Identificazione e quantificazione di metaboliti squilibrati in pazienti critici utilizzando la metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare

Summary

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) viene utilizzata per identificare la disregolazione dei metaboliti in pazienti con varie malattie. Questa tecnica consente la quantificazione dei metaboliti squilibrati, svelando le intuizioni fisiopatologiche. Qui, descriviamo la procedura passo-passo dell'approccio basato sulla risonanza magnetica magnetica per la caratterizzazione metabolica dei pazienti.

Abstract

La metabolomica sta emergendo come un approccio significativo per riflettere la risposta dell'individuo alle condizioni fisiopatologiche. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) si è evoluta come strumento per identificare le disregolazioni metaboliche in pazienti critici affetti da condizioni come la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), la pancreatite acuta grave (SAP), il danno renale acuto (AKI) e la sepsi. I dati spettrali del campione di siero del gruppo di studio e di controllo vengono registrati utilizzando uno spettrometro NMR da 800 MHz ed elaborati utilizzando strumenti di elaborazione e analisi NMR. Inoltre, viene eseguita una rigorosa analisi statistica, come test univariati e multivariati, per individuare i metaboliti significativi, che vengono poi accuratamente identificati e quantificati utilizzando il software di quantificazione dei metaboliti NMR. Inoltre, l'analisi del percorso evidenzia i cicli biochimici squilibrati che determinano la gravità della malattia. Attraverso questo approccio globale, i ricercatori mirano a ottenere informazioni più approfondite sulle alterazioni metaboliche associate a queste malattie critiche, aprendo potenzialmente la strada a una migliore comprensione della malattia e a migliori strategie diagnostiche e terapeutiche.

Introduction

Nonostante i continui sforzi per fornire una diagnosi efficiente della malattia in tutto il mondo, la terapia mirata non ha ancora raggiunto il suo vero potenziale. Vari approcci, come la trascrittomica, la proteomica, ecc., hanno portato all'identificazione di diversi biomarcatori, ma questi non avevano sufficiente utilità clinica a causa della mancanza di sensibilità e specificità ^1,2. La terapia mirata è una grande sfida in alcune malattie multifattoriali, che alla fine porta a una maggiore mortalità. C'è bisogno di una migliore comprensione del meccanismo sottostante e della fisiopatologia di malattie complesse esistenti con un'ampia eterogeneità. Quindi, a questo proposito, l'evoluzione della metabolomica ha rivoluzionato lo sviluppo terapeutico, che alla fine può aiutare a personalizzare i regimi di trattamento per varie malattie critiche come la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), la sepsi e la pancreatite acuta grave (SAP).

La metabolomica è un approccio completo volto a identificare e quantificare molecole a basso peso molecolare (metaboliti come aminoacidi, lipidi, peptidi, acidi organici e vitamine) in vari biofluidi, cellule o estratti di tessuti. Questi metaboliti, che in genere pesano meno di 1500 Da, svolgono un ruolo attivo nei processi biochimici, riflettendo un profilo progressivo dello stato biologico dell'organismo. Includono substrati per processi enzimatici chiave, intermedi nelle vie biologiche e sottoprodotti del metabolismo cellulare. Di conseguenza, la metabolomica cattura un'impronta digitale dettagliata delle influenze alimentari, delle interazioni farmacologiche e degli stati patologici. Le alterazioni dei metaboliti sono indicatori altamente sensibili del metabolismo e delle vie biologiche, consentendo correlazioni con le espressioni fenotipiche e le anomalie fisiopatologiche risultanti ^3,4. Le variazioni iniziali dei metaboliti possono fungere da indicatori precoci della gravità della malattia, mentre le variazioni temporali possono aiutare a monitorare l'efficacia del trattamento, la progressione della malattia e gli esiti clinici ^5,6,7. La metabolomica migliora quindi i saggi clinici e vari altri approcci omici ridefinendo le malattie attraverso endpoint clinici, fisiologici e biochimici 8,9,10,11,12,13. Le capacità analitiche della metabolomica sono impiegate per monitorare e determinare la suscettibilità alla malattia attraverso concentrazioni alterate di metaboliti^14,15.

In questo contesto, sia la spettrometria di massa (MS) che la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) sono emerse come le principali piattaforme analitiche per la profilazione dei metaboliti in campioni biologici. Questi metodi sono utilizzati sia per l'identificazione e la quantificazione mirata che non mirata dei metaboliti 16,17,18. Ogni piattaforma ha i suoi vantaggi e limiti, ma la natura non distruttiva della NMR la rende preferibile in vari studi in vivo e per la caratterizzazione della struttura di composti sconosciuti, in particolare nelle fasi iniziali della ricerca metabolomica. Il frazionamento del campione, la derivatizzazione e la ionizzazione necessarie prima della MS possono introdurre distorsioni e spesso provocare la perdita del campione, influenzando le caratteristiche dinamiche che la spettroscopia NMR può catturare con una preparazione minima o nulla del campione. Il limite principale della risonanza magnetica mobile è la sua minore sensibilità rispetto alla MS, che offre un limite di rilevamento inferiore, rendendo difficile rilevare metaboliti meno abbondanti¹⁹. Tuttavia, progressi come i magneti superconduttori ad alta risoluzione, le sonde NMR raffreddate criogenicamente e le tecniche che migliorano la sensibilità hanno mitigato questa limitazione 20,21,22. Come approccio complementare alla genomica e alla proteomica, la profilazione metabolica mediante spettroscopia NMR sta guadagnando terreno come tecnica preferita 23,24,25. La preparazione minima del campione, la riproducibilità e la ripetibilità della NMR lo rendono uno strumento prezioso per catturare le caratteristiche dinamiche intrinseche dei metaboliti nonostante i suoi problemi di sensibilità²⁶.

Diversi gruppi di ricerca hanno eseguito con successo la metabolomica, individuando il profilo metabolico disregolato dei pazienti per varie malattie²⁷ come ARDS 28,29,30,31,32,33, polmonite ³⁴, sepsi⁷, calcoli biliari³⁵ e pancreatite³⁶. Gli studi di metabolomica basati sulla risonanza magnetica su pazienti critici sono stati determinanti per monitorare la progressione dalla sindrome da risposta infiammatoria sistemica (SIRS) alla sindrome da disfunzione multiorgano (MODS), che è una delle principali cause di mortalità e morbilità in unità di terapia intensiva (ICU)³⁷. In uno studio di Stringer et al., i campioni di plasma sono stati utilizzati per esaminare le alterazioni metaboliche nei pazienti con danno polmonare acuto indotto da sepsi (ALI) rispetto ai pazienti di controllo³⁸. I metaboliti chiave trovati elevati in questo studio pilota riflettono le vie metaboliche coinvolte e la loro associazione con i punteggi clinici. Questa ricerca è stata estesa alla metabolomica sierica per differenziare la sepsi dalle prime fasi dei meccanismi di danno polmonare nell'ARDS³². Inoltre, un altro studio sull'ARDS ha identificato potenti biomarcatori sierici che differenziano distintamente tra danno polmonare acuto/ARDS e controlli sani, offrendo informazioni sui cambiamenti metabolici sistemici corrispondenti all'insorgenza acuta del danno polmonare^39,40.

La spettroscopia NMR è una tecnica analitica automatizzata e ad alto rendimento che fornisce informazioni solide e imparziali sull'impronta metabolica rivelando la fisiopatologia sottostante³⁸. L'applicazione clinica e l'interpretazione biologica dei dati NMR dipendono dall'ottenimento di spettri di alta qualità che contengano informazioni ricche. Pertanto, è fondamentale garantire una raccolta, un'elaborazione e un'analisi dei dati accurate, uniformi e ben formulate. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è quello di sfruttare i passaggi essenziali della metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare per l'identificazione e la quantificazione dei metaboliti. Questo studio evidenzia le fasi chiave del protocollo richiesto per lo studio della metabolomica clinica (Figura 1), come la selezione di campioni appropriati, la raccolta e la conservazione, l'elaborazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione e l'analisi dei dati, l'identificazione e la quantificazione del metabolita di interesse e, infine, l'interpretazione dei risultati in un contesto clinico per ricavare informazioni pertinenti. Ognuno di questi passaggi è essenziale per sfruttare la spettroscopia NMR in metabolomica per scoprire informazioni biologiche e cliniche significative.

Protocol

L'approvazione etica (codice IEC: 2022-71-PhD-126) è stata ottenuta dall'IEC del Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences (SGPGIMS), Lucknow. I consensi scritti e informati sono stati ottenuti dai pazienti o dai loro parenti per eseguire lo studio e pubblicare i dati a scopo di ricerca. Inoltre, la ricerca è stata condotta seguendo le linee guida istituzionali.

1. Disegno dello studio e nulla osta etico

1. Determinare la dimensione del campione per ciascun gruppo. Esaminare attentamente e stabilire i criteri di selezione dei partecipanti. Inoltre, se il disegno dello studio richiede l'inclusione di campioni umani o animali, ottenere l'autorizzazione etica dal comitato etico istituzionale (IEC) appropriato prima di iniziare la raccolta del campione.
2. Selezionare i pazienti con ARDS classificati come lievi, moderati e gravi, in base ai criteri diagnostici della definizione di Berlino 2012 basata sulla pressione parziale dell'ossigeno nel sangue arterioso (PaO2) rispetto al rapporto tra frazione di ossigeno inspirato (FiO2) (P/F). I pazienti con ARDS con un intervallo P/F di 300-200 sono considerati lievi, 200-100 moderati e inferiori a 100 gravi³⁸. Qui, ci siamo concentrati su due gruppi: pazienti con ARDS lieve e moderata (vedi Tabella 1).
   NOTA: Lo studio prevede l'uso di siero ottenuto da campioni di sangue per eseguire la metabolomica basata sulla risonanza magnetica magnetica. In questo studio, i partecipanti inclusi come riferimento avevano un'età media di 42 anni (± 10,9 anni), con una distribuzione di genere di 2 maschi e 6 femmine.

Categoria	Rapporto P/F
Lieve	300-200
Moderato	200-100
Forte	100-0

Tabella 1: Categorizzazione dei pazienti con ARDS.

2. Selezione, raccolta ed elaborazione dei campioni

1. Eseguire l'isolamento del siero seguendo i passaggi descritti di seguito.
   1. Per la sperimentazione, raccogliere 2 ml di campioni di sangue dalle arterie utilizzando un ago sterile in una fiala semplice (senza additivi) e sterile. Lasciare coagulare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente. Per questo studio, sono stati selezionati 4 pazienti con diagnosi di ARDS lieve e 4 pazienti con ARDS moderata.
   2. Centrifugare il campione a 3100 x g per 15 minuti per separare il siero²⁵. Trasferire il siero in provette sterili per microcentrifuga, facendo aliquote di volume inferiore (ad es. 400-500 μL), etichettarle in modo appropriato (nome del paziente, numero di CR, punto del giorno, ecc.) e conservarle a -80 °C per analisi future.
      NOTA: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa e ripreso in un momento opportuno.
2. Elaborare il campione di siero prima degli esperimenti NMR utilizzando i seguenti passaggi.
   1. Scongelare il campione prima di eseguire gli esperimenti NMR. Miscelare 250 μL di aliquota di siero con 250 μL di soluzione tampone fosfato salino (contenente 100% D₂O, 0,9% NaCl, 50 mM di tampone fosfato di sodio, pH 7,4) per ridurre al minimo la variazione del pH.
   2. Agitare la miscela per alcuni secondi (~15 s) per assicurarsi che sia miscelata in modo omogeneo. Infine, trasferire il campione preparato in una provetta NMR pulita con un inserto coassiale contenente trimetilsilil propionato (TSP) a una concentrazione di 0,05 mM, che funge da standard esterno per la calibrazione e la quantificazione⁴¹.
      NOTA: Come riferimento, viene utilizzato un composto inerte e non reattivo che non interagisce con gli analiti. Altri composti di riferimento comunemente usati includono il tetrametilsilano (TMS) e il trimetilsililpropansulfonato di sodio (DSS).

3. Sperimentazione NMR

NOTA: L'obiettivo è identificare piccole molecole nei campioni di siero, quindi abbiamo utilizzato la sequenza di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), che sopprime i segnali delle macromolecole. Tutti i campioni di siero in questo studio sono stati registrati utilizzando uno spettrometro NMR da 800 MHz dotato di una testa della sonda inversa a banda larga TCI a tripla risonanza raffreddata criogenicamente da 5 mm e gradiente z schermato.

1. Posizionare il campione nel magnete. Scrivi il comando wrpa (menziona il numero dell'esperimento) e premi invio per impostare un esperimento protonico con il programma cpmg pulse. Menziona il nome del paziente e altri dettagli necessari facendo clic sull'opzione Titolo.
2. Bloccare il campo magnetico Scrivendo il comando Blocca, premere invio, e selezionare ulteriormente l'opzione 90% H₂O e 10% D₂O . Sintonizza e abbina la sonda manualmente tramite ATMM per ottimizzare l'efficienza degli impulsi a radiofrequenza e massimizzare la sensibilità. Esegui lo spessore sfumato 1D facendo clic su topshim.
3. Impostare i seguenti parametri di acquisizione, tra cui un ritardo di rilassamento di 5 s, un'ampiezza di scansione spettrale di 12 parti per milione (ppm) e un tempo di eco di 300 μs. Tutti questi parametri possono essere facilmente modificati selezionando l'opzione Parametri di acquisizione nel pannello superiore.
4. Applica l'allargamento della linea di 0,3 Hz utilizzando una funzione di finestra esponenziale, raccogliendo dati in 64.000 punti in 128 scansioni. Questi parametri possono essere modificati in modo analogo selezionando l'opzione Parametri di acquisizione nel pannello superiore. Cliccando su Parametri di acquisizione, apparirà un elenco di specifiche e gli attributi menzionati, insieme ad altri parametri, possono essere modificati durante l'ottimizzazione.
5. Acquisisci gli spettri NMR utilizzando strumenti di elaborazione e analisi NMR. Una volta ottenuti gli spettri finali, scrivi i comandi apk e absn e premi invio per eseguire rispettivamente la correzione di fase e la correzione della linea di base. Fare clic sull'opzione Calibra asse presente nel pannello superiore, quindi calibrare il picco TSP a 0 ppm automaticamente o manualmente.
6. Trasferire i dati acquisiti dal sistema alla postazione di lavoro, dove vengono eseguite ulteriori elaborazioni e analisi.
   NOTA: La fase sperimentale è ora completa e può essere messa in pausa. La preelaborazione, l'analisi e l'interpretazione dei dati possono essere eseguite comodamente.

4. Pretrattamento dei dati

1. Condurre la pre-elaborazione dei dati utilizzando strumenti di elaborazione e analisi NMR e software di quantificazione dei metaboliti NMR.
   1. A volte, la sola correzione automatica non è sufficiente e, in tal caso, è necessaria anche la correzione manuale. Per eseguire manualmente la correzione di fase, fare clic sull'opzione Elabora nella barra dei menu in alto degli strumenti di elaborazione e analisi NMR. Quindi fare clic su Regola fase, trascinare il mouse e osservare fino a quando gli spettri non vengono corretti in fase. Una volta fatto, fai clic sull'opzione Salva e Torna (presente sotto forma di icona) disponibile nella stessa barra dei menu.
   2. Per eseguire la correzione manuale della linea di base (metodo Whittaker), aprire il file spettrale nel modulo processore del software di quantificazione dei metaboliti NMR. Selezionare l'opzione Correzione linea di base. Quindi seleziona l'opzione Metodo Whittaker. Ora metti i punti alla base dei picchi in tutti gli spettri (da 0,0 a 10 ppm, di solito nel caso del siero o secondo la disponibilità del metabolita negli spettri) per regolare la base. Dopo che tutti i file spettrali sono stati corretti di baseline, salvateli in un'unica cartella. Un'ulteriore elaborazione, utilizzando il processore o il modulo profiler del software di quantificazione dei metaboliti NMR, può essere eseguita utilizzando lo stesso file salvato nel formato specifico.
   3. Eseguire il binning utilizzando il modulo profiler dello stesso software. Selezionare l'opzione Strumenti, quindi Elaborazione batch e infine Binning spettrale.
2. Per generare il foglio di binning finale da utilizzare per l'analisi statistica, selezionare la cartella contenente tutti i file spettrali corretti per la baseline dopo aver fatto clic su Binning spettrale.
3. Dividi gli spettri in un determinato numero di contenitori di uguali dimensioni con una larghezza spettrale definita, compresa tra 0,01 e 0,04 ppm (può essere ottimizzata secondo lo studio). Questo processo semplifica e organizza i dati spettrali, facilitando un'analisi più coerente. Specificare la dimensione del secchio insieme ai valori ppm iniziale e finale e designare la cartella in cui verranno salvati i fogli di binning di output.
4. Escludere le regioni di spostamento chimico corrispondenti all'acqua e al solvente TSP (4,8-5,2 e 0,0-0,7 ppm) per prevenire l'interferenza spettrale 42,43,44.
5. Questo foglio di calcolo contiene i nomi degli esempi in una riga e i diversi valori dei contenitori insieme a ppm nelle altre righe. Prima di utilizzare questo foglio per l'analisi statistica, modificarlo organizzando i campioni in gruppi per l'analisi e salvandolo solo in formato delimitato da virgole (CSV).
   NOTA: Ad esempio, quando si confronta il gruppo lieve con il gruppo moderato di pazienti con ARDS, abbiamo organizzato i dati con etichette lieve e moderata, abbiamo aggiunto un numero di serie e salvato il file in formato CSV.

5. Analisi statistica

NOTA: Il foglio di binning ottenuto dal passaggio precedente funge da file di input per l'analisi statistica. In questo studio è stato utilizzato il modulo di analisi statistica (un fattore) del software di analisi statistica metabolomica.

1. Prima dell'analisi statistica, eseguire la fase di normalizzazione utilizzando somma, log e Pareto, ma può variare tra i diversi studi⁴⁵.
2. Eseguire analisi univariate e multivariate per distinguere i diversi gruppi e determinare l'accuratezza dei metaboliti identificati.
   1. Eseguire l'analisi delle componenti principali (PCA), l'analisi discriminante parziale dei minimi quadrati (PLS-DA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) per osservare la discriminazione tra i gruppi che producono punteggi VIP (Variable Importance of Projection) per ogni metabolita responsabile della differenza nel profilo metabolico.
   2. Eseguire metodi univariati, come il t-test di Student e l'ANOVA, per identificare i metaboliti significativi in base ai criteri di avere un valore p inferiore a 0,05. Entrambi i test producono grafici a scatola che mostrano la differenza nella concentrazione relativa dei metaboliti.
   3. Eseguire l'analisi dei biomarcatori, che produce un'area sotto il grafico della curva caratteristica operativa del ricevitore (AUROC). Il valore AUC (area sotto la curva) > 0,8 è considerato significativo⁴⁶.
   4. Selezionare l'elenco finale dei metaboliti significativi utilizzando i criteri Punteggio VIP>1, valore p corretto per Bonferroni<0,05⁴⁴ e AUC > 0,8⁴⁶.
3. Identificare i metaboliti come descritto di seguito.
   1. Il binning fornisce metaboliti significativi sotto forma di valori ppm piuttosto che di nomi. Identificare i metaboliti corrispondenti a specifici valori di ppm utilizzando database come la Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB)⁴⁷e lo Human Metabolome Database (HMDB).
   2. Oltre a questi, utilizzare la letteratura precedentemente pubblicata^42,44 per l'identificazione e la convalida.
   3. Utilizzare il modulo profiler del software di quantificazione dei metaboliti NMR per confermare i metaboliti identificati con i loro valori ppm.

6. Quantificazione dei metaboliti mediante software di quantificazione dei metaboliti NMR

NOTA: Il modulo profiler del software è ampiamente utilizzato per quantificare i metaboliti identificati.

1. Prima di iniziare la quantificazione, calibrare il composto di riferimento selezionato per lo studio (tsp utilizzato in questo studio) utilizzando il modulo processore. Fare clic sull'opzione Calibra CSI (indicatore di forma chimica). Indicare la concentrazione del composto di riferimento (0,05 mM per questo studio). Quindi, trascinare il picco del software sul picco di riferimento spettrale e regolarne correttamente l'altezza e la larghezza. Una volta che i picchi di riferimento spettrale si adattano al picco del software, fare clic su Accetta.
2. Aprire gli spettri desiderati nel modulo del profilatore e selezionare la libreria di composti appropriata per lo studio.
3. Nella parte inferiore dello schermo viene visualizzato un elenco di metaboliti. Seleziona il metabolita di interesse da questo elenco. Una volta selezionato, i possibili ppm del metabolita scelto appariranno nell'angolo superiore degli spettri.
4. Seleziona il valore Ppm nell'angolo in alto e ingrandisci gli spettri fino alla scala ppm specifica del metabolita.
5. A questo punto, sullo schermo compariranno due picchi: uno che rappresenta i dati registrati e l'altro, visualizzato come una linea tratteggiata, che rappresenta il picco del software. Allineare entrambi i picchi. Trascinare il picco del software e regolarne l'altezza e la posizione in modo che corrispondano al picco presente nel campione.
6. Una volta correttamente allineato, la concentrazione del metabolita può essere ottenuta dal valore visualizzato sotto la voce concentrazione in mM per quel metabolita (Figura 1).
7. Segui la stessa procedura per tutti i metaboliti e i campioni ed esporta i valori quantificati in un foglio di calcolo. Per generare il file di output, fare clic sull'opzione Operazioni batch nel menu Strumenti . Specificare la cartella desiderata per il salvataggio del file di output.

7. Analisi dei percorsi

NOTA: I metaboliti significativi identificati dopo l'analisi vengono utilizzati per determinare i principali percorsi che influenzano direttamente l'esito nei gruppi di malattia. Il modulo di analisi dei percorsi del software di analisi statistica metabolomica e il database KEGG sono generalmente utilizzati per questo scopo.

1. Inserire l'elenco ottenuto di metaboliti significativi nel modulo. Viene generato un elenco contenente i nomi dei percorsi.
2. Selezionare i percorsi finali in base a un criterio di fattore di impatto maggiore di 0,1. Valori di impatto significativi indicano percorsi correlati alla malattia³⁰.
3. Analizzare a fondo i percorsi risultanti per chiarire la disregolazione associata alla gravità della malattia. Uno dei demeriti di questo metodo è la sua inefficienza nell'identificare le vie disregolate quando i metaboliti significativi sono inferiori a 3.
4. Per far fronte a ciò, il metabolita identificato e la sua correlazione con la gravità della malattia possono essere determinati anche utilizzando la letteratura precedentemente pubblicata. Esegui un'indagine approfondita sulla letteratura e osserva se anche il metabolita identificato sta seguendo la stessa tendenza secondo il tuo interesse.

Figura 1: Passaggi fondamentali della metabolomica basata sulla risonanza magnetica magnetica. La figura presenta le fasi chiave della metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare: raccolta e preparazione dei campioni, esecuzione della spettroscopia NMR, pre-elaborazione dei dati, conduzione di analisi statistiche, identificazione e quantificazione dei metaboliti e interpretazione del significato biologico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

Per condurre uno studio di metabolomica, è essenziale determinare la dimensione del campione e i gruppi specifici che verranno analizzati. La selezione di un campione di dimensioni adeguate è essenziale per ottenere risultati significativi che siano accuratamente correlati alla gravità della malattia⁴⁸. Tuttavia, in questo particolare lavoro, abbiamo utilizzato un campione di piccole dimensioni per dimostrare i passaggi coinvolti nell'identificazione e nella quantificazione dei metaboliti utilizzando la metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare, che era destinata principalmente come riferimento. In questo studio, abbiamo esaminato le differenze metaboliche tra i pazienti negli stadi lieve e moderato di ARDS il giorno 1 del loro ricovero in terapia intensiva, includendo un totale di 8 soggetti. Seguendo il protocollo, sono stati acquisiti ed elaborati gli spettri NMR di tutti i campioni e, infine, è stato creato un foglio di calcolo con i risultati del binning.

Abbiamo quindi eseguito una rigorosa analisi statistica, in cui i fogli di binning sono stati utilizzati come file di input, normalizzando i dati utilizzando sum, log e Pareto. Abbiamo condotto PCA (Figura 2A) e OPLS-DA (Figura 2B), dove la prima ha mostrato clustering, ma la seconda ha rivelato una chiara discriminazione tra i gruppi e ha evidenziato differenze metaboliche. L'analisi statistica del test di permutazione (20x) ha prodotto valori di R2Y=0,99 e Q2=0,47. Successivamente, abbiamo eseguito un test t (Figura 2C) e un'analisi dei biomarcatori (Figura 2D) per identificare i metaboliti disregolati. Seguendo i criteri delineati nella sezione del protocollo, abbiamo filtrato i risultati in base ai metaboliti significativi (Tabella 2).

Figura 2: Analisi multivariata e univariata. (A) Analisi delle componenti principali (PCA) e (B) Analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) di pazienti con ARDS lieve (rappresentata dal colore rosso) e pazienti con ARDS moderata (rappresentata dal colore verde). (C) I grafici box-cum-whisker evidenziano le differenze nella concentrazione relativa di metaboliti tra pazienti con ARDS lieve e moderata rilevate mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica in campioni di siero. L'asse x rappresenta i gruppi di studio e l'asse y mostra la concentrazione relativa quando i pazienti con ARDS lieve (rappresentata dal colore rosso) e i pazienti con ARDS moderata (rappresentata dal colore verde) sono stati confrontati il giorno 1 del ricovero in terapia intensiva. (D) Il grafico dell'area sotto la curva (AUC) dei metaboliti significativi che predicono la gravità ottenuto dopo aver eseguito l'analisi dei biomarcatori confrontando i pazienti con ARDS lieve e moderata al giorno 1 del ricovero in terapia intensiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

S.No.	Nome	Posizione spettrale (ppm)	Valore p	VIP	Valore AUC
1	Lattato	1.34	0.04	1.99	1
2	Isoleucina	1.42	0.03	2.01	0.875

Tabella 2: Elenco dei metaboliti significativi ottenuti dopo aver confrontato i pazienti con ARDS lieve e moderata al giorno 1 del ricovero in terapia intensiva.

Poiché i risultati sono stati ottenuti in valori di ppm, abbiamo assegnato i metaboliti utilizzando la letteratura precedente e li abbiamo convalidati attraverso il profiler. Dopo l'assegnazione, il lattato e l'isoleucina sono stati ottenuti come metaboliti significativi, che sono stati riportati anche in alcuni precedenti studi sull'ARDS^30,40. Abbiamo assicurato la selezione di picchi ben risolti e non sovrapposti. Dopo l'identificazione, abbiamo filtrato l'elenco dei metaboliti significativi utilizzando i criteri menzionati nel protocollo. Abbiamo quindi quantificato i metaboliti di interesse utilizzando il modulo profiler aprendo gli spettri, cercando il metabolita di interesse e adattando il picco del software al picco ottenuto negli spettri. Ciò ha fornito i valori quantificati dei metaboliti in mM. Come riferimento è stato generato un foglio di calcolo contenente i nomi dei campioni, i nomi dei metaboliti e le concentrazioni. Dopo la quantificazione con il software, è possibile eseguire la validazione attraverso altri approcci, come la proteomica.

Inoltre, i metaboliti identificati vengono analizzati a fondo per determinare la loro correlazione con la gravità della malattia e per identificare i percorsi biochimici in cui questi metaboliti sono attivamente coinvolti. Poiché sono stati identificati solo due metaboliti significativi dopo aver utilizzato i criteri menzionati nella sezione relativa ai materiali e ai metodi, non è stato possibile eseguire l'analisi del percorso utilizzando il software. Pertanto, è stata condotta un'indagine approfondita della letteratura per evidenziare i cicli metabolici squilibrati. I due metaboliti identificati in questo studio sono correlati con successo con la gravità dell'ARDS. L'aumento del lattato denotava infiammazione polmonare e respirazione anaerobica, mentre l'aumento dell'isoleucina indicava un catabolismo proteico associato a lesioni polmonari, infezioni e metabolismo energetico⁴⁰. La comprensione di queste vie metaboliche ha un duplice scopo. In primo luogo, rivela la complessità della malattia, fornendo informazioni sui suoi meccanismi biologici. In secondo luogo, aiuta i progressi terapeutici guidando i medici nella personalizzazione dei trattamenti per i pazienti, migliorando in ultima analisi i risultati clinici.

Discussion

La metabolomica identifica e quantifica in modo efficiente i metaboliti, mirando ai cicli metabolici che diventano squilibrati durante la malattia. La qualità dei risultati dipende dall'esecuzione meticolosa di ogni fase dell'approccio metabolomico. Ogni fase, dalla selezione e raccolta dei campioni all'identificazione del percorso, è fondamentale per identificare con precisione i fattori primari che contribuiscono alla malattia. Prima di eseguire la metabolomica, è essenziale una revisione approfondita della letteratura e occorre prestare particolare attenzione in ogni fase.

Nella progettazione di uno studio di metabolomica, la selezione di un campione è fondamentale per estrarre informazioni significative e garantire una preparazione ideale del campione, sia per l'impronta digitale metabolica mirata che non mirata della condizione clinica in esame. La corretta elaborazione iniziale del campione è fondamentale e i protocolli devono essere seguiti in modo coerente per tutti i campioni durante lo studio⁴⁹. È necessaria una particolare cautela quando si lavora con campioni clinici. I campioni comunemente usati per la metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare includono biofluidi, estratti cellulari ed estratti tissutali^50,51. Il liquido cerebrospinale (CSF) e l'urina spesso richiedono un pretrattamento minimo e sono spesso studiati in contesti come disturbi renali, malattie neurodegenerative e tossicità da farmaci. Il sangue intero, il plasma e il siero forniscono informazioni complete per un ampio spettro di malattie critiche e sono preferiti per la facilità di raccolta. Un'ampia gamma di altri biofluidi, come il liquido seminale, la saliva, la bile, il liquido di dialisi, il liquido amniotico, il condensato del respiro espirato, gli aspirati polmonari, il liquido sinoviale e il mini liquido di lavaggio broncoalveolare (mBALF), sono stati ampiamente utilizzati per la loro specificità e accuratezza utilizzando NMR 52,53,54. Ogni biofluido presenta i suoi vantaggi e le sue sfide per quanto riguarda la raccolta, la disponibilità e il contenuto informativo, a seconda dello studio o del disegno sperimentale⁵⁵. Per questo studio ci siamo concentrati su campioni di siero di pazienti con ARDS, poiché i campioni di sangue in genere offrono informazioni a livello di tutto il corpo e non sono influenzati in modo significativo da variazioni giornaliere estreme. D'altra parte, i campioni di urina sono soggetti a varie fluttuazioni e possono essere influenzati da dieta, stile di vita, farmaci e fattori ambientali²⁷. Anche la corretta conservazione dei campioni è importante per evitare l'attività enzimatica o la degradazione microbica. I campioni sono in genere crioconservati a -80 °C con cicli di congelamento-scongelamento minimi per prevenire la degradazione metabolica e mantenere la stabilità del campione. Il campione può essere conservato a -80 °C per periodi prolungati, consentendo di condurre comodamente la sperimentazione NMR. Tuttavia, per ottenere risultati ottimali, è consigliabile pianificare ed eseguire l'esperimento il prima possibile.

In questo studio, abbiamo impiegato uno spettrometro NMR a 800 MHz per l'acquisizione dei dati, che fornisce dati spettrali ad alta risoluzione. Per questo esperimento, abbiamo aderito agli stessi parametri di acquisizione sopra menzionati. Tuttavia, è importante notare che gli stessi parametri di acquisizione descritti in questo protocollo possono essere applicati utilizzando spettrometri NMR che operano ad altre intensità di campo magnetico. Il numero di scansioni può essere aumentato quando si opera a un campo magnetico inferiore per migliorare la risoluzione. Mentre le intensità di campo più elevate possono offrire una maggiore risoluzione, gli aspetti principali del processo di acquisizione, come le sequenze di impulsi, i ritardi di rilassamento e il controllo della temperatura, rimangono coerenti tra i diversi strumenti, garantendo la riproducibilità e l'affidabilità dei risultati.

Seguire una procedura standardizzata è essenziale per mantenere la riproducibilità e l'imparzialità, poiché le deviazioni possono ostacolare la successiva analisi e valutazione dei dati. Ogni fase della sperimentazione NMR deve essere eseguita meticolosamente, poiché la qualità degli spettri dipende da essi. Particolare attenzione deve essere prestata allo spessore, in quanto definisce la forma del picco, e i parametri di acquisizione devono essere ottimizzati in base al campione e al disegno dello studio. Per i campioni con bassa concentrazione metabolica nel campione, il numero di scansioni può essere aumentato. L'acquisizione dei dati in NMR comporta l'ottimizzazione standard di esperimenti 1D e 2D su misura per la scelta del campione e le informazioni specifiche richieste. Vari esperimenti NMR sono stati ottimizzati per ottenere spettri di alta qualità dai biofluidi, riducendo al minimo l'impatto delle macromolecole indesiderate. La sequenza di impulsi CPMG⁵⁶ è preferita per campioni come siero, plasma o liquido cerebrospinale. Questa tecnica sopprime i segnali ampi provenienti da macromolecole come lipidi e proteine, che hanno lunghi tempi di rilassamento trasversale e possono oscurare le risonanze dei metaboliti a basso peso molecolare.

La pre-elaborazione dei dati comprende i metodi intermedi utilizzati per garantire un'analisi uniforme e omogenea dei dati e la loro interpretazione. Questo processo include l'eliminazione di segnali indesiderati o regioni spettrali soggette a incongruenze e la correzione degli spostamenti dei picchi. Nei biofluidi, escludere le regioni indesiderate spesso significa rimuovere i segnali, come quelli provenienti dall'acqua, che dominano l'intervallo da 4,6 ppm a 5 ppm. Gli spostamenti dei picchi, causati da variazioni di pH, temperatura, concentrazione di sale, fattori di diluizione e composizione ionica, possono essere ridotti al minimo utilizzando tamponi a pH omeostatico. Inoltre, l'uso di composti di riferimento standard, l'allineamento dei picchi e il binning possono aiutare a ridurre gli spostamenti dei picchi. L'allineamento dei picchi è fondamentale per correlare i modelli tra diversi spettri acquisiti in condizioni identiche.

L'elaborazione degli spettri deve essere eseguita correttamente per garantire un binning accurato nelle fasi successive dell'analisi. Tutti gli spettri devono essere calibrati e allineati in modo uniforme e le correzioni di base e di fase possono essere eseguite manualmente o automaticamente. La corretta correzione di fase e base, così come la calibrazione, sono fondamentali. L'esecuzione della correzione del basale è essenziale per evitare distorsioni che possono influire sull'identificazione e la quantificazione dei metaboliti⁵⁷. La correzione di fase è necessaria per garantire che i picchi distorti o invertiti non possano influenzare l'interpretazione dei risultati. Decidi attentamente i criteri per la selezione dei metaboliti significativi e filtra i risultati di conseguenza. Poiché il binning fornisce risultati sotto forma di valori ppm, identificare con precisione il nome del metabolita utilizzando varie fonti menzionate nel protocollo. Se sono presenti più metaboliti agli stessi valori di ppm, identificarli attraverso la forma del picco.

Prima di eseguire l'analisi statistica, viene eseguita la normalizzazione per ridurre le variazioni nel set di dati, indotte o meno, dovute a differenze di entità e fluttuazioni nelle concentrazioni di metaboliti. Questo processo prevede vari metodi di centratura, ridimensionamento e trasformazione, scelti in base alla distribuzione e alla variabilità dei dati. L'obiettivo è ridurre al minimo i pregiudizi sistematici indesiderati preservando i fattori biologici di interesse. I metodi multivariati, tra cui PCA, PLS-DA e OPLS-DA, vengono utilizzati per stabilire metaboliti differenziali con valori VIP superiori a 1. La prevedibilità e la convalida incrociata del modello sono determinate utilizzando i valori R2 (bontà dell'adattamento) e Q2 (bontà della previsione), mentre le statistiche dei test di permutazione convalidano il modello. Una mappa di calore basata sulla correlazione di Pearson valuta la robustezza del modello enumerando i metaboliti sovraregolati e sottoregolati nei sottofenotipi e gli endotipi risultanti.

Metodi univariati, come il t-test di Student e l'ANOVA, come la correzione di Bonferroni o la minimizzazione di FDR (tasso di false scoperte) e Benjamini-Hochberg, sono utilizzati per ridurre la probabilità di falsi positivi. Questi metodi forniscono una misura approssimativa di caratteristiche potenzialmente importanti indipendentemente dalla loro correlazione all'interno o tra le molecole e altri fattori confondenti. I metaboliti significativi vengono identificati sulla base di un valore p inferiore a 0,05, che vengono poi utilizzati per convalidare gli endotipi metabolici nei sottogruppi^{di esito 45}.

I singoli box whisker plot e l'AUROC sono impiegati per valutare la specificità e la sensibilità degli endotipi nei sottogruppi di esito. Il punteggio clinico viene combinato con il modello in AUROC per convalidare l'accuratezza del modello. Il valore AUC > 0,8 è considerato significativo⁴⁶. Vari altri test sono disponibili online per testare l'accuratezza della discriminazione e l'efficacia dei metaboliti identificati. Alcuni di essi sono la classificazione casuale delle foreste, la mappa termica, la correlazione, ^ecc.45.

Vengono utilizzati vari approcci per quantificare i metaboliti significativi, tra cui l'integrazione dei picchi, che può essere difficile per i principianti a causa della loro natura avanzata. Identificare i picchi caratteristici per i metaboliti facendo riferimento ai singoli cambiamenti chimici per un'identificazione precisa. Determinare l'area di questi picchi caratteristici rispetto all'area del picco di riferimento, TSP. Per calcolare la concentrazione assoluta di un metabolita (Cm), utilizzare la seguente equazione:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Dove Cr è la concentrazione del composto di riferimento (TSP) nella soluzione, Im e Ir sono le aree di picco integrate (possono essere ottenute utilizzando lo strumento di elaborazione e analisi NMR) del metabolita e del riferimento (TSP), rispettivamente, e nm e nr sono il numero di protoni che rappresentano il metabolita e i picchi di riferimento, rispettivamente²⁴.

In alternativa, il software di quantificazione automatizzata dei metaboliti NMR viene utilizzato per ottenere concentrazioni di metaboliti per spettri singoli o multipli in base alla concentrazione dello standard di riferimento, TSP. La quantificazione tramite software semplifica il processo e riduce la probabilità di errori rispetto ad altri metodi. Sebbene questo documento di ricerca evidenzi l'uso del software per la quantificazione dei metaboliti, possono esserci problemi se il metabolita di interesse non è presente nella libreria del software. Inoltre, il software è a pagamento, quindi solo i ricercatori con una licenza autorizzata possono utilizzarlo.

La metabolomica si è dimostrata determinante nel svelare le complessità di varie malattie, identificando i cicli metabolici disregolati che contribuiscono alla gravità della malattia. Tuttavia, tradurre questi risultati nella pratica clinica è stato difficile. La comunità medica sta ora enfatizzando un approccio di medicina personalizzata per migliorare gli esiti della malattia. Mentre in precedenza era sufficiente identificare i metaboliti disregolati, gli sforzi attuali si concentrano su una quantificazione precisa per definire intervalli specifici per malattia. Queste informazioni sono preziose per i medici nella personalizzazione delle strategie di trattamento. I progressi nelle tecniche di quantificazione hanno facilitato gli sforzi di ricerca, con numerosi gruppi di ricerca in tutto il mondo che impiegano con successo questi approcci utilizzando software specializzati.

Questo progresso sottolinea il potenziale della metabolomica di avere un impatto significativo sulla medicina personalizzata e migliorare i risultati clinici. Inoltre, l'integrazione dei dati di metabolomica con altri dati omici, come la genomica e la proteomica, promette di fornire una comprensione più completa dei meccanismi della malattia e di perfezionare ulteriormente gli interventi terapeutici. Con la continua evoluzione della tecnologia, si prevede che la precisione e l'utilità della metabolomica in ambito clinico aumenteranno, aprendo la strada a soluzioni sanitarie più efficaci e personalizzate.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canada		Software di quantificazione dei metaboliti NMR
Inserto coassiale	Sigma aldrich	Z278513
Ossido di deuterim	Sigma aldrich	151882
Eppendorf provette	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		Software di analisi statistica metabolomica
Tubo NMR	Wilmad	Z412007	Pipetta da 5 mm di diametro
	Eppendorf research plus	3123000039	0-100 μ l
Fiale di raccolta campioni Fiale	criogeniche Tarsons	523194
Sodio azide	Sigma aldrich	S2002
Cristallo di cloruro di sodio	Sigma aldrich	S9625
Sodio fosfato bibasico	Sigma aldrich	567550
Sodio fosfato monobasico	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Strumento di elaborazione e analisi RMN	Bruker
Sale Tsp	Sigma aldrich	269913