Presentazione delle proteoforme istoniche con l'elettroforesi su gel 2D-TAU

Sommario

Questo metodo descrive una strategia semplice e veloce per la caratterizzazione e l'indagine della proteoforma istonica.

Abstract

Gli istoni subiscono varie modificazioni post-traduzionali (PTM) come la metilazione, l'acetilazione, la fosforilazione, l'acilazione e l'ubiquitinazione, che controllano la dinamica dei nucleosomi e determinano il destino cellulare. Il nucleosoma, che è l'unità funzionale della cromatina, comprende il DNA, quattro coppie di istoni (H3, H4, H2A e H2B) che costituiscono il nucleo globulare e l'istone linker H1, che stabilizza la struttura della cromatina. Le code amminiche (N)-terminali degli istoni sporgono dai domini del nucleo globulare e subiscono PTM distinti che influenzano il panorama della cromatina. Alcune prove suggeriscono che l'omeostasi dell'istone PTM è fondamentale per preservare tutte le attività fisiologiche. La deregolazione dei PTM istonici è la causa principale della proliferazione cellulare anormale, dell'invasione e delle metastasi. Pertanto, lo sviluppo di metodi per caratterizzare i PTM istonici è fondamentale. Qui descriviamo una tecnica efficace per isolare e analizzare le isoforme degli istoni. La metodica, basata sulla combinazione di due separazioni ortogonali, consente l'arricchimento delle isoforme istoniche e la successiva identificazione con spettrometria di massa. La tecnica, originariamente descritta da Shechter et al., combina gel di poliacrilammide acido-urea (TAU-GEL), in grado di separare le proteine istoniche basiche in base alle dimensioni e alla carica, e gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), che possono separare le proteine in base al peso molecolare. Il risultato è una mappa bidimensionale delle isoforme istoniche, adatta per la digestione in gel seguita dall'identificazione con spettrometria di massa e dall'analisi western blot. Il risultato è una mappa bidimensionale delle isoforme istoniche, adatta sia per la digestione in gel che per l'identificazione con spettrometria di massa e l'analisi western blot. Questo approccio proteomico è un metodo robusto che consente l'arricchimento di una singola isoforma istonica e la caratterizzazione di nuovi PTM istonici.

Introduzione

L'insorgenza, la progressione e la chemioresistenza del cancro sono correlate a eventi genetici ed epigenetici, inclusi i PTM istonici. Gli istoni subiscono una varietà di PTM che regolano la dinamica della cromatina e determinano il destino cellulare¹.

Il nucleosoma è l'unità funzionale della cromatina ed è un complesso molecolare di DNA e proteine che consente al DNA di essere impacchettato nel nucleo. È costituito da quattro coppie di istoni (H3, H4, H2A e H2B) che costituiscono il nucleo del nucleosoma, nonché l'istone linker H1, che aiuta a stabilizzare la struttura della cromatina. Le code ammino-terminali degli istoni sporgono dai loro domini centrali globulari e subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali che influenzano il paesaggio della cromatina².

Finora sono note almeno 23 classi di PTM istoniche. Questi PTM sono modificazioni covalenti che consistono principalmente in metilazione, acetilazione, fosforilazione, glicosilazione, ubiquitilazione, SUMOilazione e ADP-ribosilazione³. Inoltre, è stata recentemente proposta una stretta correlazione tra l'omeostasi dell'epigenoma e il ricablaggio metabolico, il che spiega la crescita esponenziale del possibile numero di istoni PTM 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . I PTM istonici, depositati, cancellati e trasdotti da enzimi modificatori, sono denominati rispettivamente scrittori, gomme e lettori. Influenzano le proprietà fisiche e chimiche della struttura della cromatina, influenzando il profilo di espressione genica, compresa l'espressione dei geni oncosoppressori e degli oncogeni 14,15,16.

Il numero di proteoformi degli istoni aumenta quando incorporati nel nucleosoma come varianti istoniche. Queste varianti sono isoforme non alleliche degli istoni canonici e aggiungono complessità alterando le proprietà chimiche e fisiche della cromatina. Rispetto agli istoni canonici, le varianti istoniche hanno domini funzionali che subiscono modifiche post-traduzionali uniche o interagiscono con specifici componenti della cromatina, influenzando la dinamica e la stabilità del nucleosoma¹⁷.

Nelle cellule tumorali, la deregolazione dei PTM istonici e delle varianti influisce sul profilo di espressione genica, portando a proliferazione cellulare anormale, invasione, metastasi e attivazione di vie di resistenza ai farmaci 3,18,19,20. Le mutazioni all'interno degli istoni o dei complessi di rimodellamento della cromatina possono alterare il fenotipo cellulare, contribuendo alla trasformazione neoplastica. L'accumulo di alterazioni epigenetiche, come la metilazione degli istoni, è un fattore chiave nell'attivazione delle vie di resistenza ai farmaci 21,22,23. Le mutazioni all'interno del complesso SWI/SNF, che consiste di 15 subunità codificate da 29 geni, hanno un impatto su oltre il 20% dei tumori umani in molti tipi di tumore. Nell'ultimo decennio, sono state sviluppate strategie farmacologiche su base epigenetica (epi-farmaci) e molti farmaci mirati al cancro con modelli di modifica istonici anomali sono stati approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati ^Uniti23.

L'analisi delle proteine istoniche è piuttosto impegnativa, il che la rende un'area di studio impegnativa. Recentemente, i metodi di spettrometria di massa sono diventati il metodo preferito per caratterizzare e studiare le proteoforme istoniche. Tuttavia, le drastiche condizioni di estrazione, in combinazione con la scarsa solubilità di alcune varianti e l'elevata omologia di sequenza, rendono la loro analisi impegnativa.

Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati diversi metodi basati sulla spettrometria di massa per la profilazione e l'indagine degli istoni 24,25,26,27. In questo studio, presentiamo un metodo economico e affidabile per creare una mappa bidimensionale delle proteoforme istoniche, che può aumentare le possibilità di scoprire nuove modifiche post-traduzionali.

L'elettroforesi TAU 2D combina la separazione in condizioni acide con SDS PAGE. Nella prima dimensione, la condizione acida del mezzo conferisce una carica positiva netta alle proteine basiche. Poiché gli istoni sono proteine molto basiche e hanno un punto isoelettrico (pH) più alto rispetto al mezzo, si caricano positivamente e migrano sotto un campo elettrico. Nella seconda dimensione, gli istoni vengono denaturati mediante SDS e separati in base al loro peso molecolare. La mappa 2D risultante può essere utilizzata come strumento per arricchire proteoforme specifiche con risoluzione a punto singolo per analisi di spettrometria di massa e studi immunologici^28,29. Dopo l'elettroforesi, i punti TAU 2D possono essere colorati, digeriti con tripsina e analizzati mediante spettrometria di massa. In alternativa, la mappa TAU 2D può essere tamponata su un filtro nitrocellulosa/PVDF e studiata mediante immunocolorazione²⁷.

In questo contesto, i metodi potrebbero essere strategici per migliorare l'identificazione e l'analisi di nuove modificazioni post-traduzionali correlate con il ricablaggio metabolico^30,31.

Abbiamo ulteriormente migliorato il metodo originale incorporando una fase di sonicazione, utile per la degradazione del DNA e per migliorare la solubilità delle proteine. Inoltre, abbiamo prolungato la fase di incubazione per l'estrazione degli istoni, al fine di ottenere un campione proteico con elevata purezza. Inoltre, nel nostro protocollo, abbiamo eseguito la prima dimensione a bassa tensione per una durata maggiore per ottenere una migliore risoluzione. Il gel risultante è stato utilizzato per studiare i PTM degli istoni canonici e caratterizzare nuove modifiche come la glicazione^10,32.

Nel complesso, abbiamo sviluppato un metodo per l'estrazione e la purificazione degli istoni, seguito dalla risoluzione delle proteoforme istoniche utilizzando una mappa bidimensionale. Il lavoro include anche una procedura per la digestione in gel per l'analisi della spettrometria di massa e le fasi per l'analisi bidimensionale del western blot.

Protocollo

1. Estrazione degli istoni

1. Eseguire l'estrazione degli istoni da almeno 1 x 10⁶ cellule, che sono confluenti all'80%. Per questo esperimento, abbiamo utilizzato linee cellulari MCF-10A di ATCC. Dopo la piastratura, lavare le celle tre volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x. Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio.
2. Preparare un tampone per lisi cellulare contenente 10 mM di Tris-HCl pH 8,0, 1 mM di KCl e 1,5 mM di MgCl₂. Aggiungere 1 mM di ditioeritritolo e inibitori della proteasi e della fosfatasi appena prima dell'uso.
3. Aggiungere 800 μl di tampone di lisi cellulare alla piastra di Petri contenente le cellule, raschiare e raccogliere le cellule in una provetta da 1,5 mL, quindi incubare su un rotatore a 300 giri/min, 4 °C per 1 ora.
4. Centrifugare a 10.000 x g, 4 °C, per 10 minuti in una microcentrifuga preraffreddata con un rotatore per provette da 1,5 mL.
5. Lavare il pellet con 400 μL di tampone di lisi cellulare e centrifugare a 10.000 x g, 4 °C, per 10 minuti. Scartare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio 3 volte.
   NOTA: Utilizzare una microcentrifuga preraffreddata (4 °C) con un rotatore per provette da 1,5 ml per tutti i passaggi. Maneggiare il pellet con cura per evitare perdite di materiale.
6. Risospendere il pellet in 640 μL di 0,2 M H₂SO₄ e incubare su un rotatore a 300 giri/min, a 4 °C, per 16 ore.
   ATTENZIONE: L'acido solforico è una sostanza chimica pericolosa; Si prega di utilizzarlo sotto una cappa chimica.
7. Centrifugare a 16.000 x g, 4 °C, per 10 min. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo e conservarlo fino ai passaggi successivi. Scartare i detriti nucleari.
8. Precipitare gli istoni aggiungendo 212 μL di acido tricloroacetico, goccia a goccia (la concentrazione finale di TCA è del 33%). Mescolare la soluzione capovolgendo il tubo 10x. Incubare su ghiaccio, al buio, per 16 h.
   ATTENZIONE: Il TCA è una sostanza chimica pericolosa; Utilizzare sotto una cappa chimica.
9. Pellet di istoni mediante centrifuga preraffreddata a 16.000 x g per 10 min a 4 °C. Rimuovere con cura il surnatante e lavare il pellet 3 volte con 200 μl di acetone freddo.
10. Risospendere il pellet con acetone freddo, quindi sonicare ad alta potenza 2 volte con 3 cicli di 30 s on/off, alternati a una pausa di 10 minuti sul ghiaccio.
    NOTA: La procedura è stata eseguita utilizzando un ultrasuonatore. Questo passaggio è essenziale per eliminare il DNA avvolto nell'istone.
11. Centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti, scartare l'acetone e risospendere il campione in 100 μl di acqua bidistillata. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo del saggio Bradford, secondo le istruzioni del produttore³³.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, il pellet a volte appare bianco o traslucido. Un precipitato bianco e opaco potrebbe indicare la presenza di contaminanti salini che potrebbero compromettere la separazione 2D. In tal caso, ripetere le fasi di lavaggio con acetone fino a quando il pellet non diventa traslucido.
12. Liofilizzare 70 μg di istoni, secondo le istruzioni del produttore. Impostare il liofilizzatore a 30 °C per 60 min. Controllare il volume della provetta e ripetere il passaggio a 30 °C fino a quando il campione non è completamente liofilizzato (generalmente sono necessari 90 minuti per liofilizzare completamente il campione). Dopo 60 minuti, controllare il volume ogni 10 minuti poiché il processo dipende dal campione.
    NOTA: Se la quantità di proteine istoniche è bassa, iniziare da 2 x 10⁶ cellule. In questo caso, utilizzare lo stesso volume di reagenti utilizzato per 1 x 10⁶ cellule. Verificare la purezza di tutte le sostanze chimiche utilizzate durante la procedura; tutti i reagenti devono essere di grado HPLC.

2. Elettroforesi mini 2D su gel tritone-acido-urea (TAU)

1. Preparare un gel mini-TAU per un mini sistema di elettroforesi verticale su gel di poliacrilammide come descritto di seguito.
   1. Preparare il gel separatore: 6 M di urea, 15% acrilammide/bisacrilammide (29:1), 5% acido glaciale acetico, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Per preparare la soluzione, sciogliere l'urea in acrilammide/bis e 1 mL di acqua ultrapura agitando delicatamente a temperatura ambiente; Aggiungi gli altri componenti e regola il volume. Per un gel mini-TAU, preparare 10 ml di soluzione. Riempire le piastre di gel preimpostate con la soluzione, evitando la formazione di bolle d'aria a soli 1,5 cm dall'alto. Coprire la soluzione con 1 mL di isopropanolo per livellare il gel.
   2. Preparare il gel di impilamento: 6 M di urea, 6% acrilammide/bisacrilammide (29:1), 5% acido glaciale acetico, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Per preparare la soluzione, sciogliere l'urea in acrilammide/bis e 1 mL di acqua ultrapura; Aggiungi gli altri componenti e regola il volume. Riempire le piastre di gel con la soluzione impilabile, posizionare un pettine di gel a 10 pozzetti tra le piastre e inserirlo fino a quando la soluzione di gel non arriva a metà dei denti del pettine. Lasciare polimerizzare il gel per 16 ore a 4 °C.
      NOTA: Inserire con cura il pettine per garantire la formazione regolare dei pozzetti.
2. Preparare 100 μL di tampone per campioni TAU sciogliendo 6 M di urea, acido glaciale acetico al 5% e acqua distillata doppia. Sciogliere il campione liofilizzato preparato in 30 μl di tampone per campioni TAU.
3. Riempire la mini cassetta con tampone di corsa TAU, concentrazione finale di acido acetico al 5%. Sciacquare i pozzetti del TAU-gel con una siringa riempita di tampone scorrevole e caricare il campione nel pozzetto utilizzando una micropipetta.
4. Collegare la camera elettroforetica all'alimentazione, con l'elettrodo positivo (rosso) posto nella parte inferiore. Prestare attenzione, quando l'IP > il pH, le proteine sono caricate positivamente, quindi la migrazione è dall'elettrodo positivo a quello negativo. Far funzionare il gel prima a 30 V per 70 minuti, poi alla tensione costante di 25 V per 17 ore.
   NOTA: Durante questo periodo, spegnere di tanto in tanto l'alimentazione e sciacquare i pozzetti del gel utilizzando una siringa monouso. Prestare attenzione a rimuovere eventuali bolle dalla superficie inferiore del gel utilizzando una siringa per evitare la perdita di campione e la presenza di una sbavatura nelle proteine risolte.
5. Rimuovere il gel dalle piastre di gel e tagliare la linea di interesse con un bisturi pulito. Maneggiare con cura il gel per evitare la rottura del gel. Poiché la linea di interesse è incolore, caricare il campione nel pozzetto numero 1 per identificare e tagliare esattamente la corsia di interesse.
   NOTA: Per controllare la separazione sul gel mini-TAU, preparare ed eseguire il campione in duplicato. Uno di questi gel può essere colorato con Coomassie Brilliant Blue. Il modello di separazione è riportato nella Figura 1A.
6. Lavare la corsia con 15 mL di Tris-HCl 0,5 M pH 8,8 per 15 minuti.
7. Preparare 15 mL di tampone di equilibrio 1 utilizzando 6 M di urea, 0,5 M di Tris-HCl, pH 6,8, glicerolo al 30%, SDS al 20% e ditioeritritolo al 2%. Preparare 15 mL di tampone di equilibrio 2, utilizzando 6 M Urea, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glicerolo, 20% SDS e 2% Iodoacetammide. Preparare i tamponi di equilibratura 1 e 2 poco prima dell'uso; Conservare il tampone di equilibratura 2 al buio.
8. Incubare la corsia del gel, agitando delicatamente, in 10 mL di tampone di equilibrio 1 per 15 minuti, quindi decantare. Incubare la corsia del gel, agitando delicatamente, con 10 mL di tampone di equilibrio 2 per 15 minuti al buio, quindi decantare.
9. Preparare un gel risolutivo di acrilammide SDS al 15% seguendo la Tabella 1. Preparare la piastra in gel e riempirla con la soluzione in gel risolutiva. Riempire la soluzione fino a quando non si trova a 1,5 cm dall'estremità della lunga piastra di gel. Metti 1 ml di isopropanolo sulla superficie per livellare il gel e lasciarlo polimerizzare.
10. Dopo la polimerizzazione su gel, decantare l'isopropanolo e asciugare il pozzetto con carta per cromatografia di cellulosa Chr da 3 mm. Inserire la corsia risultante dal passaggio 8 nel pozzetto del gel.
11. Sigillare la corsia al gel risolutore con una soluzione sigillante di agarosio a basso punto di fusione allo 0,5% in 1 tampone Tris/glicina/SDS e 5 μL di blu bromofenolo allo 0,003%. Lasciare polimerizzare il gel di agarosio per 30 minuti.
    NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria durante la sigillatura dell'agarosio per evitare la sbavatura del gel.
12. Metti le piastre di gel nella cassetta e riempile con 1x tampone Tris/glicina/SDS. Far scorrere il gel a 120 V fino a quando il colorante blu bromofenolo raggiunge il fondo. Rimuovere delicatamente il gel dalle piastre, eliminare l'eccesso di agarosio e colorare d'argento il gel utilizzando una procedura compatibile con la spettrometria di massa o il blot per il test immunologico.

3. Colorazione dell'argento ³²

1. Preparare i seguenti reagenti - Fissativo: 50% metanolo, 5% acido acetico, 45% acqua deionizzata; Soluzione di lavaggio: 50% metanolo, 50% acqua deionizzata; Sensibilizzante: 0,02% Na₂S₂O₃ 5H₂O in acqua deionizzata; Reattivo d'argento: nitrato d'argento 0,1% in acqua deionizzata fredda (4°C); Sviluppatore: 0,04% Formalina e 2% Na₂CO₃, Formaldeide (37%) (aggiungere poco prima dell'uso) 0,4 mL di acqua deionizzata e riempire fino a 1000 mL; Reagente di arresto: acido acetico al 5%; Soluzione di conservazione in gel: acido acetico all'1%.
   NOTA: Poiché i prodotti chimici utilizzati per la colorazione sono pericolosi, eseguire tutti i passaggi sotto una cappa chimica.
2. Seguire la procedura nella Tabella 2 con la seguente considerazione. Eseguire tutte le incubazioni con una leggera agitazione. Preparare il reagente di arresto prima di iniziare la fase di sviluppo; Ciò garantirà lo sviluppo del gel con l'intensità opportuna. Durante la fase di sviluppo, le macchie appariranno come segnali gialli che diventeranno marrone chiaro alla fine dell'incubazione. L'intensità delle diverse macchie dipenderà dalla quantità di proteoforme istoniche. Il gel è pronto per l'escissione spot e la digestione in gel (Figura 1B)

4. Digestione in gel

1. Preparare le seguenti soluzioni: 50 mM di bicarbonato di ammonio (NH₄HCO3)/50% (v/v) acetonitrile; 10 mM di ditiotreitolo (DTT) in 50 mM di NH₄HCO₃; 55 mM di iodoacetammide (IAA) in 50 mM di NH₄HCO₃; 0,1% TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; Acetonitrile di grado HPLC; Provette in silicone da 1 mL.
   NOTA: Per eludere la contaminazione da cheratina umana, dai capelli o dalla pelle, utilizzare guanti puliti e lavorare in un'area pulita.
2. Asportare le macchie istoniche di interesse dal gel colorato utilizzando un bisturi pulito e inserirle in una provetta di silicone fresca (1,5 ml). Fare attenzione ad asportare un singolo punto e metterlo in un'unica provetta per evitare la contaminazione incrociata delle isoforme.
3. Aggiungere a ogni spot di gel 250 μL di 50 mM NH₄HCO₃/50% acetonitrile e incubare agitando delicatamente in un termomiscelatore a temperatura ambiente. Decantare la soluzione e ripetere questo passaggio 3 volte. I pezzi di gel appariranno trasparenti.
4. Disidratare le macchie di gel aggiungendo acetonitrile (200 μL). In questa fase i pezzi di gel assumeranno un colore bianco opaco.
5. Decantare l'acetonitrile e lasciare asciugare all'aria per 10 minuti. Il pezzo di gel apparirà asciutto nel tubo. La riduzione e l'alchilazione non sono essenziali poiché le proteine istoniche sono state ridotte e alchilate durante la fase di equilibrio.
6. Reidratare le macchie di gel in 20 μL di soluzione di tripsina (0,1 mM HCl) o un volume sufficiente a coprire i pezzi di gel. Posizionare le provette nel termomiscelatore e incubare, agitando delicatamente, a 37 °C per un minimo di 4 ore fino a 16 ore.
7. Trasferire il surnatante contenente i peptidi triptici in una nuova provetta. Aggiungere 50 μL di soluzione di estrazione (60% acetonitrile, 1% TFA) ai pezzi di gel e sonicare 2 volte in un bagno d'acqua a ultrasuoni per 10 minuti a 4 °C.
8. Trasferire il surnatante, contenente ulteriori peptidi triptici, nella provetta fresca. Utilizzare un liofilizzatore per essiccare i peptidi estratti in pool. Impostare il liofilizzatore a 30 °C e asciugare la soluzione; Nel tubo apparirà un pellet liofilizzato.
   NOTA: questo passaggio dipende dal volume; In genere, 1 ora è sufficiente, ma controllare il volume ogni 10 minuti fino a quando il campione non è completamente asciutto.
9. Aggiungere 15 μl di TFA allo 0,1 % in ciascuna provetta e incubare delicatamente in un termomiscelatore a 25 °C. Trasferire il surnatante nella fiala per l'analisi LC-MS/MS.

5. 2DTAU western blot

1. Preparare il tampone di trasferimento, 250 mM di base Tris, 92 mM di glicina e il 10% di metanolo utilizzando acqua bidistillata.
2. Tagliare la membrana di nitrocellulosa e la carta da filtro alle dimensioni del gel.
3. Equilibrare il gel e immergere la membrana, la carta da filtro e la carta da filtro nel tampone di trasferimento per 15 minuti. Utilizzare membrane in nitrocellulosa o PVDF. Se si utilizzano membrane in PVDF (difluoruro di polivinilidene), attivarle immergendole in MetOH al 100%.
4. Preparare il sandwich di gel nella cassetta per un trasferimento semi-secco come segue: Elettrodo negativo/Carta da filtro/Gel/Membrana in nitrocellulosa/Carta da filtro/Elettrodo positivo. Rimuovere eventuali bolle d'aria tra il gel e la membrana per garantire buoni risultati.
5. Posizionare la cassetta nell'unità semi-secca e far funzionare la macchia a 25 V per 30 minuti. Al termine, smontare il sandwich di blotting e conservare la membrana per il test immunologico. Verificare l'efficienza di trasferimento con la colorazione Ponceau. Segna la membrana con un segno in alto a destra per preservare il corretto orientamento del filtro.
6. Incubare con anticorpi primari e secondari a seconda dell'esperimento (Figura 2).

Risultati

Nella Figura 1A, è possibile osservare come le proteine istoniche migrano in un gel 1D. Questo è un importante passo preliminare per comprendere il tempo di esecuzione della prima dimensione. Una volta determinato il momento giusto di separazione, esegui la seconda dimensione. La mappa 2D delle proteoforme istoniche mostra un modello topografico distintivo (Figura 1B). Ogni punto nella Figura 1B rappresenta un tipo di istono specifico. Osservare l'esatta regione del gel in cui si trova ogni proteoforma istonica. L'identificazione della spettrometria di massa per ogni proteoforme istonico è riportata in Perri et ^al.32. Pertanto, ogni punto in questa condizione è associato a un tipo specifico di istodio. La presenza di ulteriori macchie, accanto a quelle canoniche, può indicare l'esistenza di nuove modificazioni. Le immagini su gel possono essere acquisite utilizzando la densitometria e l'immagine risultante può essere analizzata utilizzando un software di analisi delle immagini.

L'affidabilità della mappa TAU 2D dipende dalla rotondità del luogo. Se la corsa è stata eseguita correttamente, i punti appariranno come segnali distinti e non saranno visibili striature orizzontali e verticali. Al contrario, le impurità nel campione, nelle soluzioni e nella sovrapposizione di agarosio potrebbero causare striature e/o strisce nel gel. La qualità del gel influirà sulla digitalizzazione dell'immagine e sulla successiva analisi quantitativa e qualitativa. Inoltre, potrebbe influenzare il successo dell'analisi Western Blot e delle indagini sulla SM. Per verificare l'affidabilità del metodo, abbiamo sondato la membrana nitrocellulosica dei proteoformi istonici risolti con l'anticorpo primario Acetilato-Lisina (Ac-K2-100) Rabbit mAb³² (Figura 2). Un anticorpo secondario HRP anti-coniglio è stato utilizzato per rilevare i segnali istonici. Come previsto, utilizzando un densitometro, è possibile quantificare la peculiare modificazione post-traduzionale su ogni variante istonica presente nel blot.

Figura 1: TAUgel 1D e 2D. (A) Immagine rappresentativa del modello topografico degli istoni ottenuta utilizzando TAUgel 1D. (B) Immagine rappresentativa del pattern topografico istonico ottenuta utilizzando 2D TAUgel. Le identificazioni dei dati sono riportate da Perri et al. ³². Come previsto, ogni punto rappresenta una specifica proteoforma istonica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Western blot rappresentativo di 2DTAU. Nell'immagine è possibile osservare il livello di acetilazione della lisina in ogni proteoforme istonico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagenti	Concentrazione: 15%
40% acrilammide/bis	3.75
1,5 M Tris pH 8,8	2,5 ml
MilliQ acqua	3,6 ml
10% SDS	100 μl
10% APS	50 μl
TEMED	5 μl

Tabella 1: Risoluzione della composizione della soluzione in gel.

Passo	Ore
Fissaggio 50% metanolo / 5% acido acetico	1 ora
Lavare con etanolo al 30%	2 x 20 minuti
Lavare l'acqua deionizzata	1 x 20 minuti
Sensibilizzante Reagente tiosolfato	1 minuto
Lavare l'acqua deionizzata	3 x 20 secondi
Argento Nitrato d'argento	30 minuti
Lavare l'acqua deionizzata	3 x 1 minuto
Sviluppo Sviluppatore	25-30 min Nota: sviluppare il gel fino a quando le macchie sono visibili (marrone chiaro)
soluzione di arresto	1 x 10 minuti
Lavare l'acqua deionizzata	2 x 5 minuti
Lavare l'acqua deionizzata	1 ora

Tabella 2: Metodo di colorazione dell'argento.

Discussione

Nell'ultimo decennio, la terapia dei pazienti oncologici è stata rivoluzionata identificando varie alterazioni molecolari che guidano lo sviluppo e la progressione del cancro. Il progresso più significativo nell'oncologia moderna è lo sviluppo di una terapia basata su un'analisi molecolare completa. I progressi tecnologici nel campo della genomica e della proteomica hanno svolto un ruolo cruciale nella profilazione di biomarcatori specifici per la diagnosi precoce, la sorveglianza, la prognosi e il monitoraggio dei farmaci. La proteomica è definita come l'analisi dell'intero complemento proteico di una cellula, di un tessuto o di un organismo in una particolare condizione e include anche lo studio delle interazioni proteiche, delle modificazioni post-traduzionali e della localizzazione³⁴. Un'area specifica della proteomica è l'epiproteomica, che prevede lo studio sistematico delle modificazioni post-traduzionali degli istoni. Questi sono stati collegati allo sviluppo e alla progressione del cancro³⁵. L'articolo delinea un metodo per identificare specifiche isoforme di istoni che contribuiscono al fenotipo cellulare.

La fase critica del metodo è l'estrazione degli istoni a causa della loro scarsa solubilità e dell'elevata basicità. I suoi principali limiti sono la complessità della mappa 2D e il basso numero di varianti, che potrebbero rendere difficile l'analisi MS/MS.

Nel complesso, il principale vantaggio di questo approccio è che può essere eseguito in qualsiasi laboratorio e un mini apparecchio in gel può essere posseduto con le dovute precauzioni. In questo contesto, siamo fiduciosi che questo metodo possa aiutare un gran numero di scienziati, come quelli che non possono beneficiare di una grande struttura nella loro istituzione, a identificare nuovi epi-marcatori, con l'obiettivo di migliorare le conoscenze sull'epi-proteoma. Inoltre, questo metodo può essere combinato con la spettrometria di massa, che può essere esternalizzata come servizio, per scoprire nuove proteoforme. Può anche essere utilizzato con saggi immunologici per confermare i cambiamenti in una specifica modifica post-traduzionale per la quale è disponibile un anticorpo commerciale.

Il metodo è stato utilizzato per studiare i cambiamenti tipici nelle modificazioni istoniche correlate allo sviluppo del cancro al seno²⁸e per esaminare le modifiche di H1 nelle cellule staminali embrionali di topo³⁶. Inoltre, il metodo è stato impiegato con successo per misurare il livello di carbonilazione degli istoni³⁷ nei fibroblasti in rapida crescita e per esplorare nuove modificazioni degli istoni, come la glicazione degli istoni e la^{MARilazione degli istoni 38}.

Dal nostro punto di vista, siamo fiduciosi che questo metodo possa essere applicato con successo per la profilazione di nuovi PTM istonici, in particolare quelli associati all'attivazione anomala di specifiche vie metaboliche, come acetilazione, malonilazione, metilazione, lipidazione, lattilazione, butilazione e altre. In definitiva, il metodo potrebbe anche fungere da strumento micro-preparativo per isolare le singole proteoforme e potrebbe facilitare l'analisi dei PTM legati al metabolismo, migliorando così la nostra comprensione di questo settore cruciale della ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,4-ditioeritritolo	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagente per il mantenimento − Gruppi SH allo stato ridotto; riduce quantitativamente i disolfuri.
1,5 M tampone Tris-HCL, pH 8,8	BIO-RAD	161-0798	tampone in gel risolutivo
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Utilizzare questo tampone di corsa premiscelato 10x Tris/glicina/SDS per separare i campioni di proteine mediante SDS-PAGE.
2-propanolo	SIGMA-ALDRICH	33539	2-propanolo (isopropanolo) è un alcol secondario. È stato testato come sostituto del carburante per l'uso in varie celle a combustibile. La polvere di CuO disciolta in 2-propanolo è stata utilizzata per la sintesi assistita da ablazione laser di colloidi di Cu. La sospensione di 2-propanolo con Zn(NO3)2 è stata impiegata per la fabbricazione di fotoanodi in acciaio inossidabile rivestito di biossido di titanio (P25-TiO2/SS) rivestito con uno strato uniformemente spesso di P25-TiO2.Questo fotoanodo è stato utilizzato per il processo di degradazione fotocatalitica elettrochimica (ECPC).
Soluzione di acrilammide/bis al 30%	BIO-RAD	1610158	2,6% di reticolante. Reagente di purezza per elettroforesi
Acido Acetico Glaciale	Carlo Erba Reagennts	401392	L'acido acetico è un importante reagente chimico con molte applicazioni industriali.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone  è un solvente, rinomato per la sua versatilità in varie applicazioni di laboratorio, produzione e pulizia.
Acetonitile	VWR	83640320	per HPLC   Grado LC-MS
Agarosio	Invitrogen	15510-027	Agarosio è un  eteropolisaccaride  Frequentemente usato in biologia molecolare.
Bicarbonato di ammonio	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimo 99,0%
Persolfato di ammonio	SIGMA-ALDRICH	A3678	Per biologia molecolare, per elettroforesi, ≥ 98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicatore
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Agente riducente utilizzato per ridurre i legami disolfuro nelle proteine.
Kit per macchie d'argento Dodeca	BIO-RAD	161-0480	Il kit per la colorazione all'argento Dodeca è facile da usare per il rilevamento dei livelli di nonagram delle proteine nei gel di poliacrilammide.
Glicerolo	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Il glicerolo è un semplice composto triolo, è coinvolto per aiutare nella colata di gel a gradiente, stabilizzatore proteico e componente tampone di conservazione.
Fermare l'inibitore della fosfatasi	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Cocktail di inibitori della fosfatasi di arresto preserva lo stato di fosforilazione delle proteine durante e dopo la lisi cellulare o l'estrazione delle proteine tissutali. Cocktail monouso (100X).
Fermare l'inibitore della proteasi	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) sono soluzioni madre concentrate pronte all'uso di inibitori della proteasi da aggiungere ai campioni per prevenire la degradazione proteolitica durante la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine. Cocktail monouso (100X).
Acido cloridrico	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, per biologia molecolare
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥ 99% (NMR),
cristallino KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Cloruro di potassio, KCl, è  generalmente utilizzato nelle routine di laboratorio. Il suo utilizzo come tampone di conservazione per gli elettrodi di pH e come soluzione di riferimento per le misure di conducibilità è ben consolidato.
Linea cellulare MCF10	atcc	CRL-10317	linea cellulare epiteliale isolata nel 1984 dalla ghiandola mammaria di una donna bianca di 36 anni con mammelle fibrocistiche. Questa linea cellulare è stata depositata dalla Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Il cloruro di magnesio è un solido cristallino incolore.
N,N,N',N'-Tetrametiletilene-diammina	SIGMA-ALDRICH	T9281	Per elettroforesi, circa il 99%
Tampone salino fosfato 1X	Corning	15373631	1 X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) è  un buffered  soluzione salina bilanciata  Utilizzato per una varietà di applicazioni biologiche e di coltura cellulare, come il lavaggio delle cellule prima della dissociazione, il trasporto di cellule o tessuti, la diluizione delle cellule per il conteggio e la preparazione dei reagenti.
Esacianoferrato di potassio	SIGMA-ALDRICH	60299	Accettore di elettroni, impiegato in sistemi che coinvolgono il trasporto di elettroni,
soluzione SDS 20% (p/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodio dodecil solfato. Reagente di purezza per elettroforesi
Tiosolfato di sodio, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Tiosolfato di sodio, ReagentPlus 99%
Acido solforico	SIGMA-ALDRICH	339741	Acido solforico, Reagente, è  Un acido estremamente corrosivo che si presenta come un liquido giallo, leggermente viscoso. È solubile in acqua ed è un acido diprotico. Ha proprietà corrosive, disidratanti e ossidanti molto forti oltre ad essere igroscopico.
Acido tricloroacetico	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	L'acido tricloroacetico (TCA) è  utilizzato come reagente per la precipitazione di proteine1,2 e acidi nucleici3.
Acido trifluoroacetico	Riedel-de Haë n	34957	Acido trifluoroacetico
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 è un tensioattivo poliossietilene non ionico che viene utilizzato più frequentemente per estrarre e solubilizzare le proteine.
Tripsina dal pancreas suino	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimetilata
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	L'urea è un agente caotropico e viene utilizzata per la denaturazione delle proteine. Disturba i legami idrogeno nella struttura secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine. Può anche disturbare il legame idrogeno presente nella struttura secondaria del DNA