di lesione. L'inclusione di embrioni in agarosio a basso punto di fusione è sufficiente per l'imaging a breve termine di tessuto non ferito. Tuttavia, la matrice di gel circostante limita la contrazione e il rilassamento delle ferite e impedisce la crescita degli embrioni in via di sviluppo nel tempo ^7,8,9.

I dispositivi microfluidici possono immobilizzare embrioni di zebrafish in diversi stadi di sviluppo 10,11,12,13,14,15,16 e alcuni, come lo zWEDGI 7, possono ospitare l'avvolgimento manuale. Tuttavia, ci sono diversi svantaggi nei design dei dispositivi disponibili. Ad esempio, molti dispositivi stampati direttamente su plastica sono incompatibili con l'imaging su sistemi di microscopio invertito a causa della scarsa trasparenza ottica. Inoltre, i canali paralleli consentono l'imaging multiposizionale^10,11, ma il movimento fisico del tavolino del microscopio introduce un ritardo nell'acquisizione dell'immagine. L'iterazione e l'ottimizzazione ripetute per risolvere questi problemi sono difficili se si considera l'investimento finanziario e tecnico richiesto per ogni nuovo progetto, in particolare per gli attuali metodi gold standard di fabbricazione di dispositivi che utilizzano la litografia morbida in polidimetilsilossano (PDMS). Il primo passo, la creazione di uno stampo master, richiede spesso la conoscenza del software di modellazione 3D, l'accesso ad attrezzature di fabbricazione specializzate e (a seconda del materiale utilizzato) un ulteriore trattamento antiaderente come la silanizzazione prima che lo stampo venga utilizzato. L'indurimento del PDMS una volta versato richiede almeno un'ora ad alte temperature e, generalmente, deve essere eseguito sotto vuoto o con una pinza per ottenere i migliori risultati, spesso in una camera bianca ^7,17,18. Come nella biologia dello sviluppo, questi costi possono rivelarsi rapidamente proibitivi per esperimenti che richiedono molti ambienti microfluidici unici su più modelli.

Tra i materiali da costruzione alternativi disponibili, il polietilene tereftalato (PET) è durevole, atossico e facile da manipolare. I fogli in PET sono buste di laminazione in plastica ampiamente disponibili nella maggior parte dei negozi di forniture per ufficio, con adesivo attivato termicamente preapplicato (generalmente etilene vinil acetato). Modellando questi fogli di PET utilizzando taglierine artigianali disponibili in commercio (ad esempio, plotter da taglio controllati da computer progettati per gli artigiani domestici) e facendo aderire gli strati l'uno all'altro utilizzando apparecchiature di laminazione termica standard, è possibile generare e iterare rapidamente un'ampia gamma di potenziali progetti. Abbiamo quindi adattato un metodo di progettazione e costruzione precedentemente descritto che coinvolge il PET¹⁸ impilato per creare l'Astativo razionale per ilmaging D anio Idi Subsequent Healing (RADISH) (Figura 1A, B). Una disposizione rotazionale di diversi canali di contenimento a forma di cuneo ottimizza la prossimità e lascia spazio per la transezione manuale della pinna caudale, l'imaging immediatamente dopo la ferita e l'imaging simultaneo a lungo termine di più embrioni di pesce zebra feriti all'interno dello stesso campo visivo. Inoltre, questo metodo di costruzione riduce drasticamente i costi di capitale iniziali e il tempo necessario per la costruzione del dispositivo, mantenendo al contempo la riutilizzabilità.

Protocollo

Questo studio ha utilizzato embrioni 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), ma può essere progettato per utilizzare embrioni da 2 a 14 dpf. L'esperimento del pesce zebra è stato condotto secondo standard accettati a livello internazionale. Il protocollo per la cura e l'uso degli animali è stato approvato dal Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), aderendo alle linee guida per l'utilizzo del pesce zebra nel programma di ricerca intramurale NIH (numero di protocollo: 1401001018).

1. Assemblaggio del dispositivo microfluidico PET

NOTA: Qualsiasi parte di questo protocollo può essere messa in pausa in qualsiasi momento, ad eccezione dei passaggi 1.8 e 1.9, che sono sensibili al tempo di asciugatura del cianoacrilato.

1. Progetta il modello per il dispositivo nel software scelto (ad esempio, Adobe Illustrator, Figura 1A). A seconda dell'età e delle dimensioni dell'embrione, regolare la larghezza del canale e le dimensioni della camera di imaging centrale per una migliore vestibilità.
   1. Salva ogni livello come un singolo file immagine con dimensioni identiche. Assegnare un nome a ciascun file in modo che lo spessore del foglio da utilizzare e l'ordine di assemblaggio siano evidenti.
2. Inizializzare la macchina da taglio secondo le istruzioni del produttore.
3. Carica ogni modello progettato sul software di progettazione per il taglio.
   1. Nell'area di lavoro di progettazione, seleziona i disegni appena caricati. Raggruppare i modelli destinati allo stesso spessore di foglio di PET nello stesso taglio (Figura 2A). Se necessario, regolare nuovamente le dimensioni dei modelli nel software di progettazione alle dimensioni corrette.
   2. Confermare il numero e il tipo di motivi nel taglio, quindi selezionare il materiale tagliato.
      NOTA: I fogli di PET potrebbero non essere una scelta di materiale nel software di progettazione, anche con nomi come "busta di laminazione in plastica". È possibile selezionare qualsiasi materiale di spessore e consistenza simili (ad esempio, fogli trasparenti o vinile non adesivo).
   3. Fissare i fogli di PET al tappetino da taglio, premendo con decisione per rimuovere le bolle d'aria, e caricare il tappetino nella macchina da taglio. Seguire le istruzioni sullo schermo per richiedere alla macchina da taglio di iniziare il taglio.
   4. Rimuovere i tagli finiti dal tappetino da taglio. Se necessario, regolare i modelli di taglio utilizzando un taglierino o una lama per bisturi.
      NOTA: I file immagine utilizzati per creare il design del ravanello (Figura 1A) sono disponibili per il download come formati di file vettoriali e PNG (File supplementare 1). Se la macchina da taglio si solleva, si strappa o non riesce a tagliare in modo netto il foglio di PET, prendere in considerazione la sostituzione del tappetino da taglio.
4. Allineare gli strati sul vetrino coprioggetti, senza assistenza o con crocini di registro pretagliati. Se è possibile fissare più strati insieme prima della laminazione, allinearli contemporaneamente.
5. Fissare gli strati con del nastro adesivo per ufficio per evitare che si spostino durante la laminazione (Figura 2B). A seconda delle dimensioni del dispositivo e della capacità della plastificatrice, montare i modelli piccoli su un supporto più grande con più nastro adesivo per evitare di inceppare o intasare l'alimentazione della plastificatrice (Figura 2C).
   NOTA: Il supporto utilizzato nella laminazione NON è lo stesso del tappetino da taglio e serve principalmente a fornire trazione alla plastificatrice. Qualsiasi materiale resistente al calore di spessore trascurabile funzionerà come supporto (inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, cartoncino, carta da ufficio piegata o un foglio di PET più grande).
6. Accendere la plastificatrice e laminare secondo le istruzioni del produttore. Rimuovere il nastro adesivo prima di allineare lo strato successivo (Figura 2D).
7. Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.6 fino a quando tutti i livelli non sono stati rispettati.
8. Fissare il dispositivo a un piatto da 35 mm praticato con un foro da 3/4" utilizzando colla cianoacrilica (Figura 2E, F). Regolare la forma e il tipo di piatto in base alle esigenze sperimentali (ad esempio, qualsiasi contenitore abbastanza grande da ospitare il dispositivo: un pozzetto in una piastra a 24 pozzetti o una piastra di Petri più grande). Usa abbastanza colla per sigillare completamente il dispositivo al piatto senza allagarlo.
   NOTA: Il fissaggio del dispositivo a un piatto di supporto non è necessario per il funzionamento del dispositivo. ATTENZIONE: Il cianoacrilato lega pelle e occhi in pochi secondi e irrita il sistema respiratorio, gli occhi e la pelle. Indossare protezioni per mani e occhi e lavorare in un'area ben ventilata.
9. Impermeabilizzare il laminato PET rivestendo accuratamente i bordi esterni del dispositivo con colla cianoacrilica (Figura 2F). Usa abbastanza colla per coprire completamente i bordi esterni. Lasciare indurire la colla per almeno 2 ore prima dell'uso.
   NOTA: Garantire uno spazio adeguato per lo sfiato dei fumi di cianoacrilato. L'accumulo di fumi può causare il deposito di cianoacrilato sul dispositivo, oscurando il materiale otticamente trasparente.

2. Posizionamento degli embrioni all'interno del RAVANELLO e preparazione per l'imaging

1. Allevare embrioni di pesce zebra nel terreno standard per l'allevamento di embrioni E3¹⁹. Se necessario, decorionare gli embrioni almeno 1 ora prima dell'imaging per consentirne l'appiattimento. Questo esperimento ha utilizzato embrioni a 3 dpf, ma gli embrioni possono arrivare fino a 14 dpf (Figura 1E).
2. Colorare o trattare gli embrioni in base alle esigenze sperimentali.
   NOTA: In questi esperimenti, le membrane cellulari dello strato epiteliale esterno sono state colorate, se necessario, incubando con 100 nM di MemGlow 560.
3. Anestetizzare gli embrioni con 164 mg/L MS-222²⁰.
   NOTA: L'esatta concentrazione e l'anestetico utilizzati possono essere regolati in base alle preferenze dello sperimentatore. La concentrazione di anestetico può essere ridotta per consentire uno sviluppo efficace durante le immagini a lungo termine (vedere il passaggio 4.1).
4. Riempire il contenitore contenente il dispositivo montato con 5 mL di E3 contenente 164 mg/L di MS-222.
5. Utilizzando una pipetta di trasferimento, depositare un embrione anestetizzato in ciascuna camera di contenimento del dispositivo. Assicurarsi che gli embrioni rimangano immersi nel liquido per tutta la durata dell'imaging.
   NOTA: Il design RADISH può immobilizzare 1-4 embrioni.
6. Utilizzando un anello per capelli, orientare gli embrioni in modo tale che la coda dell'embrione sporga nella camera di imaging centrale e il tuorlo sia saldamente immobilizzato nel canale a forma di cuneo (Figura 1C).
   NOTA: L'orientamento degli embrioni può essere eseguito con uno stereomicroscopio per facilitare la manipolazione.
7. Se lo si desidera, fissare la testa dell'embrione aggiungendo l'1,5% di agarosio a basso punto di fusione nella camera di contenimento utilizzando una micropipetta.
8. Spostare il dispositivo con gli embrioni nel sistema di imaging scelto per iniziare l'imaging.

3. Imaging dei transitori di calcio dopo la ferita

NOTA: Questa sezione e la sezione 4 sono facoltative e fornite come potenziali esperimenti di esempio.

1. Selezionare il sistema e l'obiettivo appropriati per l'imaging.
   NOTA: Qui, un confocale a scansione laser invertita è stato dotato di un obiettivo 20x.
2. Regolare la messa a fuoco del campione e i parametri di imaging (ad esempio, potenza laser: 5, guadagno: 90, dimensione del foro stenopeico: 2 UA, tempo di esposizione [velocità di scansione: 1 fotogramma/s]) per un rapporto segnale/rumore e una velocità di acquisizione ottimali.
   NOTA: Si consiglia di prefocalizzare i campioni e di regolare i parametri per ciascun canale del sistema di imaging scelto prima dell'avvolgimento per ridurre il ritardo tra la formazione della ferita e l'acquisizione dell'immagine.
3. Ferita un embrione Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821,22.
   1. Per ferire l'embrione tramite transezione manuale, applicare una pressione con una lama di bisturi sul tessuto della pinna caudale sulla punta della notocorda sotto uno stereomicroscopio (Video 1), quindi rimettere il dispositivo sul tavolino.
      ATTENZIONE: L'applicazione di una pressione eccessiva con la lama del bisturi può rompere il vetro sottostante. Se il vetro si rompe, gettare il dispositivo e ricominciare dal passaggio 1.2.
   2. Per ferire l'embrione tramite stimolazione laser, definire una regione di interesse (ROI) vicino al bordo della piega della pinna caudale e stimolare in base alla potenza laser disponibile.
      NOTA: In questo caso, una potenza laser di 2,4 W per 30 s a 800 nm era sufficiente per indurre una ferita a tutto spessore.
4. Immagine a temperatura ambiente utilizzando i canali GFP (eccitazione 488 nm, emissione 510 nm) e RFP (eccitazione 561 nm, emissione 610 nm) utilizzando un intervallo di fotogrammi di 1 min per un totale di 1 ora.
5. (Facoltativo): se necessario, rilasciare gli embrioni per il prelievo dopo l'imaging tramite aspirazione delicata vicino alla testa utilizzando una pipetta di trasferimento o facendo roteare il piatto.

4. Imaging del reclutamento dei neutrofili dopo la ferita

1. Almeno 1 ora prima dell'imaging, trasferire gli embrioni in E3 contenente metà della concentrazione standard di anestetico, in questo caso 82 mg/L MS-222.
2. Selezionare l'obiettivo appropriato per l'imaging (in questo caso, un confocale a scansione laser invertita dotato di un obiettivo 10x).
3. Regolare la messa a fuoco del campione e i parametri di imaging (ad esempio, potenza laser: 5, guadagno: 90, dimensione del foro stenopeico: 2 UA, tempo di esposizione [velocità di scansione: 0,5 fotogrammi/s])) per un rapporto segnale/rumore e una velocità di acquisizione ottimali.
   NOTA: Si consiglia di prefocalizzare i campioni e di regolare i parametri per ciascun canale del sistema di imaging scelto prima dell'avvolgimento per ridurre il ritardo tra la formazione della ferita e l'acquisizione dell'immagine.
4. Avvolgere quattro embrioni Tol2(mpx:Dendra2)²³ tramite trassezione manuale applicando pressione con una lama di bisturi sul tessuto della pinna caudale sotto uno stereomicroscopio, quindi riportare il dispositivo sul tavolino.
5. Cattura l'immagine sul canale GFP (eccitazione 488 nm, emissione 510 nm) a temperatura ambiente utilizzando un intervallo di fotogrammi di 5 minuti per 24 ore.
6. Se necessario, rilasciare gli embrioni per il recupero dopo l'imaging tramite aspirazione delicata vicino alla testa utilizzando una pipetta di trasferimento o facendo roteare il piatto.

Risultati

Per il confronto della qualità dell'immagine prodotta da un confocale a scansione laser con e senza l'ausilio del RADISH, gli embrioni che esprimono il biosensore intensiometrico di calcio GCaMP6f^22,24 nello strato epiteliale esterno sono stati colorati utilizzando MemGlow 560 e riprodotti con un confocale a scansione laser invertita che copre l'intero spessore della piega della pinna caudale a un intervallo di tempo di 1 minuto per fotogramma (Video 2). Senza il dispositivo (Figura 3A), i campioni si spostavano in modo significativo e mostravano artefatti di bande, derivanti dalla limitazione dello Z-stack a 25 fette per adattarsi alla risoluzione temporale specificata rispetto all'imaging con il dispositivo (Figura 3B). Il RADISH è stato inoltre utilizzato per esaminare i transitori di calcio immediatamente dopo la ferita negli embrioni che esprimono Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821, evidenziando la E-caderina endogena in rosso e il calcio citoplasmatico nell'epitelio apicale in verde. Gli embrioni sono stati feriti parallelamente ai lati della camera centrale utilizzando una lama di bisturi (Figura 4A e Video 3) o mediante ablazione laser diretta con un laser IR (Figura 4B), quindi ripresi attraverso l'intero spessore della piega della pinna caudale.

Per dimostrare l'efficacia del RAVANELLO per l'imaging a lungo termine, abbiamo studiato il reclutamento delle cellule immunitarie sul bordo della ferita per 24 ore dopo la ferita. Quattro embrioni di zebrafish a 3 dpf che esprimono Tol2 (mpx:Dendra2) per marcare i neutrofili in verde²³ sono stati feriti mediante transsezione della coda e sottoposti a imaging per 24 ore consecutive (Figura 5). Gli artefatti di imaging tipicamente associati agli embrioni tardivi da 3 dpf a 4 dpf, come l'inclinazione e il galleggiamento, erano notevolmente assenti (Video 4) e la ricrescita dei tessuti è continuata senza ostacoli per l'esperimento. Il reclutamento dei neutrofili sul bordo della ferita continua per tutta l'immagine (Figura 5B), con la maggior parte delle cellule in migrazione che se ne vanno entro 24 ore dalla ferita (Figura 5C), in linea con la risoluzione dell'infiammazione prevista^25,26.

Figura 1: Progettazione e utilizzo del dispositivo microfluidico in laminato PET (RADISH). (A) Schema che illustra la disposizione e lo spessore dei singoli strati di PET, l'assemblaggio, il montaggio e l'uso del dispositivo. (B) Prodotto finale, montato in un ritaglio da 3/4" in un piatto da 35 mm. (C) 3 embrioni dpf, (D) 5 embrioni dpf, (E) 14 embrioni dpf alloggiati all'interno del dispositivo. Barre di scala = 1.000 μm (C,D,E). Abbreviazioni: PET = polietilene tereftalato; RADISH = assistente rotazionale per l'imaging Danio della guarigione successiva; DPF = giorni dopo la fecondazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione fotografica passo dopo passo dell'assemblaggio del dispositivo in PET. (A) Singoli strati di PET prima della laminazione. (B) Strato di PET fissato al vetrino coprioggetti da 25 mm utilizzando nastro adesivo per ufficio. (C) Dispositivo in corso fissato a un supporto di plastica per la laminazione. (D) Dispositivo laminato in PET completato. (E) Piatto da 35 mm modificato prima del montaggio del dispositivo. (F) Dispositivo completato. Abbreviazione: PET = polietilene tereftalato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Miglioramento della qualità delle immagini confocali a scansione laser di 3 embrioni dpf nel design RADISH. (A) Immagine rappresentativa di 3 embrioni dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) colorati con MemGlow 560 senza l'uso del RADISH. (B) Immagine rappresentativa dell'embrione Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) colorato con MemGlow 560 montato nel RAVANELLO. Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: RADISH = Assistente rotazionale per l'imaging Danio della guarigione successiva; DPF = giorni dopo la fecondazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Compatibilità del design del ravanello con molteplici tecniche di ferimento. (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt18 embrione ferito tramite transezione manuale della pinna caudale. (B) Embrione ferito mediante ablazione laser. (C, D) Gli stessi embrioni 4 minuti dopo, mostrando la progressione dei transitori di calcio dopo la ferita. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: RADISH = Assistente rotazionale per l'imaging Danio della guarigione successiva; DPF = giorni dopo la fecondazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Intrappolamento a lungo termine di embrioni per l'imaging della migrazione dei fagociti. (A) Gli embrioni Tol2(mpx:Dendra2) immediatamente dopo la ferita e gli stessi embrioni (B) 25 minuti, (C) 12 ore e (D) 24 ore dopo. Barre di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: file vettoriali e PNG per la progettazione di dispositivi RADISH come mostrato nella Figura 1A. Clicca qui per scaricare questo file.

Video 1: Video in campo chiaro della transezione manuale della pinna caudale utilizzando il design del dispositivo RADISH. Abbreviazione: RADISH = Assistente rotazionale per l'imaging Danio della guarigione successiva. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Confronto tra embrioni Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) non montati e montati della Figura 3, acquisiti a 1 fotogramma/min. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Transitori di calcio in embrioni Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt18 feriti mediante transezione con bisturi o ablazione laser dalla Figura 4, acquisiti a 1 fotogramma/min. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Imaging a lungo termine del reclutamento leucocitario e della rigenerazione della pinna caudale in embrioni di Tol2(mpx:Dendra2). Abbreviazioni: RADISH = Assistente rotazionale per l'imaging Danio della guarigione successiva; HPW = ore dopo la ferita. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

La premessa principale del metodo di laminazione del PET prevede la riduzione dei costi e la minimizzazione delle barriere tecniche all'ingresso rispetto ai mezzi tradizionali di creazione di dispositivi microfluidici, come la litografia morbida o lo stampaggio PDMS. Pertanto, gli unici passaggi critici di questo protocollo sono l'allineamento accurato degli strati di PET durante la laminazione e l'impermeabilizzazione dei bordi del dispositivo dopo la costruzione. Tutte le altre parti del metodo possono essere modificate in base alle esigenze sperimentali (ad esempio, se è richiesta l'immobilizzazione di embrioni più giovani o più vecchi, lo spessore degli strati di PET può essere regolato per restringere o allargare il canale di conseguenza). I disegni possono essere creati in qualsiasi forma e laminati su qualsiasi materiale di base, purché il materiale sia resistente al calore e abbastanza sottile da poter essere inviato attraverso il laminatore^18,27. Poiché i fogli di PET vengono tagliati utilizzando taglierine artigianali disponibili in commercio, che leggono file di immagini bidimensionali piuttosto che tridimensionali, la progettazione e l'iterazione di un determinato dispositivo richiedono solo la capacità di manipolare forme in bianco e nero in un programma di editing di immagini, riducendo drasticamente la difficoltà. Questa flessibilità nella scelta del software e la disponibilità commerciale dei materiali utilizzati rappresentano un notevole aumento dell'accessibilità dei dispositivi microfluidici in generale, consentendone l'uso in qualsiasi laboratorio o aula per un costo iniziale inferiore a $ 500 al momento della stesura di questo articolo, rispetto agli oltre $ 2000 in costi iniziali dell'attrezzatura per la fabbricazione di stampi PDMS¹⁷.

Inoltre, il tempo necessario per creare un singolo dispositivo utilizzabile utilizzando questo metodo è drasticamente ridotto rispetto alla tipica litografia morbida. Supponendo che si conosca il software richiesto, un dispositivo microfluidico laminato in PET unico può essere concettualizzato, prodotto e immediatamente utilizzato in ~3 ore, compreso il tempo di polimerizzazione del cianoacrilato. L'iterazione richiede ancora meno, a seconda della scala delle modifiche necessarie ai file di progettazione originali, ed è possibile realizzare più dispositivi varianti in parallelo con un investimento minimo di tempo aggiuntivo e senza attrezzature aggiuntive. Sebbene i dispositivi creati con questo metodo siano meno durevoli di quelli realizzati con PDMS per una serie di motivi (tra cui il guasto dell'adesivo e le sollecitazioni interne per forme con molti strati e rapporti di aspetto lunghi), la loro natura economica e la fabbricazione scalabile significano che sono molto più facili da sostituire. Poiché le taglierine artigianali commerciali sono commercializzate con la capacità di ripetere lo stesso taglio preciso più e più volte e il PET non ha una data di scadenza, i singoli strati di un progetto completato possono essere pre-preparati in blocco per l'assemblaggio e l'uso in qualsiasi momento in futuro, riducendo ulteriormente l'investimento di tempo complessivo richiesto.

Tuttavia, la velocità e la variabilità vanno a scapito della precisione. Il limite principale della laminazione in PET rispetto allo stampaggio PDMS tradizionale è la risoluzione spaziale. I tagliatori artigianali commerciali spesso lottano con angoli acuti su forme più piccole di circa 500 μm e i fogli di laminazione in PET non sono disponibili con spessori inferiori a 33 μm (escluso lo spessore dell'adesivo stesso, che non è incluso nella misura sulla confezione), limitando significativamente la scala in cui questa tecnica può essere applicata. Il numero massimo di strati è limitato anche dalle dimensioni del laminatore, che possono variare da produttore a produttore.

La versione finale del protocollo, comprese le variazioni nella tecnica di registrazione e allineamento, i fornitori di materiali e il software, dipenderà in gran parte dalle preferenze dell'utente. Tuttavia, l'accessibilità e la flessibilità complessiva del metodo riducono i costi di adattamento. I singoli utenti sono incoraggiati a iterare quanto necessario per adattare l'approccio alle loro esigenze specifiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetro di copertura rotondo da 25 mm di diametro #1 spessore	Chemglass Life Sciences	CLS-1760-025	Materiale di montaggio della base. Lo spessore è stato scelto in base alle specifiche della lente del microscopio.
Adobe Illustrator v28.5	Adobe	N/A	Editor vettoriale per la progettazione del modello del dispositivo.
Cloruro di calcio diidrato	Fisher	C79	Per fare il terreno E3
Design PNG Files (Online Mirror)	N/A	N/A	br/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39	Cricut	N/A	Software proprietario per guidare il cutter artigianale.
Fusion Plus 7000L	GBC	1703098	Laminatore termico. Questo modello specifico è stato selezionato per le caratteristiche di qualità della vita, come la dimensione massima della pila di fogli.
Lama premium in carburo tedesco	Cricut	10396595	Lama di ricambio per taglierina artigianale.
Set di strumenti di base grigio	Cricut	10307854	Set di strumenti per tagli da diserbo, tappetini per la pulizia e il montaggio di fogli in PET. Facoltativo.
Cloruro di magnesio esaidrato	Acros 223211000 organico		Per fare E3 medium.
Maker 3	Cricut	10669040	Taglierina artigianale. La Cricut Maker 3 è stata scelta rispetto alla Silhouette Cameo 4 per la facilità d'uso del software, ma qualsiasi taglierina artigianale in grado di leggere immagini in bianco e nero funzionerà.
MemGlow 560	Citoscheletro	MG02-10	Colorante a cellule vive rosse per membrane cellulari. Non è necessario alcun lavaggio. Utilizzato nella Figura 3.
N. 22 Lama per bisturi in carbonio	Design chirurgico	22-079-697	Lama per bisturi per regolazioni manuali del taglio. Funzionerà anche qualsiasi coltello artigianale simile (ad esempio, il coltello X-acto #2).
Cloruro di potassio	Fisher	BP366	Per fare E3 medio.
Cloruro di sodio	Fisher	BP358	Per la produzione di terreno E3
Tappetino da taglio adesivo StandardGrip	Cricut	10138842	Tappetino di montaggio per taglierina artigianale. Anche il tappetino da taglio LightGrip funzionerà, ma evita i tappetini da taglio StrongGrip e FabricGrip poiché la forza dell'adesivo potrebbe deformare il taglio finale durante il diserbo e la rimozione. L'adesivo sui tappetini alla fine si consumerà con l'uso continuato; Sostituire i tappetini secondo necessità.
Nastro adesivo 12 mm	Deli	30014	Nastro per ufficio. Il marchio di gastronomia è stato scelto tramite test per la facilità di rimozione dopo la laminazione.
Super colla,	Loctite		liquida 1364076 Colla cianoacrilica. La colla utilizzata deve essere liquida. Le formulazioni in gel non sigillano o impermeabilizzano sufficientemente i bordi del dispositivo.
Buste di laminazione termica in PET,	Scotch	TP3854	con adesivo termico. Le lenzuola arrivano a coppie e devono essere separate prima dell'uso. Tagliare con il lato adesivo rivolto verso il basso.
Buste di laminazione termica in PET,	Scotch	TP5854	con adesivo termico. Le lenzuola arrivano a coppie e devono essere separate prima dell'uso. Tagliare con il lato adesivo rivolto verso il basso.
Tricaina (MS-222)	Syndel	IC10310680	Anestetico per pesci.