Articolo metodologico

Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

DOI:

10.3791/67315

⸱

27 settembre 2024

 ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2School of Life Sciences, Guangzhou University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive come isolare e purificare la microglia ippocampale primaria da topi adulti, seguito da istruzioni per condurre registrazioni di patch-clamp su cellule intere su queste cellule isolate acutamente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microglia sono cellule immunitarie residenti nel cervello che interagiscono con i neuroni per mantenere l'omeostasi del sistema nervoso centrale (SNC). Gli studi dimostrano che la superficie microgliale esprime canali del potassio che regolano l'attivazione della microglia, mentre le anomalie in questi canali del potassio possono portare a malattie neurali. Attualmente, le registrazioni patch-clamp di cellule intere della microglia vengono eseguite principalmente su microglia primarie in coltura da topi fetali o neonati a causa delle difficoltà nel condurre valutazioni elettrofisiologiche su microglia isolate acutamente. Questo studio introduce un protocollo facile da seguire per isolare la microglia ippocampale da topi adulti ed eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere sulle cellule isolate. In breve, il cervello è stato rimosso da un topo dopo la decapitazione, l'ippocampo è stato sezionato bilateralmente e le microglia sono state isolate utilizzando un kit di dissociazione cerebrale di topo adulto. Le microglia sono state quindi purificate utilizzando un metodo di smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS) e seminate su vetrini. Il successo dell'isolamento microgliale è stato confermato dalla colorazione immunofluorescente con anticorpi anti-CD11 e anti-Iba1. Un vetrino coprioggetto è stato posto in una camera di registrazione e le correnti di potassio dell'intera cellula della microglia acutamente isolata sono state registrate in condizioni di voltage-clamp.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microglia, che derivano dai progenitori mieloidi nel sacco vitellino primitivo, sono residenti nel SNC e comprendono circa il 10-15% delle cellule nervose totali 1,2. Funzionalmente, oltre a sorvegliare l'ambiente locale, svolgere funzioni di difesa immunitaria e fornire nutrimento e supporto ai neuroni 3,4, la microglia può anche contattare direttamente i neuroni per regolare i recettori della superficie neuronale e il corrispondente legame del ligando e interagire indirettamente con i neuroni attraverso la secrezione di citochine5. Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che le microglia esprimono vari tipi di canali del potassio, che contribuiscono al mantenimento del potenziale di membrana negativo6 e regolano l'attivazione microgliale. Dato che i canali del potassio microgliali anomali sono stati osservati in varie malattie cerebrali7, è fondamentale per i ricercatori identificare potenziali farmaci che prendono di mira questi canali del potassio e sviluppare strategie per regolare la funzione microgliale.

I metodi tradizionali di digestione e purificazione delle microglia spesso utilizzano l'intero cervello, il che trascura l'eterogeneità delle microglia in diverse aree cerebrali8. La dissociazione in vitro e la coltura a lungo termine in terreni contenenti siero pongono le microglia in uno stato attivo9, che potrebbe non riflettere accuratamente le loro caratteristiche fisiologiche e il loro stato reale.

Inoltre, mentre le correnti di potassio raddrizzatore verso l'esterno sono state registrate nella microglia neonatale primaria in coltura e nelle linee cellulari10, i dati provenienti da colture a lungo termine di tessuto cerebrale fetale o neonato di topo possono differire da quelli della microglia matura. Il presente protocollo mira a isolare in modo acuto le microglia e ad eseguire immediatamente registrazioni di intere cellule di correnti di potassio microgliale utilizzando tessuto cerebrale di topo adulto.

Le proprietà biochimiche e dei canali del potassio sono state esaminate utilizzando un metodo adatto per l'isolamento e la purificazione di microglia da piccoli tessuti 11,12,13,14,15. Pertanto, questo protocollo fornisce una guida ai ricercatori per chiarire le proprietà biochimiche e funzionali della microglia in condizioni fisiologiche e patologiche. Sebbene questo protocollo utilizzi l'ippocampo e i canali del potassio come esempi, può essere applicato anche allo studio di altre aree cerebrali e delle proprietà elettrofisiologiche dei canali/cellule.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Life Science Animal Care and Use Committee della South China Normal University e sono stati mantenuti standard appropriati di benessere degli animali (approvazione etica: SCNU-SLS-2023-048). Per questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschi o femmine di 3-5 mesi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparare 50 mL di soluzione intracellulare contenente 160 mM di KF, 10 mM di HEPES, 10 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2. Regolare il pH a 7,2 con 1 M di soluzione KOH e regolare la pressione osmotica a 300 mOsm con D-saccarosio13,16. Conservare a -20 °C.
  2. Preparare 50 mL di tampone MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS.
  3. Preparare la poli-L-lisina (PLL) in acqua con diluizione 1:1000.
    NOTA: I vetrini coprioggetti devono essere rivestiti con PLL il giorno prima dell'esperimento. Incubare le barbottine rivestite a 37 °C per una notte. Riciclare il PLL il secondo giorno e asciugare le barbottine rivestite a 37 °C.

2. Preparazione di sospensioni unicellulari da tessuto cerebrale

  1. Anestetizzare i topi con idrato di cloralio al 2,5% (0,15 ml/10 g, i.p.) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). La scomparsa del riflesso corneale e del riflesso del dolore pizzicando le dita dei piedi o pizzicando la pelle nei topi conferma l'anestesia profonda. Posiziona gli animali supini su un tavolo da dissezione e appunta i loro arti.
    1. Esporre il torace e perfondere il cuore17 con PBS sterile ghiacciato per rimuovere le cellule del sangue circolanti intravascolari. Tieni la testa e taglia la pelle lungo la linea mediana del cervello con le forbici per esporre il cranio.
    2. Taglia la parte posteriore del cranio bilateralmente e tra le orbite con piccole forbici. Taglia il cranio lungo la sutura sagittale e rimuovi il cranio con una pinzetta. Estrarre rapidamente il tessuto cerebrale con una pinzetta17.
  2. Posizionare il tessuto cerebrale in piastre di coltura di 10 cm contenenti PBS ghiacciato. Sezionare la corteccia cerebrale bilateralmente con una pinzetta, isolare il tessuto ippocampale e tagliarlo in pezzi più piccoli. Trasferire i pezzi in una provetta da centrifuga da 15 mL.
    NOTA: La dissezione bilaterale della corteccia cerebrale rivela la mezzaluna di tessuto ippocampale in entrambi gli emisferi del cervello.
  3. Risospendere i piccoli pezzi di tessuto ippocampale in 2 ml di soluzione salina bilanciata di Hank ghiacciata (HBSS) e centrifugare a 300 × g per 3 minuti (a temperatura ambiente), quindi scartare l'HBSS.
  4. Aggiungere 1950 μl di miscela enzimatica 1 alla provetta da centrifuga da 15 mL contenente i pezzi di tessuto ippocampale. Agitare continuamente la provetta da centrifuga a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
    NOTA: La miscela enzimatica 1 è una combinazione di 50 μl di enzima P e 1900 μl di tampone Y, preriscaldato a 37 °C (presente come parte del kit disponibile in commercio, vedere la tabella dei materiali).
  5. Rimuovere la provetta da centrifuga dal bagnomaria. Aggiungere 30 μl di miscela enzimatica 2 appena preparata nella provetta da centrifuga da 15 mL. Pipettare i frammenti di tessuto su e giù 20 volte con un puntale da 1 mL e incubare a bagnomaria per 5 minuti agitando continuamente a 37°C.
    NOTA: La miscela enzimatica 2 è una combinazione di 20 μl di tampone Y e 10 μl di enzima A. Le due fasi di digestione precedenti convertono il tessuto cerebrale in una sospensione cellulare. Il tempo di digestione totale non deve superare i 15 minuti.
  6. Rimuovere la provetta da centrifuga e pipettare la sospensione su e giù più volte con una pipetta da 1 ml fino a quando non rimangono più pezzi di tessuto di grandi dimensioni.
  7. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro di screening cellulare da 70 μm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga pulita da 50 mL.
    NOTA: Questo passaggio rimuove tutti i pezzi di tessuto non digerito di grandi dimensioni.
  8. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 10 minuti. Eliminare il surnatante con una pipetta da 1 mL.
  9. Lavare la sospensione cellulare pipettandola su e giù 20 volte con 15 mL di HBSS e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 10 minuti. Eliminare il surnatante e
    risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone MACS.
    NOTA: Questo passaggio fornisce la sospensione a cellula singola utilizzata negli esperimenti successivi.

3. Separazione acuta delle microglia

  1. Trasferire 1 mL di sospensione monocellulare in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 3 min. Scartare il surnatante.
  2. Risospendere il pellet a cella singola in 90 μl di tampone MACS. Aggiungere 10 μl di microsfere CD11b/c e incubare la sospensione a 4 °C per 15 minuti su un agitatore orizzontale.
  3. Posizionare la colonna di smistamento nel campo magnetico di un separatore MACS adatto e inumidire la colonna due volte con 500 μL di tampone MACS.
  4. Lavare la sospensione a cellula singola aggiungendo 1 mL di tampone MACS direttamente nella provetta e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 3 minuti. Aspirare completamente il surnatante.
  5. Risospendere il pellet della cella in 500 μL di tampone MACS.
  6. Trasferire la sospensione di cellule risospese nella colonna di smistamento nel campo magnetico utilizzando una pipetta da 1 mL. Scartare il flusso. Lavare la colonna tre volte con 500 μL di tampone MACS mentre rimane nel campo magnetico.
    NOTA: Il flusso continuo contiene celle non etichettate. La colonna deve essere lavata senza rimuoverla dal campo magnetico.
  7. Rimuovere la colonna di smistamento dal campo magnetico. Aggiungere 1 mL di tampone MACS alla colonna e spingerlo lentamente con il pistone. Raccogli il flusso.
    NOTA: Il flusso contiene le cellule marcate (cioè la microglia). Per migliorare la purezza della microglia, il processo può essere ripetuto con una nuova colonna di selezione (opzionale).
  8. Seminare le cellule selezionate in una piastra a 24 pozzetti contenente un vetrino coprioggetti rivestito di PLL. Aggiungere 200 μl di terreno di coltura e incubare per 20 minuti in un incubatore a 37 °C con il 95% di O2, il 5% di CO2 e il 60%-80% di umidità. Questo passaggio consente alla microglia di attaccarsi al vetrino coprioggetti per successivi esperimenti di patch-clamp e immunofluorescenza su cellule intere.

4. Immunofluorescenza

  1. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti della piastra e sciacquare le cellule tre volte con 0,1 M di PBS sull'agitatore.
  2. Scartare il PBS e fissare la microglia sul vetrino coprioggetti con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
  3. Rimuovere il fissativo e sciacquare il vetrino coprioggetto tre volte con 0,1 M PBS.
  4. Scartare il PBS e permeabilizzare le cellule con 200 μL di tampone bloccante contenente lo 0,2% di Triton X-100 e il 5% di BSA in PBS per 1 ora a RT sull'agitatore.
  5. Incubare la microglia con tampone bloccante e anticorpi primari anti-Iba1 e anti-CD11b18 per una notte a 4 °C.
  6. Il giorno successivo, rimuovere gli anticorpi primari e sciacquare il vetrino coprioggetti tre volte con PBS a RT sullo shaker.
  7. Incubare la microglia con il tampone bloccante contenente anticorpi secondari accoppiati a fluorofori per 2 ore a RT. Aggiungere il colorante DAPI per gli ultimi 15 minuti di incubazione.
  8. Rimuovere gli anticorpi secondari e sciacquare il vetrino coprioggetto tre volte con PBS. Montare i vetrini coprioggetto sui vetrini del microscopio per l'imaging.

5. Registrazione patch-clamp su cellule intere delle correnti di potassio nelle microglia

  1. Scongelare la soluzione intracellulare e mantenerla in ghiaccio.
  2. Estrarre le pipette patch (elettrodi) dai capillari in vetro borosilicato a parete sottile utilizzando un estrattore verticale17.
    NOTA: La resistenza dell'elettrodo deve essere inferiore a 10 MΩ.
  3. Trasferire un vetrino coprioggetti nella camera di registrazione e aggiungere la soluzione extracellulare contenente 160 mM di NaCl, 4,5 mM di KCl, 2 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2 e 10 mM di HEPES. Regolare il pH a 7,2 con una soluzione di NaOH 1 M prima dell'uso13,16 e regolare la pressione osmotica a 300 mOsm con D-saccarosio.
  4. Localizzare la microglia sferica al microscopio ad acqua utilizzando l'obiettivo 40x.
  5. Riempire l'elettrodo con la soluzione intracellulare, collegarlo allo stadio di testa dell'amplificatore della configurazione di elettrofisiologia e applicare una pressione positiva. Passa all'obiettivo 4x e individua l'elettrodo.
    1. Abbassare l'elettrodo nella soluzione del bagno e impostare l'amplificatore in modalità voltage-clamp per eseguire il test della membrana in modalità bagno . Torna all'obiettivo 40x e avvicina la punta dell'elettrodo alla microglia.
      NOTA: Quando la punta dell'elettrodo è molto vicina a una cellula microgliale, la resistenza dovrebbe aumentare leggermente.
    2. Applicare una piccola pressione negativa per trattenere la cella. Quando la resistenza raggiunge i 100 MΩ, passare dalla modalità bagno a quella patch nel test della membrana. Quando la resistenza raggiunge i 300 MΩ, rilasciare la pressione negativa.
    3. Quando la resistenza indica la formazione di un sigillo gigaohm (cioè >1 GΩ) tra l'elettrodo e la membrana microgliale, passare dalla modalità patch a quella cella nel test della membrana.
  6. Applicare una piccola quantità di aspirazione e avviare una scossa elettrica per rompere la membrana. La comparsa di grandi transienti capacitivi indica la rottura riuscita della membrana.
  7. Passare alla modalità voltage-clamp e aprire il programma di registrazione. Registra correnti di potassio per 200 ms. Per testare i potenziali, applicare incrementi di tensione con incrementi di 20 mV da -120 mV a +40 mV a 1 Hz.
  8. Analizza i dati ottenuti offline utilizzando un software appropriato.

Risultati

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In breve, il processo prevede l'isolamento della microglia ippocampale dal cervello del topo adulto, seguita dalla registrazione di queste cellule con patch-clamp a cellula intera (Figura 1). La procedura inizia con la dissezione dell'ippocampo di topi adulti C57BL/6J di età compresa tra 3 e 5 mesi. In particolare, l'intero cervello viene rimosso dopo la perfusione e posto in una piastra di coltura contenente PBS ghiacciato (Figura 2A). Per garantire l'isolamento acuto delle cellule dall'ippocampo, la corteccia cerebrale viene rimossa e il tessuto ippocampale a forma di mezzaluna viene isolato intatto (Figura 2B).

Per una qualità ottimale delle cellule e per le successive registrazioni di alta qualità di patch-clamp su cellule intere, è fondamentale controllare il tempo di digestione durante la preparazione della sospensione a cellula singola. Lo studio ha costantemente agitato manualmente il tessuto ippocampale nella miscela enzimatica e ha limitato rigorosamente il periodo di digestione a non più di 15 minuti (Figura 3). Le cellule sono state quindi isolate utilizzando il metodo MACS, raggiungendo una purezza dell'86,20% ± dello 0,68%19,20. Per confermare che queste cellule selezionate erano microglia, i marcatori di superficie microgliale sono stati testati mediante immunofluorescenza utilizzando anticorpi anti-Iba1 e anti-CD11b, che sono ampiamente utilizzati per rilevare la microglia18. I risultati hanno indicato che le cellule isolate erano CD11b e Iba1 positive, confermando il successo dell'isolamento della microglia (Figura 4).

Infine, per valutare se le microglia isolate in modo acuto sono di alta qualità per gli esperimenti di follow-up, descriviamo come eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere per valutare le correnti di potassio microgliali. La microglia registrata aveva una capacità media di membrana di 10,42 ± 2,05 (Figura 5). I risultati hanno dimostrato che le correnti di potassio microgliale potrebbero essere registrate, indicando che le microglia isolate in modo acuto sono adatte per studi neurobiologici.

figure-results-1
Figura 1: Panoramica della procedura sperimentale. Ci sono quattro passaggi principali: i tessuti cerebrali vengono estratti con cura e l'ippocampo viene sezionato bilateralmente; i tessuti dell'ippocampo vengono digeriti per preparare una sospensione unicellulare utilizzando una miscela enzimatica come descritto nella sezione del protocollo; le cellule bersaglio sono isolate mediante un metodo di smistamento cellulare attivato magneticamente; e le correnti di potassio nelle cellule isolate in modo acuto vengono analizzate mediante registrazione patch-clamp su cellula intera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Dissezione dell'ippocampo. (A) L'intero cervello di un topo di 3-5 mesi. (B) Ippocampo bilaterale isolato. Barra della scala: 0,5 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Diagramma schematico che mostra la digestione dei tessuti ippocampali. Illustrazione delle fasi sperimentali critiche, che assicurano che il tessuto ippocampale venga digerito in una sospensione unicellulare aggiungendo miscele enzimatiche a 37 °C con agitazione continua per un massimo di 15 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Identificazione di microglia ippocampali acutamente isolate. Immagini confocali rappresentative che mostrano cellule CD11b (verde) e Iba1 (rosso) positive purificate dall'ippocampo, confermando che le cellule isolate sono microglia. Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Registrazione delle correnti di potassio microgliale a cellula intera. (A) Un elettrodo di registrazione è posizionato sulla superficie della microglia ippocampale isolata. Barra della scala: 20 μm. (B) Correnti di potassio rappresentative della microglia ippocampale acutamente isolata in condizioni di voltage clamp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Le microglia coltivate da topi fetali o neonati sono chiaramente inadatte per lo studio delle microglia adulte. Inoltre, data l'eterogeneità delle microglia in diverse aree cerebrali21, le microglia isolate dall'intero cervello potrebbero non rappresentare accuratamente le caratteristiche delle microglia in una specifica struttura cerebrale. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare la microglia ippocampale in modo specifico per valutare le proprietà elettriche di queste cellule. Include metodi per registrare le correnti governate dai canali del potassio microgliali.

È noto che la digestione dei tessuti deve essere rigorosamente controllata durante la preparazione di sospensioni di singole cellule per evitare di compromettere le proprietà di queste cellule durante la coltura cellulare primaria e i successivi esperimenti. Tipicamente, una sospensione unicellulare si ottiene dall'intero cervello attraverso la digestione degli enzimi pancreatici e l'omogeneizzazione fisica. Tuttavia, quando si isolano le microglia da una specifica area del cervello, come l'ippocampo, l'omogeneizzazione fisica da sola non produce una quantità sufficiente di cellule per esperimenti significativi. Inoltre, gli enzimi pancreatici hanno un'attività digestiva vigorosa, che può influenzare la vitalità cellulare.

Per affrontare questi problemi, lo studio ha adottato una procedura di dissociazione relativamente lieve e ha controllato manualmente il tempo di digestione a non più di 15 minuti utilizzando il kit di dissociazione cerebrale del topo adulto. Questo approccio mantiene la microglia in uno stato attivo, che è fondamentale per le successive registrazioni di patch-clamp su cellule intere. La procedura di dissociazione delicata offre anche vantaggi in termini di velocità ed economicità.

I metodi per la purificazione della microglia primaria includono il metodo di agitazione stratificata (SSM)22, il metodo di centrifugazione in gradiente di densità (DGCM)23 e il metodo di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)11,24. Tra questi, l'SSM è ampiamente utilizzato per la purificazione di neuroni o cellule gliali. Tuttavia, uno dei principali limiti dell'MVU è la sua incapacità di raggiungere elevati livelli di purezza25. Allo stesso modo, la DGCM determina anche bassi livelli di purezza. Il metodo FACS richiede la colorazione delle celle per 15 minuti a 1 ora, seguita da una selezione con un selezionatore di cellule ad alta velocità, che può compromettere la vitalità cellulare. Al contrario, questo protocollo utilizza il metodo MACS, che offre un tempo di isolamento ridotto ed evita l'uso ripetitivo e dispendioso in termini di tempo di strumenti e procedure di colorazione. Di conseguenza, si ottengono microglia di elevata purezza, anche se in quantità potenzialmente inferiori rispetto ad alcuni metodi alternativi.

Ci sono dei limiti a questa tecnica. Ad esempio, il metodo di smistamento cellulare attivato da magneti (MACS) produce relativamente poche microglia e le microglia isolate in modo acuto non possono essere coltivate per periodi prolungati. Tuttavia, questo approccio è prezioso perché consente di studiare le proprietà elettrofisiologiche delle microglia che sono state preparate di recente dall'ippocampo del topo adulto, piuttosto che fare affidamento su cellule che sono state coltivate per molto tempo.

La tecnica del patch-clamp a cellula intera è uno strumento cruciale e ampiamente utilizzato per lo studio delle proprietà elettrofisiologiche cellulari, in particolare neuronali, in campi come le neuroscienze, la farmacologia e la citobiologia26. La registrazione del patch-clamp su cellule intere è stata impiegata in numerosi studi per studiare le proprietà di fette di cervello sezionate acutamente, colture primarie e linee cellulari. Tuttavia, fino alle nostre indagini, mancavano registrazioni di patch-clamp su cellule intere di microglia isolate acutamente dal cervello di topo adulto.

Questo studio non solo fornisce un protocollo per isolare le microglia ippocampali adulte, ma dimostra anche il successo della registrazione delle correnti di potassio in queste microglia isolate. In particolare, è probabile che questo protocollo si applichi allo studio delle microglia in strutture cerebrali diverse dall'ippocampo.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32170950, 32371065), della Natural Science Foundation of Guangdong Province, n. 2023A1515010899 e 2021A1515010804.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di Petri da 100 mmCorning353003
Provette Falcon da 15 mLBD352096
Piastre a 24 pozzettiPiastra di353047
35 mmCorning
353001-50 mL Provette FalconBD352070
70 μ screening delle cellule mMiltenyi130-095-823Per rimuovere i grumi cellulari prima della selezione cellulare
Kit di dissociazione cerebrale del topo adultoMiltenyi130-107-677
Anticorpo anti-CD11bBio-RadMCA74Capra Anti-topo IgG disponibile. Per bloccare le immunoglobuline endogene.
Anti-Iba 1 AnticorpoSYSY234308Capra Anti-cavia IgG) disponibile. Per bloccare le immunoglobuline endogene.
Axon Digidata 1440AUSA
Axon MultiClamp 700B AmplificatoreUSA
BSA Frazione di albumina VBioFrox4240GR500Siero
C57BL/6 topi Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
Cloralio idratoAbsinabs47051394Ampiamente usato come anestesia nei topi
Clampfit 10.6USA
Microscopio confocaleZeiss  LSM 800
Terreno di colturaFisher ScientificC11995500BT-DAPI
coloranteBeyotimeC1002
Estrattore di elettrodiNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Agitatore orizzontaleSCILOGEXSLK-O3000-S
Software di analisi delle immaginiFiji
Colonne MACSMiltenyi130-042-201
Separatori MACSMiltenyi130-042-102
ParaformaldeideFisher ScientificT353-500Utilizzare una soluzione fresca al 4% in 1X PBS, pH 7,2-7,4.
Poli-L-lisinaBeyotime  C0313Rivestimento vetrino coprioggetti
Triton X-100SigmaX100
Petri BD

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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