Il protocollo mostra un nuovo modello sperimentale in vitro in grado di ricapitolare la biologia di due tipi di linee cellulari aderenti con un'impalcatura tridimensionale (3D) stampata. Vengono descritte la costruzione di questo modello e le procedure operative, dalla preparazione e coltura cellulare all'analisi e valutazione.
Articolo metodologico
Modello di co-coltura che utilizza due tipi di linee cellulari aderenti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'impianto dell'embrione è influenzato dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule nell'interfaccia madre-embrione. Le comunicazioni dirette e indirette tra i vari tipi di cellule all'interno della decidua sono cruciali per regolare la ricettività endometriale; Tuttavia, i meccanismi molecolari che mediano questa interazione non sono ancora chiari. A questo proposito, è necessario un modello per studiare il processo di impianto per stabilire un modello in vitro completo in grado di ricapitolare la biologia dell'interazione tra epitelio endometriale e stroma. Questo modello è composto da normali piastre per colture cellulari e da un'impalcatura corrispondente, generata dalla stampa tridimensionale (3D) da materiali a basso costo. Qui, descriviamo in dettaglio una serie di protocolli per la costruzione del modello, la preparazione delle cellule, la semina delle cellule, la coltura cellulare, l'osservazione e la valutazione. Inoltre, abbiamo incluso risultati rappresentativi con cellule che mostrano buone condizioni di crescita al microscopio. Questo studio mirava a sviluppare modelli in vitro che imitassero l'interazione tra le cellule stromali endometriali e le cellule epiteliali, nonché tra le cellule del trofoblasto e le cellule endometriali.
Introduzione
Nonostante le ricerche approfondite sulla gravidanza umana, i meccanismi molecolari all'interfaccia materno-fetale durante l'impianto e l'inizio della gravidanza rimangono poco conosciuti1. L'endometrio umano è composto principalmente da due tipi di cellule: cellule epiteliali endometriali (EEC) e cellule stromali endometriali (ESC). L'impianto progredisce attraverso tre fasi: apposizione, attaccamento e invasione, che portano allo sviluppo di un embrione competente e di un endometrio ricettivo2. Considerando i vincoli etici degli studi in vivo su soggetti umani, nonché le difficoltà nel simulare completamente la condizione umana negli animali, la costruzione di modelli di coltura dell'endometrio umano in vitro è diventata un mezzo efficace per replicare i processi di impianto e di gravidanza precoce3. Questi modelli sono preziosi per studiare sia le gravidanze normali che quelle patologiche e forniscono una piattaforma fondamentale per la sperimentazione preliminare e la convalida degli interventi terapeutici nella medicina traslazionale.
Le camere commerciali sono state ampiamente utilizzate nella ricerca biologica cellulare. Queste camere offrono preziose informazioni sulla migrazione cellulare e sulla diafonia tra diversi tipi di cellule. Tuttavia, le camere commerciali sono in genere monouso e possono essere costose4.
Un gran numero di modelli di coltura umana in vitro costituiti da endometrio e blastocisti, o surrogati di blastocisti, sono stati sviluppati per comprendere meglio il processo dettagliato dell'impianto. Questi modelli, tuttavia, sono ancora nella loro fase iniziale di applicazione poiché la struttura 3D è una configurazione sperimentale molto complicata e alcuni mezzi di differenziazione specifici sono costosi 5,6,7.
L'uso di hardware di stampa 3D a prezzi accessibili e un periodo di produzione relativamente breve consentono di adattare le strutture per diversi scopi sperimentali. Le tecniche di stampa 3D aiutano a ridurre i costi di tempo e consentono la creazione di strutture complesse e personalizzate. Questa tecnologia accelera in modo significativo la progettazione e l'iterazione del prototipo, rendendola uno strumento prezioso per i ricercatori in vari campi, consentendo loro di completare il loro lavoro in modo più efficiente 8,9,10.
Qui, presentiamo un protocollo sperimentale fattibile ed economico per la costruzione della struttura 3D e il suo utilizzo come sistema di coltura cellulare, in grado di simulare l'interazione tra cellule stromali ed epiteliali endometriali per lo studio della ricettività endometriale durante l'impianto dell'embrione. Ciò fornisce un'alternativa personalizzabile e a basso costo per il materiale usa e getta commerciale.
Protocollo
NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, tutti i fluidi sono stati pre-bilanciati a 37 °C prima dell'uso.
1. 3D stampa del ponteggio e costruzione del modello
NOTA: I passaggi qui riportati sono stati eseguiti secondo il manuale della macchina da stampa 3D in metallo commerciale. I passaggi sono brevemente descritti di seguito (File supplementare 1).
- Stampa il livellamento del piano
- Tocca l'icona Menu sulla dashboard e vai su Utilità. Selezionare Livello piano per avviare la routine di livellamento.
- Rimuovere il foglio di stampa dal piano di stampa e selezionare Fine. Il piano di stampa salirà alla sua altezza massima in preparazione per il livellamento. Una volta che la barra di avanzamento raggiunge il 100%, premi Start.
- Se la stampante Metal X non è stata livellata in precedenza, selezionare Ripristina. In caso affermativo, scegli Salta e procedi direttamente al passaggio 1.1.5 (la scansione a 16 punti).
- Utilizzare una chiave esagonale da 2,5 mm per ruotare tutte le viti di livellamento a tre letti in senso orario finché non sono serrate. Quindi, allentarli ruotandoli in senso antiorario di due rotazioni complete per impostarli a un'altezza del punto medio. Premere Fine per continuare.
- La stampante eseguirà la scansione del letto in 16 punti designati. Astenersi dal toccare il letto o il telaio durante questo processo. Una volta che l'avanzamento raggiunge il 100%, premi Avanti.
- Applicazione del foglio di stampa
- Rimuovere eventuali residui di metallo o detriti di supporto. Sposta il cursore Vuoto su On.
- Lasciare che il letto si abbassi e si riscaldi, quindi premere Avanti. Posizionare il foglio di stampa sulla griglia del vuoto e premere Avanti.
- Posizionare la pressa per fogli sul foglio di stampa, allineandola con le guide Z sul retro della camera.
- Attendere che il vuoto si innesti e crei una tenuta stabile. Una volta che l'aspirapolvere è innestato, premere Fine.
- Caricamento di filamenti metallici
- Posizionare manualmente la testina di stampa al centro dell'area di stampa. Rimuovere il coperchio della testina di stampa facendolo scorrere verso l'alto e sganciando le viti di montaggio.
- Tocca l'icona Menu nella scheda delle opzioni. Selezionare Materiali dalle opzioni.
- Scegliere Carica metallo per avviare la routine di caricamento. Scegli Caricamento rapido.
- Selezionare il tipo specifico di materiale metallico da caricare (ad esempio, Alluminio 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
- Posizionare la bobina sul supporto e premere Avanti. Chiudere lo sportello e lasciare che le bobine si riscaldino, quindi premere Avanti.
- Inserire il materiale nell'ingresso anteriore della testina di stampa (etichettato M) fino a quando l'estrusore inizia ad aspirarlo.
- Stampa di parti metalliche
- Nel pannello Impostazioni di stampa, fare clic su Esporta Build. Salvare il file su un'unità USB formattata in FAT32 e inserirlo nella stampante.
- Seleziona l'icona Menu sulla lavagna. Passare a Archiviazione e selezionare Stampa da archiviazione. Scegliere il file di parte per avviare la stampa.
- Rimozione di parti metalliche
- Far scorrere con cautela il foglio di stampa e le parti stampate dal piano di stampa. Staccare delicatamente le parti dal foglio di stampa. Il foglio flessibile dovrebbe staccarsi con facilità.
2. Preparazione per la co-coltura cellulare nel modello 3D
NOTA: Si raccomanda di utilizzare materiali resistenti alle alte temperature come materiali di consumo per la stampa 3D di supporti per impalcature di vetrini coprioggetti per celle per facilitare la sterilizzazione in autoclave prima di ogni utilizzo in esperimenti di coltura cellulare. In questo studio sono state utilizzate cellule stromali endometriali umane immortalizzate (HESC) e cellule epiteliali endometriali umane (Ishikawa). La caratterizzazione di queste linee cellulari è stata precedentemente riportata 5,6.
- Colture cellulari e passamento
- Preparare 50 ml di terreno complementare per hESC aggiungendo terreno DMEM/F12 + 2 mM di L-glutammina + 10% di siero fetale bovino (FBS) privato del carbone + 1% di soluzione di penicillina/streptomicina.
- Preparare 50 ml di terreno complementare per Ishikawa aggiungendo Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% Penicillina/Streptomicina Solution.
- Scongelamento delle celle
NOTA: La linea cellulare acquistata è stata spedita su ghiaccio secco allo stato congelato. Deve essere conservato in fase vapore di azoto liquido o a una temperatura inferiore a -130 °C.- Preparare tutte le apparecchiature sterilizzate necessarie e l'enzima di dissociazione e riscaldare il terreno complementare a 37 °C.
- Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C con occasionali lievi oscillazioni. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta contenente 5 mL di terreno di coltura basale e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
- Rimuovere con cautela il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di coltura completo preparato e dispensarlo in due matracci di coltura T25. Coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
- Preparazione delle cellule con vetrino coprioggetti
- Utilizzare un vetrino coprioggetti quadrato da 18 mm come superficie della coltura cellulare; Assicurarsi che il vetrino coprioggetti sia pulito e sterile.
- Rivestire il vetrino coprioggetti sul fondo di una piastra a 12 pozzetti con 200 μL di matrice extracellulare (ECM) a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Mantenere la piastra a 37 °C per 1 ora.
- Rimuovere l'ECM dalla piastra. Ispezionare le celle per verificarne la confluenza appropriata e assicurarsi che la densità di entrambe le linee cellulari sia di circa il 70%-80%
- Rimuovere il terreno esaurito e lavare le cellule con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 2x.
- Aggiungere 2 mL di enzima di dissociazione e coltivare le cellule a 37 °C per 2 minuti per staccarle.
- Neutralizzare con terreno di coltura completo e creare una sospensione a cellula singola pipettando su e giù.
- Prelevare 100 μl della sospensione cellulare e mescolarla con il blu di tripano (fattore di diluizione =2).
- Far scorrere il vetrino coprioggetti sulla camera dell'emocitometro. Riempire entrambe le camere laterali con la sospensione cellulare contenente tripano blu.
- Conta il numero di cellule in quadrati su entrambi i lati con un microscopio 20x e calcola la densità delle cellule.
- Trasferire le cellule nella piastra preparata con terreno fresco e incubare a 37 °C con CO2 al 5%. Seminare l'hESC nel pozzetto a 1 x 105 cellule/mL per 24 ore.
- Per la linea cellulare di Ishikawa, seminare la cellula nel pozzetto senza vetrino coprioggetti il giorno successivo.
3. Assemblaggio del modello di co-cultura
- Immergere accuratamente le impalcature con alcol etilico e acqua doppia distillata (ddw) per 2 giorni. Sterilizzare gli scaffold con un'autoclave a 121 °C e asciugarli.
- Aggiungere circa 2 mL di terreno complementare per la linea cellulare Ishikawa al pozzo di coltura Ishikawa, assicurandosi che il livello del liquido copra il vetrino coprioggetti.
- Trasferire il coprioggetto con hESC sull'impalcatura e tenere il lato con la cella rivolta verso il basso. Collega l'impalcatura al ben colto Ishikawa. Per il secondo set, invertire questa disposizione trasferendo il coprioggetto con Ishikawa sull'impalcatura e inserendo l'impalcatura nell'hESC ben coltivatore. Utilizzare le celle senza la configurazione dell'impalcatura per l'analisi della crescita cellulare in crescita indipendente.
- Incubare il sistema di co-coltura a 37 °C, 5% CO2. Il periodo di co-coltura può variare a seconda del disegno sperimentale, ma in genere varia da 24 a 72 ore.
4. Acquisizione delle immagini
- Rimuovere con cautela il terreno di coltura e sciacquare delicatamente le cellule con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile.
- Rimuovere i vetrini coprioggetti con le cellule attaccate dalle piastre di coltura utilizzando una pinza fine o una pinzetta. Facoltativamente, posizionare i vetrini coprioggetti in un nuovo piatto con PBS per evitare che si secchino durante il trasferimento.
- Prendi un vetrino da microscopio pulito e posiziona una goccia di PBS. Trasferire delicatamente il vetrino coprioggetti contenente le cellule sulla goccia del terreno di montaggio, assicurandosi che le cellule siano rivolte verso il basso sul vetrino.
- Posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio invertito. Selezionare l'obiettivo appropriato (ad es. 10x, 20x) e regolare la messa a fuoco utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine.
- Impostare i parametri del microscopio come l'intensità dell'illuminazione e le impostazioni della fotocamera. Utilizzando il software del microscopio, è possibile acquisire immagini delle cellule con gli ingrandimenti e i campi visivi desiderati. Regola il tempo di esposizione e altre impostazioni di imaging per ottimizzare la qualità dell'immagine.
5. Elaborazione delle immagini
- Fare clic su Apri per aprire l'immagine, fare clic su Elabora > filtri > miglioramento per > scegliere l'equalizzazione locale e fare clic su Applica.
- Fare clic su Modifica > Converti in > scala di grigi 8. Fai clic su Migliora, scegli Applica contrasto.
- Fai clic su Conta e misura i soggetti. Fare clic su Manuale, selezionare un intervallo e regolare l'istogramma per assicurarsi che tutte le celle siano coperte.
- Fare clic su Applica maschera, chiudere la finestra corrente, fare clic su Oggetti luminosi automatici > misurare, selezionare Misurazione e scegliere Aera, Dendric, Densità e Dimensioni.
- Fai clic su "Oggetti luminosi automatici", quindi fai clic su Conteggio. Fare clic su Esporta dati per esportare i dati di misurazione in un foglio di calcolo.
6. Raccolta di cellule
- Rimuovere i vetrini coprioggetti dal vetrino del microscopio e trasferirli in un pozzetto pulito e asciutto.
- Raccogliere la cellula di Ishikawa con il reagente di isolamento dell'RNA per la trascrittomica o il reagente di lisi Ripa per la ricerca proteomica.
NOTA: Per l'hESC, il metodo di coltura del vetrino coprioggetto è risultato più efficace per l'acquisizione delle immagini dopo la colorazione immunitaria. In alternativa, l'hESC può essere raccolta con il reagente di isolamento dell'RNA o con il reagente di lisi Ripa. Le linee cellulari coltivate sul vetrino coprioggetti o sulla superficie della piastra potrebbero essere scambiate; Tuttavia, si consiglia di seminare le cellule preparate per l'analisi di imaging sul vetrino coprioggetti.
Risultati
La Figura 1 mostra lo scaffold fatto in casa per i vetrini cellulari utilizzati in questo processo, che comprende un anello di supporto superiore su misura per il fissaggio a piastre di coltura cellulare standard a 12 pozzetti, completato da un supporto per vetrini di cellule basali con quattro strutture a forma di L a forma di bastoncino.
Secondo la Figura 2, la densità di entrambi i tipi cellulari nella condizione di co-coltura (Figura 2A, B) è rimasta bassa dopo 72 ore di co-coltura; tuttavia, la densità di entrambi i tipi di cellule coltivate in modo indipendente è cresciuta in modo significativo (Figura 2C, D). Inoltre, la lunghezza delle hESC co-coltivate era più breve rispetto alle hESC coltivate in modo indipendente (Figura 2E-G).
Il profilo delle cellule di Ishikawa e delle cellule hESC indica l'esistenza di interazioni tra i due tipi di cellule. Allo stesso tempo, il sistema ci consente di continuare a eseguire esperimenti di follow-up sulle linee cellulari separate, tra cui la colorazione immunochimica e il western blot.
Figura 1: Scaffold per vetrini coprioggetti stampato in 3D utilizzato nel protocollo sperimentale. (A) Scaffold in monoforma. (B) Scaffold in forma binaria. (C) Illustrazione che dimostri il posizionamento del vetrino coprioggetti sul ponteggio. (D) Illustrazione che dimostra il posizionamento dell'impalcatura in una piastra standard a 12 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Profilo delle linee cellulari hESC e Ishikawa trattate per 3 giorni con condizioni diverse. (A) Il seme di Ishikawa sul vetrino coprioggetti co-coltivato con hESC mediante scaffold (Bar=200 μm). (B) Il seme di hESC sul vetrino coprioggetti è stato co-coltivato con Ishikawa utilizzando un'impalcatura. (C) Le cellule di Ishikawa sono state coltivate in un terreno complementare con il 10% di FBS. (D) Le cellule hESC sono state coltivate in un terreno complementare con il 10% di FBS. (E) La densità cellulare delle hESC in condizioni di co-coltura è significativamente inferiore a quella in condizioni di coltura indipendente. (F) La densità cellulare delle cellule ISHIKAWA in condizioni di co-coltura è significativamente inferiore a quella in condizioni di coltura indipendente. (G) La lunghezza dell'hESC in condizioni di co-coltura è significativamente più breve. N=3; , p<0.05, la barra di errore mostra l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: file di codifica per la stampa 3D. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Viene descritto un protocollo semplificato ed economico per la co-coltura indiretta di cellule endometriali, stromali ed epiteliali. Questo metodo utilizza un'impalcatura fatta in casa per vetrini cellulari, che comprende un anello di supporto superiore su misura per il fissaggio a piastre di coltura cellulare standard a 12 pozzetti, completato da un supporto per vetrini di cellule basali con quattro strutture a forma di bastoncino a forma di L. Questa configurazione facilita la separazione delle cellule endometriali, stromali ed epiteliali, consentendo al contempo la loro interazione attraverso lo scambio di molecole di segnalazione nel terreno di coltura. Uno dei principali vantaggi di questo approccio è la sostanziale riduzione del tempo e dei costi rispetto ai sistemi di co-coltura disponibili in commercio11. L'impalcatura fatta in casa è costruita con materiali facilmente reperibili, riducendo significativamente il costo dell'installazione. Inoltre, il suo design è semplice e consente ai ricercatori di montare e smontare l'impalcatura con facilità, risparmiando così tempo e fatica in laboratorio. Inoltre, l'impalcatura fatta in casa può essere pulita e sterilizzata per molteplici usi, rendendola un'opzione sostenibile ed economica per la ricerca in corso. Questa caratteristica è particolarmente vantaggiosa per gli studi a lungo termine, in cui risultati coerenti e affidabili sono fondamentali.
Le cellule stromali endometriali e le cellule epiteliali svolgono un ruolo fondamentale nel facilitare il successo dell'impianto dell'embrione. In condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali endometriali e le cellule stromali nell'endometrio in genere non hanno un contatto diretto. La ricerca sulla decidualizzazione delle cellule stromali endometriali umane ha dimostrato che le cellule epiteliali influenzano il processo deciduale da parte della paracrina. La stretta vicinanza delle cellule epiteliali e stromali consente una comunicazione efficace attraverso la segnalazione paracrina12. Questa interazione è vitale per coordinare i cambiamenti ciclici nell'endometrio, compresa la preparazione per l'impianto e la successiva perdita di tessuto se l'impianto non si verifica11. Sia le cellule epiteliali che quelle stromali esprimono recettori per gli estrogeni e il progesterone, che ne regolano la proliferazione, la differenziazione e le attività secretorie. Il crosstalk epiteliale-stromale assicura che queste risposte siano ben coordinate13. Pertanto, la complessa diafonia tra queste cellule rimane un'area critica di indagine, poiché è essenziale comprendere gli intricati processi che sono alla base della ricettività endometriale e dell'impianto dell'embrione14. Nonostante i significativi progressi nella biologia riproduttiva, i meccanismi dettagliati di comunicazione tra questi tipi di cellule durante l'impianto non sono ancora completamente chiariti15.
Lo scaffold fornisce un modo conveniente per ottenere la co-coltura di due tipi di cellule aderenti. Tuttavia, nel processo di co-coltura a lungo termine, le cellule vetrino continuano a crescere e rinnovarsi nel tempo e le cellule morte cadranno ed entreranno in contatto con le cellule dello strato inferiore, il che potrebbe avere un impatto sulle cellule dello strato inferiore. Inoltre, le cellule che si seminano sul vetrino coprioggetti vengono posizionate a faccia in giù sull'impalcatura. Non si sa se la gravità abbia qualche effetto sullo stato delle cellule. In questa ricerca, due linee cellulari, hESC e Ishikawa, sono state utilizzate per la dimostrazione. Lo scaffold può essere ampiamente utilizzato nella co-coltura di due diversi tipi di linee cellulari aderenti. Inoltre, lo scaffold può essere utilizzato anche come piattaforma per altri composti o mezzi di rilascio di farmaci e come piattaforma di montaggio per vari dispositivi come dispositivi di luminescenza, riscaldamento ed elettrodi.
Qui, presentiamo un sistema di coltura cellulare in vitro affidabile e robusto che utilizza lo scaffold specifico, che è uno strumento utile e conveniente per studiare ulteriormente il meccanismo molecolare delle interazioni tra cellule uterine embrio-materne. Inoltre, abbiamo caratterizzato la fattibilità dello scaffold stabilito come modello per studi di blastocisti/trofoblasto. Questo protocollo consente la costruzione di scaffold adatti mediante stampa 3D e la loro funzione come struttura 3D per le piattaforme di migrazione o invasione in piccoli volumi (piastre a 12 pozzetti), dove diversi fattori possono essere valutati utilizzando sistemi di quantificazione di imaging.
L'uso di linee cellulari consente la standardizzazione del modello per confrontare diverse condizioni, cosa che non è applicabile utilizzando tessuti primari freschi dei villi. Tuttavia, qualsiasi componente della linea cellulare può essere sostituito dalla coltura primaria per la convalida. Incorporando le cellule e i tessuti derivati dai pazienti di interesse, il modello proposto può facilitare la dimostrazione e la modellazione di diverse malattie che sono note per contribuire all'infertilità e al fallimento della gravidanza.
Passaggi critici
In primo luogo, la densità delle cellule di Ishikawa per la co-coltura dovrebbe essere limitata, circa il 60%-70% di confluenza. In secondo luogo, il coprioggetto con le celle deve essere tenuto abbassato. In terzo luogo, la concentrazione di ECM dovrebbe essere inferiore a 3 mg/mL per evitare la formazione di un gel. In quarto luogo, il livello del liquido del terreno nel sistema di co-coltura dovrebbe coprire il vetrino coprioggetti.
Limitazioni
Il modello sopra menzionato comprende le cellule epiteliali endometriali e le cellule stromali; una limitazione dello studio è stata l'uso di cellule di Ishikawa di adenocarcinoma come surrogati di cellule epiteliali invece di cellule primarie. L'integrazione di cellule epiteliali primarie e stromali della stessa paziente replicherebbe le condizioni fisiologiche dell'endometrio umano. Per alcune applicazioni sperimentali, una possibile limitazione riguarda la mancanza di altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali e le cellule immunitarie, e non esiste una caratterizzazione della struttura ghiandolare in questo modello per valutare l'impatto interattivo delle ghiandole endometriali su altri tipi di cellule endometriali. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali rivelano polarità e questo carattere difficilmente simula condizioni in vitro senza un ambiente luminale uterino. Le cellule stromali endometriali sono sotto il processo deciduale nel ciclo mestruale16,17. Tuttavia, il meccanismo molecolare della decidualizzazione rimane poco chiaro. Diversi fattori, tra cui gli immunociti e le cellule endoteliali, potrebbero svolgere un ruolo nella decidualizzazione. Questo modello fornisce un modo limitato di esaminare il crosstalk indiretto tra cellule stromali ed epiteliali durante il processo deciduale. Inoltre, i livelli e i ruoli dei marcatori biologici durante la decidualizzazione non sono ancora chiari, il che giustifica ulteriori esplorazioni
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Vogliamo ringraziare tutti i soggetti coinvolti in questo studio. Apprezziamo anche l'assistenza per l'imaging da parte di Light Innovation Technology Ltd, Shenzhen. Questo studio è stato supportato dal Natural Science Funding of China (sovvenzione n. 82201851), dal programma di scienza e tecnologia di Shenzhen (sovvenzione n. JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Fondo per la costruzione di discipline mediche chiave di Shenzhen (sovvenzione n. SZXK028), e l'Ospedale delle donne e dei bambini di Shenzhen Baoan (sovvenzione n. BAFY 2023003).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x Hanks′ Soluzione salina bilanciata | Solarbio | H1046 | 1/10 12 |
| pozzetti Piastre trasparenti trattate con TC | Corning | 3513-25 | |
| cm² Pallone per colture cellulari | Corning | 430639-Aluminium | |
| Markforged | 6061-T6-DMEM | ||
| /F12 | Sigma-aldrich | D2906-Dulbecco | |
| ' s Aquila modificata media | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | Gibco | 10099141C | 1/10 |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10099141C | |
| ITS Premix | Biocoat | 354350 | 1/100 |
| Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
| ECM Metal X | Markforged | M F-PR-5000-Penicillina-Streptomicina | |
| Gibco | 15140122 | 1/100 | |
| Coprioggetto Rotondo | Biosharp | BS-18-RC-TrypLE | |
| Select (10X) | Enzima di dissociazione | Gibco | A1217701 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
