Un approccio di screening ad alto rendimento per la valutazione dell'affinità di legame degli inquinanti ambientali ai recettori nucleari

Summary

Questo protocollo descrive un sistema di screening ad alto rendimento che utilizza la polarizzazione a fluorescenza di una specifica sonda fluorescente che si lega a un recettore nucleare come lettura per lo screening degli inquinanti ambientali.

Abstract

Nell'ambiente sono stati rilevati livelli crescenti di composti, che causano un inquinamento diffuso e mettono a rischio la salute umana. Tuttavia, nonostante la loro elevata presenza ambientale, le informazioni sui loro effetti tossicologici sono molto limitate. È urgente sviluppare metodi di screening ad alto rendimento (HTS) per guidare gli studi tossicologici. In questo studio, è stato sviluppato un saggio di legame recettore-ligando utilizzando un sistema HTS per determinare la potenza di legame degli inquinanti ambientali sui recettori nucleari. Il test viene condotto utilizzando un lettore di micropiastre (cioè una piastra a 96 pozzetti contenente varie sostanze chimiche) misurando la polarizzazione della fluorescenza (FP) di una specifica sonda fluorescente. Questo saggio si compone di quattro parti: la costruzione e la trasformazione di vettori ricombinanti, l'espressione e la purificazione della proteina recettore (dominio di legame del ligando), il legame recettore-sonda e il legame competitivo di sostanze chimiche con il recettore. Per illustrare la procedura di analisi è stata determinata la potenza di legame di due inquinanti ambientali, l'acido perfluoroottanosolfonico (PFOS) e il trifenil fosfato (TPHP), con il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ). Infine, sono stati discussi anche i vantaggi e gli svantaggi di questo metodo e le sue potenziali applicazioni.

Introduction

Un gran numero di sostanze chimiche è stato ampiamente rilevato nell'ambiente e nel corpo umano, sollevando notevoli preoccupazioni circa il loro impatto sull'ambiente ecologico e sulla salute umana ^1,2,3. Nonostante la loro elevata presenza ambientale, le informazioni sui loro effetti tossicologici sono scarse. Pertanto, è urgente sviluppare metodi di screening ad alto rendimento (HTS) per facilitare la valutazione della tossicità chimica.

Sono stati segnalati diversi metodi di screening ad alto rendimento (HTS) per la valutazione della tossicità chimica, come i biosaggi HTS utilizzati nei programmi Tox21 e ToxCast ^4,5. Questi metodi possono identificare rapidamente potenziali sostanze tossiche e fornire informazioni preziose sui meccanismi della tossicità chimica. Tuttavia, questi biosaggi HTS si basano principalmente su sistemi basati su cellule, che possono essere complessi e costosi. Inoltre, per la valutazione della tossicità chimica sono stati utilizzati anche metodi di sequenziamento ad alto rendimento, ma il raggiungimento di una valutazione ad alto rendimento delle sostanze chimiche rimane impegnativo⁶. Studi precedenti hanno sviluppato saggi di legame competitivo recettore-ligando basati sulla polarizzazione della fluorescenza (FP) per determinare la potenza di legame di diversi inquinanti ambientali, tra cui sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS)^7,8,9, bisfenolo A (BPA)^10,11 e particolato (PM)¹², con recettori nucleari come il recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR)^7, 8,9,10,13, recettore X farnesoide (FXR)^11,12 e recettore tiroideo (TR)^14,15. Questo approccio è efficiente, conveniente e fornisce informazioni meccanicistiche.

In questo studio, il protocollo per il saggio di legame recettore-ligando è descritto sulla base del rilevamento della polarizzazione della fluorescenza (FP) di una piccola sonda fluorescente. Il principio del saggio di legame recettore-ligando basato su FP è illustrato nella Figura 1. Quando una piccola molecola fluorescente viene eccitata dalla luce polarizzata sul piano, la luce emessa diventa altamente depolarizzata a causa della rapida rotazione molecolare. Tuttavia, quando il tracciante si lega a un recettore più grande, la sua rotazione viene rallentata. Un valore FP elevato viene rilevato quando il tracciante è legato al recettore grande, mentre un valore FP basso si osserva quando il tracciante è libero. Il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ) è stato purificato per il legame della sonda al recettore. Il rosiglitazone (Rosi), l'acido perfluoroottanosolfonico (PFOS) e il trifenil fosfato (TPHP) sono stati utilizzati per competere per il legame della sonda con il recettore. Rosi, un agonista specifico di PPARγ, è stato utilizzato come controllo positivo nei saggi di legame competitivo del recettore. Inoltre, PFOS e TPHP sono stati precedentemente identificati come agonisti deboli di PPARγ in studi precedenti 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Inoltre, appartengono a diverse categorie strutturali di composti noti per l'esposizione ambientale e si distinguono per i loro tassi di rilevamento relativamente elevati nelle popolazioni umane. Questi composti sono stati utilizzati per convalidare ulteriormente l'ampia applicabilità del saggio di legame della competizione. La procedura consiste in quattro fasi: costruzione e trasformazione di vettori ricombinanti, espressione e purificazione della proteina recettore (dominio di legame del ligando), legame recettore-sonda e legame competitivo di sostanze chimiche con il recettore.

Protocol

I dettagli dei reagenti e dell'attrezzatura sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Costruzione e trasformazione di vettori ricombinanti

NOTA: PPARγ è un fattore di trascrizione ligando-dipendente con una struttura di recettori nucleari classica, comprendente un dominio di legame al DNA che regola i geni bersaglio e un dominio di legame al ligando attivato dai ligandi. Dopo l'attivazione del ligando, PPARγ forma un eterodimero con un altro recettore nucleare, il recettore X retinoide (RXR), e si lega agli elementi di risposta di PPARγ, regolando così la trascrizione dei geni bersaglio a valle ^9,16.

1. Progettare primer per il PPARγ-LBD (vedi Tabella 1) e amplificare il segmento di DNA PPARγ-LBD (vedi Tabella 2 e Tabella 3).
2. Linearizzare il vettore pET28a marcato con His×6 digerindolo con le endonucleasi di restrizione XhoI e BamHI¹⁸.
3. Clonare il segmento di DNA PPARγ-LBD nel vettore pET28a marcato con His×6 utilizzando il kit di clonazione disponibile in commercio, ottenendo il plasmide ricombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Trasfettare il plasmide di espressione ricombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His in cellule BL21 (DE3) di Escherichia coli per l'espressione proteica¹⁸.
5. Aggiungere 5 μL del vettore ricombinante alle cellule BL21(DE3) competenti, incubare su ghiaccio per 30 minuti, eseguire uno shock termico a 42 °C per 45 s, quindi tornare immediatamente al ghiaccio.
6. Aggiungere 900 μl di LB di terreno, agitare a 37 °C per 1 ora (160-200 giri/min), quindi centrifugare a ~3000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Scartare il surnatante, risospendere il pellet batterico in 100 μl di terreno LB e stenderlo su un terreno solido. Capovolgere le piastre e la coltura a 37 °C per 12-16 ore.
8. Selezionare le singole colonie per il sequenziamento, l'identificazione e la successiva espressione e purificazione delle proteine.

2. Espressione e purificazione della proteina recettore

1. Incubare le cellule BL21 (DE3) trasformate in un terreno da 200 mL LB integrato con 100 μg/mL di ampicillina su un agitatore orbitale (230 giri/min) per 1-2 ore a 37 °C.
2. Indurre le cellule quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,4-0,6 unità di assorbanza aggiungendo 10 μM di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare a 16 °C per 16 ore.
3. Raccogliere la sospensione batterica e centrifugare a 8000 × g, 4 °C, per 10 min.
4. Lisi le cellule in 20 mL di tampone di lisi solubile (50 mM di NaH₂PO₄, 300 mM di NaCl, 10 mM di imidazolo, pH 8,0), aggiungendo 200 μL di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e 200 μL di lisozima. Risospendere il pellet batterico utilizzando una pipetta da 5 mL, quindi procedere con la sonicazione al 30% della potenza per 20 minuti.
5. Aggiungere un tampone di lisi pari a 5 volte il volume della colonna per equilibrare la colonna di nichel. Ripetere questo processo due volte e mettere da parte.
6. Centrifugare la sospensione batterica sonicata a 8000 × g per 15 minuti a 4 °C per ottenere il lisato surnatante batterico (CL).
7. Caricare il CL sulla colonna di nichel (per l'adsorbimento delle proteine) per ottenere il flusso continuo (FT).
8. Lavare la colonna con 5 volte il volume della colonna di tampone di lavaggio (50 mM di NaH₂PO₄, 300 mM di NaCl, 20 mM di imidazolo, pH 8,0) per ottenere l'eluato di lavaggio (W1-W6).
9. Lavare la colonna con 1 mL di tampone di eluizione (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8,0) per eluire la proteina bersaglio e ottenere le frazioni proteiche (E1-E5).
10. Prelevare un'aliquota di 20 μl di ciascuna frazione (CL, FT, W1-W6 ed E1-E5) e analizzare utilizzando SDS-PAGE¹⁸ con colorazione Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD funziona come una proteina da 34,9 kDa su un gel denaturante.

3. Saggio di legame del recettore

NOTA: In questo test, C1-BODIPY-C12 è stato utilizzato come sonda fluorescente sito-specifica per stabilire il sistema di legame recettore-ligando. C1-BODIPY-C12, un ligando specifico per PPARγ, è un analogo fluorescente dell'acido grasso con il gruppo fluorescente BODIPY incorporato nell'acido grasso in posizione C1.

1. Diluire il PPARγ-LBD umano purificato in tampone Tris-HCl (20 mM di Tris, 100 mM di NaCl, pH 8,0) a un intervallo di concentrazione compreso tra 1 nM e 6400 nM. Inoltre, diluire la sonda C1-BODIPY-C12 nel tampone Tris-HCl a una concentrazione di 50 nM.
2. Miscelare la soluzione diluita di PPARγ-LBD (55 μl per pozzetto) e la soluzione della sonda C1-BODIPY-C12 (55 μl per pozzetto) in una piastra nera a 96 pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
3. Misura la polarizzazione della fluorescenza (FP) con il lettore di micropiastre.
4. Tracciare i valori di FP rispetto alla concentrazione del recettore, adattare la curva utilizzando il legame specifico con l'equazione della pendenza di Hill utilizzando software statistici e grafici e calcolare il valore_{K d} .

4. Saggio di legame competitivo

NOTA: In questo test, sono stati utilizzati 800 nM di PPARγ-LBD umano e 50 nM di sonda C1-BODIPY-C12 per il legame del recettore. Il rosiglitazone (Rosi), il trifenil fosfato (TPHP) e l'acido perfluoroottanosulfonico (PFOS) sono stati utilizzati per competere con il legame della sonda al PPARγ.

1. Diluire i tre composti nel tampone Tris-HCl entro un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 200 μM.
2. Preparare la soluzione di legame recettore-sonda con una concentrazione finale di 800 nM di PPARγ-LBD umano e 50 nM di sonda C1-BODIPY-C12.
3. Miscelare la soluzione legante recettore-sonda (55 μl per pozzetto) e la soluzione composta (55 μl per pozzetto) in una piastra nera a 96 pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
4. Misura la polarizzazione della fluorescenza (FP) con il lettore di micropiastre.
5. Tracciare i valori di FP in funzione della concentrazione del ligando. Ottenere la concentrazione inibitoria semimassimale (IC₅₀) di ciascun ligando dalla curva di competizione utilizzando il modello sigmoidale elaborato da un software di grafica e analisi.

Results

Espressione proteica e purificazione di PPARγ-LBD
PPARγ-LBD era espresso in modo eterologo in BL21 (DE3) come proteina marcata con istidina. La proteina è stata rilevata nelle frazioni solubili e il PPARγ-LBD purificato ha mostrato una singola banda su SDS-PAGE con un peso molecolare apparente di circa 34,9 kDa (Figura 2), coerente con il peso molecolare previsto della proteina.

Il legame della sonda C 1-BODIPY-C₁₂ a PPARγ-LBD
Nel saggio di legame del recettore, C1-BODIPY-C12, un acido grasso marcato con BODIPY che può legarsi a PPARγ-LBD, è stato utilizzato come sonda a fluorescenza per studiare la potenza di legame degli inquinanti ambientali con hPPARγ-LBD. Come mostrato nella Figura 3A, i valori di polarizzazione della fluorescenza (FP) sono aumentati da 20 a 250 dopo l'aggiunta di PPARγ-LBD, indicando il legame di C1-BODIPY-C12 al recettore. La curva di legame ha raggiunto la saturazione a 800 nM PPARγ-LBD, con una costante di dissociazione (K_d) di 253,5 nM ± 10,05 nM. Pertanto, è stato scelto PPARγ-LBD da 800 nM per i successivi saggi di legame competitivo.

Il legame competitivo degli inquinanti ambientali al PPARγ-LBD
Il rosiglitazone (Rosi), un agonista specifico di PPARγ, è stato utilizzato come controllo positivo per spostare la sonda fluorescente nei saggi di legame del ligando competitivo. Come mostrato nella Figura 3B, Rosi ha inibito il legame della sonda C1-BODIPY-C12 a PPARγ-LBD in modo dose-dipendente, con un IC₅₀ di 6,89 μM, dimostrando la fattibilità del saggio. Successivamente, sono state determinate le affinità di legame di TPHP e PFOS con PPARγ-LBD. Come mostrato nella Figura 3C, D, TPHP e PFOS hanno anche inibito il legame della sonda C1-BODIPY-C12 a PPARγ-LBD in modo dose-dipendente, con valori di IC₅₀ rispettivamente di 60,45 μM e 37,27 μM.

Figura 1: Illustrazione schematica dei saggi di legame competitivo del recettore basati sulla polarizzazione della fluorescenza (FP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi SDS-PAGE del PPARγ-LBD purificato. M è il marcatore del peso molecolare della proteina. Cl è il lisato cellulare, FT è la frazione a flusso continuo, W1-W6 sono le soluzioni di lavaggio, E1 è l'eluato ed E2-E4 sono le proteine purificate di PPARγ-LBD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Curva di legame del recettore basata sulla polarizzazione della fluorescenza (FP) e curve di legame competitive. (A) Curva di legame basata su FP di C 1-BODIPY-C₁₂ a PPARγ-LBD umano. (B-D) Curve di legame competitivo basate su FP di Rosi, TPHP e PFOS al PPARγ-LBD umano. Le barre di errore indicano la deviazione standard (SD) per tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ID	Seq
pET28a-PPARG-P1 umano	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-PPARG-P2 umano	GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
Sequenza nucleotidica PPARγ-LBD	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTG GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCGGGGGGATCTTGACAGGAAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAAGATGGGGT TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG CTCGAGGCCCCCACCC

Tabella 1: Il primer e la sequenza nucleotidica del dominio di legame del ligando PPARγ.

Nomi dei reagenti sperimentali	Volume/Dose
pET28a-PPARG-P1 umano	1 μl
pET28a-PPARG-P2 umano	1 μl
2×phanta Max Master Mix	12,5 μl
Di cDNA	2 μl
ddH2O	8,5 μl

Tabella 2: Sistema di reagenti sperimentali per PCR.

Nomi degli esperimenti	Temperatura	Ore
Pre-denaturazione	95 °C	3 minuti
Denaturazione	95 °C	15 secondi
Ricottura	65 °C	15 secondi
Estensione	72 °C	6 minuti
Negozio	12 °C	--

Tabella 3: Programma di reazione sperimentale PCR.

Discussion

La polarizzazione a fluorescenza (FP), la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la risonanza magnetica nucleare (NMR) sono tecniche comuni utilizzate per valutare le interazioni di legame diretto tra proteine e composti^19,20. La FP è stata ampiamente impiegata nello studio delle interazioni molecolari per la scoperta di farmaci e lo screening chimico 21,22,23. In confronto, i saggi SPR e NMR sono costosi e richiedono molto tempo, il che li rende meno adatti per le applicazioni di screening ad alto rendimento (HTS). Questo protocollo descrive un metodo di analisi recettore-ligando basato su FP con un sistema di rilevamento su piastra multipozzetto, che consente l'HTS delle sostanze chimiche.

La scelta della sonda appropriata per un saggio di legame del recettore è fondamentale. La sonda dovrebbe essere costituita da due componenti: un ligando specifico per il recettore nucleare e un gruppo fluorescente. In genere, tali sonde possono essere ottenute commercialmente, come esemplificato dalla sonda C1-BODIPY-C12 utilizzata in questo studio. C1-BODIPY-C12 è un analogo fluorescente dell'acido grasso, con il gruppo fluorescente BODIPY incorporato nella posizione C1, ed è un ligando specifico per PPARγ. Se una sonda fluorescente disponibile in commercio non è un'opzione, dovrebbe essere sintetizzata chimicamente collegando un gruppo fluorescente a un ligando specifico noto.

La struttura classica di un recettore nucleare include un dominio di legame al DNA responsabile della regolazione dell'espressione genica bersaglio e un dominio di legame del ligando (LBD), tipicamente situato al C-terminale²⁴ del recettore. Il sito di legame del coregolatore si trova generalmente all'interno del dominio della funzione di attivazione trascrizionale del recettore nucleare, dove interagisce con i fattori coregolatori nucleari²⁵. Questi coregolatori possono migliorare o sopprimere l'attività trascrizionale del recettore, modulando così l'espressione genica. La LBD, situata in una regione specifica della proteina recettore, regola i cambiamenti conformazionali del recettore al momento del legame con il ligando, che a sua volta attiva o inibisce la sua attività trascrizionale. Poiché la LBD è un dominio ben definito cruciale per il riconoscimento e il legame di specifici ligandi di piccole molecole²⁴, solo il recettore-LBD è stato utilizzato nel saggio di legame competitivo del recettore in questo studio. Questo approccio, che ha comportato l'espressione e la purificazione del dominio di legame del ligando di PPARγ, ha ridotto i costi del saggio.

I reagenti utilizzati in questo metodo, tra cui i tamponi per la purificazione delle proteine, la sonda C1-BODIPY-C12 e Tris-HCl, sono disponibili in commercio e poco costosi, il che rappresenta un vantaggio significativo per il saggio. La rivelazione della polarizzazione a fluorescenza (FP) viene eseguita in una piastra multipozzetto (a 96 o 384 pozzetti), con un tempo di lettura rapido di 3-5 minuti per piastra, migliorando la produttività e l'efficienza dei test. L'approccio di legame recettore-ligando è altamente flessibile e può essere facilmente adattato a vari recettori, a condizione che le proteine recettoriali siano disponibili. Questa adattabilità amplia l'ambito della ricerca che può essere condotta utilizzando questo metodo. Nel complesso, la combinazione di questi vantaggi - facilità d'uso, efficienza dei costi, elevata capacità di produzione, elaborazione rapida e flessibilità nell'adattamento dei recettori - rende questo metodo un'opzione promettente per lo screening degli inquinanti ambientali tossici.

I risultati attuali dimostrano che PFOS e TPHP possono legarsi a PPARγ, il che è coerente con i risultati precedenti dei saggi di docking molecolare e del gene reporter ^9,26. Inoltre, il metodo descritto in questo manoscritto è stato utilizzato per valutare la potenza di legame di diversi inquinanti ambientali con i recettori nucleari. Ad esempio, utilizzando il saggio di legame competitivo recettore-ligando basato su FP, la potenza di legame di 19 sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS) e 7 composti di bisfenolo A (BPA) al recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi β/δ (PPARβ/δ)^7,10, 12 PFAS a PPARγ ^9,13, 7 composti BPA e 3 componenti di particolato (PM_2,5) al recettore X farnesoide (FXR)^11, Sono stati determinati ¹² e 8 eteri di difenile polibromurato (PBDE) e 6 policlorobifenili (PCB) al recettore tiroideo (TR)^14,15. Questi risultati evidenziano il potenziale di questo metodo per lo screening delle interazioni di legame tra inquinanti ambientali e recettori nucleari.

Studi precedenti hanno riportato metodi di saggio di polarizzazione della fluorescenza (FP) per PPARγ che prevedono l'uso della filtrazione su gel per misurare il legame, che richiede almeno 1,5 ore per rilevare il legame di un singolo composto²³. Al contrario, questo metodo consente di rilevare le affinità di legame per almeno 12 composti con PPARγ entro 10 minuti. Inoltre, alcuni kit di saggi disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali) hanno un prezzo di oltre $ 3000 per un formato da 800 × 20 μl. Questi metodi sono notevolmente costosi e richiedono molto tempo. Questo studio presenta miglioramenti rispetto a questi metodi esistenti.

Una potenziale limitazione di questo metodo è che la sonda a fluorescenza deve essere un ligando per il recettore e le sonde a fluorescenza non interagiscono direttamente con gli inquinanti ambientali. Pertanto, è fondamentale garantire che la sonda e gli inquinanti ambientali siano mantenuti separati nella soluzione. Inoltre, questo test riflette una situazione in vitro e non è in grado di catturare completamente le interazioni in vivo , poiché i recettori sono eterodimeri in vivo²⁷. Di conseguenza, sebbene questo metodo funga da strumento di screening rapido, sono necessarie ulteriori indagini sull'attivazione dei recettori e sui relativi meccanismi tossicologici in vivo .

Un altro svantaggio è il fenomeno dello "spostamento verso destra" osservato nei saggi di polarizzazione della fluorescenza (FP) quando si valuta l'affinità di legame, che può portare a una sottostima sistematica delle affinità misurate. In studi precedenti, l'affinità di legame di rosiglitazone con PPARγ è stata valutata utilizzando il saggio di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza risolto nel tempo (TR-FRET)²⁸, che è un metodo altamente sensibile per misurare l'affinità di legame ligando-recettore. Tuttavia, il test TR-FRET è relativamente dispendioso in termini di tempo e ingombrante, richiedendo un'incubazione di 4 ore della soluzione di reazione a temperatura ambiente prima del rilevamento. Sebbene il saggio FP mostri una sensibilità inferiore rispetto al test TR-FRET, è più adatto per lo screening ad alto rendimento di ligandi ambientali che si legano ai recettori nucleari. Tuttavia, il saggio FP potrebbe non rilevare alcuni leganti ambientali deboli. Inoltre, in studi precedenti, l'affinità di legame del PFOS con PPARγ è stata determinata utilizzando la dialisi all'equilibrio (EqD)²⁹, un altro metodo altamente sensibile per misurare l'affinità di legame ligando-recettore. Tuttavia, l'EqD si basa su costose apparecchiature analitiche (LC-MS/MS), che ne limitano l'applicazione e precludono le capacità di screening ad alto rendimento.

Sebbene questo test di polarizzazione della fluorescenza (FP) mostri un fenomeno di "spostamento a destra", che può comportare valori di IC₅₀ calcolati generalmente più elevati, non influisce sulla classificazione dell'affinità relativa o sulle successive previsioni di valutazione del rischio. Inoltre, il test FP è economico, efficiente in termini di tempo e in grado di esaminare un'ampia gamma di composti per la loro affinità verso più recettori nucleari. Nel complesso, lo screening ad alto rendimento dei ligandi ambientali basato sulla FP facilita la rapida identificazione degli inquinanti ambientali tossici.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Sonda	Thermo Fisher Scientific, Cina	102209-82-3	Si lega a PPARγ-LBD ed emette fluorescenza.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, Cina	6104-59-2	Colora le bande proteiche.
Prisma GraphPad	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazolo	Solarbio, Cina	I8090	Preparare i tamponi per il processo di purificazione delle proteine.
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside	Solarbio, Cina	367-93-1	Induce l'espressione di PPARγ-LBD
Lettore di micropiastre	Biotek , USA	Synergy H1	Rilevamento del valore FP
NaCl	Shanghai Reagente	7647-15-5	Preparare i tamponi per il processo di purificazione delle proteine.
NaH2PO4 · 2H2O	Reagente Shanghai	13472-35-0	Preparare i tamponi per il processo di purificazione delle proteine.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, Cina	SA005005	Purificazione delle proteine.
Origine 8.5	OriginLab, Northampton, MA, Stati Uniti
Acido perfluoroottanosolfonato (PFOS)	J& K Scientific Ltd, Cina	1763-23-1	Gli inquinanti ambientali rilevati
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)	Solarbio, Cina	P0100	Inibiscono la degradazione delle proteine.
Kit di analisi della concorrenza di PPARγ-	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
Kit di analisi di screening del ligando PPARγ-LBD	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, Cina	122320-73-4	Gli agonisti di PPARγ
Agitatore	ZHICHENG, Cina	ZWY-211C	Espansione della coltura batterica e induzione dell'espressione proteica
Trifenil fosfato (TPHP)	Macklin, Cina	T819317	Gli inquinanti ambientali rilevati
Tris	Solarbio, Cina	T8230	Preparare tamponi per il processo di purificazione delle proteine.
Tryptone	OXOID Limited, Cina	LP0042B	Preparare brodo di lisogenesi (LB) medio.
Pulitore ad ultrasuoni	Kimberly, Cina	LHO-1	Interrompere i batteri per ottenere una lisi completa
Urea	Solarbio, Cina	U8020	Preparare i tamponi per il processo di purificazione delle proteine.
Estratto di lievito	OXOID Limited, Cina	LP0021B	Preparare il brodo di lisogenesi (LB) medio.