Articolo metodologico

Una piattaforma di supporto alle decisioni mediche per l'identificazione della trombospondina 1 nella steatosi epatica non alcolica tramite analisi di immunoinfiltrazione

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DOI:

10.3791/67328

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30 agosto 2024

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha studiato le relazioni tra steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e infarto del miocardio (MI) attraverso geni co-espressi, identificando la trombospondina 1 (THBS1) come biomarcatore. L'analisi di immunoinfiltrazione ha rivelato che le cellule T CD8+ e i neutrofili sono fattori chiave, con THBS1 che mostra un potenziale come strumento diagnostico per NAFLD e MI.

Abstract

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e l'infarto del miocardio (MI) sono due importanti oneri sanitari con prevalenza e mortalità significative. Questo studio mirava a esplorare i geni co-espressi per comprendere la relazione tra NAFLD e MI e identificare potenziali biomarcatori cruciali di MI correlato a NAFLD utilizzando la bioinformatica e l'apprendimento automatico. È stata condotta l'analisi dell'arricchimento funzionale, è stato costruito un diagramma di rete di interazione co-proteina (PPI) e sono state impiegate tecniche di eliminazione delle caratteristiche ricorsive della macchina del vettore di supporto (SVM-RFE) e dell'operatore di restringimento e selezione minimo assoluto (LASSO) per identificare un gene differenzialmente espresso (DEG), la trombospondina 1 (THBS1). THBS1 ha dimostrato una forte performance nel distinguere i pazienti con NAFLD (AUC = 0,981) e i pazienti con infarto miocardico (AUC = 0,900). L'analisi dell'immunoinfiltrazione ha rivelato linfociti T CD8+ significativamente più bassi e livelli di neutrofili più elevati nei pazienti con NAFLD e MI. Le cellule T CD8+ e i neutrofili sono risultati efficaci nel distinguere la NAFLD/MI dai controlli sani. L'analisi di correlazione ha mostrato che THBS1 era correlato positivamente con CCR (recettore delle chemochine), classe MHC (classe del complesso maggiore di istocompatibilità), neutrofili, parainfiammazione e Tfh (cellule T helper follicolari) e correlato negativamente con le cellule T CD8+, l'attività citolitica e il TIL (linfociti infiltranti il tumore) nei pazienti con NAFLD e MI. THBS1 è emerso come un nuovo biomarcatore per la diagnosi di NAFLD/MI rispetto ai controlli sani. I risultati indicano che le cellule T CD8+ e i neutrofili potrebbero fungere da caratteristiche immunitarie infiammatorie per differenziare i pazienti con NAFLD/MI da individui sani.

Introduzione

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è un grave problema di salute pubblica, con una prevalenza del 25%-30%1. È stato riportato che la prevalenza di NAFLD è elevata tra i pazienti con diabete2. Tuttavia, il significato della NAFLD nei pazienti non diabetici non è ancora chiaro. Gli studi hanno suggerito che la NAFLD svolge un ruolo indipendente nella patogenesi dell'aterosclerosi 3,4. Inoltre, una meta-analisi ha dimostrato che la NAFLD è strettamente associata alla calcificazione dell'arteria coronarica, alla disfunzione endoteliale e all'aterosclerosi ed è emersa come fattore di rischio cardiovascolare indipendente5. La connessione tra NAFLD e malattie cardiovascolari richiede ancora ulteriori indagini.

L'infarto del miocardio (IM) è una malattia catastrofica che minaccia la salute e impone un onere economico significativo ai pazienti e alle loro famiglie in tutto il mondo6. L'infarto miocardico è anche una delle principali cause di morte nei pazienti con NAFLD. Uno studio clinico pubblicato sul British Medical Journal ha dimostrato che il rischio di infarto del miocardio nei pazienti con NAFLD è 1,17 volte maggiore rispetto ai pazienti non con NAFLD 7,8. Alcuni studi hanno identificato percorsi molecolari, tra cui l'infiammazione, lo stress ossidativo e il metabolismo lipidico, che contribuiscono all'MI 9,10,11 correlato alla NAFLD. Tuttavia, i meccanismi sottostanti che collegano NAFLD e MI rimangono poco chiari. È fondamentale identificare nuovi biomarcatori correlati alla prognosi di NAFLD e MI.

La crescente prevalenza della NAFLD, che colpisce un ampio segmento della popolazione, sottolinea un problema significativo di salute pubblica, in particolare data la sua associazione con il diabete. Tuttavia, l'impatto della NAFLD sui pazienti non diabetici rimane poco compreso. La NAFLD è stata implicata nella patogenesi dell'aterosclerosi ed è riconosciuta come un fattore di rischio cardiovascolare indipendente, essendo strettamente legata alla calcificazione dell'arteria coronarica, alla disfunzione endoteliale e all'aterosclerosi. Nonostante queste associazioni, i meccanismi precisi che collegano la NAFLD e le malattie cardiovascolari come l'infarto del miocardio (IM) richiedono ulteriori chiarimenti. L'infarto miocardico è una delle principali cause di mortalità in tutto il mondo e impone un onere economico significativo. Il rischio di infarto miocardico nei pazienti con NAFLD è notevolmente più elevato rispetto a quelli senza NAFLD, evidenziando la necessità di una comprensione più profonda dei percorsi molecolari che collegano queste condizioni. Mentre l'infiammazione, lo stress ossidativo e il metabolismo dei lipidi sono stati suggeriti come fattori che contribuiscono, i meccanismi esatti rimangono poco chiari. C'è un urgente bisogno di identificare nuovi biomarcatori in grado di fornire informazioni sulla prognosi e sulla gestione dell'infarto miocardico correlato alla NAFLD.

Di conseguenza, in questo studio, i set di dati di microarray di RNA per NAFLD e MI sono stati scaricati dal National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO, vedi Table of Materials) per identificare e analizzare l'interazione dei geni differenzialmente espressi (DEG) tra NAFLD e MI. Analisi dell'arricchimento, costruzione di diagrammi di rete di interazione proteina-proteina (PPI), eliminazione delle caratteristiche ricorsive della macchina del vettore di supporto (SVM-RFE), e gli algoritmi LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) sono stati utilizzati per identificare i geni hub 12,13,14,15,16,17,18,19. L'analisi di immunoinfiltrazione è stata eseguita per esaminare le cellule immunitarie nei pazienti con NAFLD e MI. Infine, questi metodi sono stati integrati per chiarire la relazione tra NAFLD e MI. La Figura 1 illustra la sequenza di progettazione seguita in questo studio. Combinando la bioinformatica, l'apprendimento automatico e l'analisi dell'immunoinfiltrazione, questo studio mira a contribuire allo sviluppo di una nuova piattaforma di supporto alle decisioni mediche.

I contributi chiave di questo articolo sono: (1) Identificazione di geni co-espressi: lo studio evidenzia la relazione tra NAFLD e MI identificando geni co-espressi, offrendo una comprensione più profonda dei legami molecolari tra queste due condizioni. (2) Applicazione della bioinformatica e dell'apprendimento automatico: utilizzando tecniche di bioinformatica e apprendimento automatico, tra cui l'eliminazione ricorsiva della macchina del vettore di supporto (SVM-RFE)17 e l'operatore di restringimento e selezione meno assoluto (LASSO)19, lo studio identifica THBS1 come un gene espresso in modo differenziale. THBS1 dimostra elevate prestazioni nel distinguere i pazienti con NAFLD e MI dai controlli sani. (3) Analisi di immunoinfiltrazione: lo studio conduce un'analisi di immunoinfiltrazione, rivelando livelli significativamente più bassi di cellule T CD8+ e livelli più elevati di neutrofili nei pazienti con NAFLD e MI. (4) Analisi di correlazione: la ricerca dimostra che THBS1 è correlato positivamente con diversi fattori immunitari, tra cui CCR (recettore delle chemochine), MHC di classe I (complesso maggiore di istocompatibilità di classe I), neutrofili, parainfiammazione e cellule Tfh (T helper follicolare). È correlato negativamente con le cellule T CD8+, l'attività citolitica e i linfociti infiltranti il tumore (TIL).

Protocollo

I dettagli dei database, dei collegamenti web e dei software/pacchetti utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali. I parametri di simulazione utilizzati sono riportati nella Tabella 1.

1. Ottenere set di dati di microarray di RNA

  1. Scarica il set di dati sull'infarto del miocardio (MI), GSE66360, dal database NCBI-GEO .
  2. Scarica il set di dati sulla steatosi epatica non alcolica (NAFLD), GSE89632, dal database NCBI-GEO .
  3. Assicurarsi che i set di dati scaricati includano 49 campioni di MI, 50 controlli integri per GSE66360, 39 campioni di NAFLD e 24 controlli integri per GSE89632.

2. Identificazione dei DEG

  1. Pre-elaborazione dei dati e identificazione DEG
    1. Caricare i set di dati in RStudio usando le funzioni R appropriate.
    2. Utilizzare il pacchetto R limma per identificare i DEG12 con le seguenti soglie: P < 0.05P e | log FC | > 1.5.
    3. Utilizza i pacchetti R pheatmap, ggplot2 e Venn per generare mappe termiche e diagrammi di Venn per la visualizzazione dei DEG.
  2. Creare visualizzazioni
    1. Usa pheatmap per generare mappe termiche di DEG.
    2. Utilizzare ggplot2 per creare diagrammi di Venn che mostrino la sovrapposizione dei DEG tra NAFLD e MI.

3. Analisi dell'arricchimento

  1. Esecuzione dell'analisi di arricchimento GO, KEGG e DO
    1. Caricare i DEG nel pacchetto R clusterProfiler13.
    2. Conduci analisi di arricchimento di ontologia genica (GO) per classificare i DEG in funzioni molecolari, processi biologici e componenti cellulari.
    3. Eseguire l'analisi del percorso dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG) per mappare i DEG sui percorsi biochimici.
    4. Utilizza l'analisi dell'arricchimento dell'ontologia delle malattie (DO) per collegare i DEG a stati clinici specifici.

4. Analisi PPI mediante la costruzione di reti PPI

  1. Utilizza la piattaforma online STRING 14 per costruire diagrammi di rete di interazione proteina-proteina (PPI) di co-DEG con un punteggio di confidenza di 0,4.
  2. Visualizza le reti PPI utilizzando Cytoscape15.

5. Screening dei DEG dell'hub candidato applicando algoritmi di apprendimento automatico

  1. Utilizza gli algoritmi di regressione SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) e LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) in RStudio per selezionare i DEG più rilevanti 16,17,18.
  2. Assicurarsi che SVM-RFE classifichi e rimuova le feature in modo iterativo, mentre la regressione LASSO19 applica la regolarizzazione per identificare un set sparso di DEG.

6. Costruzione della curva ROC per la valutazione delle prestazioni diagnostiche

  1. Utilizzare RStudio per eseguire l'analisi della curva ROC (Receiver Operating Characteristic)20.
  2. Calcolare l'area sotto la curva (AUC) per i co-DEG cruciali.

7. Analisi di immunoinfiltrazione per esplorare l'infiltrazione immunitaria

  1. Eseguire l'analisi dell'arricchimento del set genico a campione singolo (ssGSEA) utilizzando i pacchetti R GSVA e GSEABase per analizzare l'infiltrazione immunitaria in NAFLD e MI21.
  2. Confrontare l'abbondanza relativa di tipi di cellule immunitarie tra i campioni di NAFLD e MI e i controlli sani.

8. Analisi statistica

  1. Esegui tutte le analisi statistiche in RStudio.
  2. Applicare l'analisi di correlazione di Pearson per esaminare i modelli di co-espressione genica.
  3. Garantisci la significatività statistica con P < 0,05.
    NOTA: assicurarsi che tutti i pacchetti software e R siano installati correttamente e aggiornati alle versioni più recenti prima di avviare il protocollo.

Risultati

I risultati chiave dello studio proposto sono presentati qui, comprendendo varie analisi condotte per chiarire i meccanismi molecolari alla base di NAFLD e MI.

Identificazione dei DEG
Nel set di dati GSE89632, 76 geni up-regolati e 20 down-regolati sono stati identificati come NAFLD-DEG (Figura 2B, D), mentre il set di dati GSE66360 ha rivelato 118 geni up-regolati e 8 down-regolati come MI-DEG (Figura 2C, E). Successivamente, i co-DEG sono stati derivati dalla sovrapposizione tra NAFLD-DEG e MI-DEG, identificando 13 DEG up-regolati e 1 DEG down-regolato tra i co-DEG (Figura 2A).

L'identificazione dei DEG unici per NAFLD e MI, così come quelli comuni a entrambi i disturbi, fornisce preziose informazioni sui processi molecolari alla base di queste malattie. La comprensione dei modelli di espressione genica distinti e condivisi legati a entrambe le condizioni aiuta a chiarire la fisiopatologia di NAFLD e MI e può identificare potenziali bersagli molecolari per l'intervento terapeutico. Ulteriori indagini sui co-DEG potrebbero rivelare regolatori critici o percorsi essenziali per l'interazione tra questi due disturbi, facilitando lo sviluppo di terapie mirate volte a mitigare gli esiti negativi per la salute associati a NAFLD e MI.

Analisi dell'arricchimento
L'analisi OB ha rivelato che i DEG di NAFLD erano principalmente arricchiti nei seguenti processi biologici (BP): differenziazione delle cellule adipose, risposta al lipopolisaccaride e processi degli organismi multicellulari (p < 0,05, Figura 3A). Per le componenti cellulari (CC), i DEG della NAFLD erano principalmente associati al complesso fosfatidilinositolo 3-chinasi, al lume dei granuli secretori e al lume delle vescicole citoplasmatiche (p < 0,05, Figura 3A). In termini di funzione molecolare (MF), le attività chiave includevano l'attività regolatrice della fosfatidilinositolo-3-chinasi, l'attività dell'attivatore della trascrizione che lega il DNA (RNA polimerasi specifica) e l'attività generale dell'attivatore della trascrizione che lega il DNA (p < 0,05, Figura 3A).

Per i MI-DEG, l'analisi della pressione arteriosa ha mostrato un arricchimento nella chemiotassi leucocitaria, nell'attivazione dei leucociti mieloidi e nella chemiotassi cellulare (p < 0,05, Figura 3B). L'analisi CC ha evidenziato l'arricchimento nei granuli terziari, nei granuli ricchi di ficolina 1 e nel lume dei granuli secretori (p < 0,05, Figura 3B). L'analisi MF ha rivelato un arricchimento dell'attività del recettore di riconoscimento del pattern, del legame con il recettore RAGE e dell'attività del recettore immunitario (p < 0,05, Figura 3B).

L'analisi dell'arricchimento KEGG ha indicato che i NAFLD-DEG erano significativamente arricchiti nelle seguenti vie: IL-17, AGE-RAGE, TNF, differenziazione degli osteoclasti, malaria, artrite reumatoide, malattia di Chagas e vie di segnalazione JAK-STAT (p < 0,05, Figura 3C). I MI-DEG sono stati arricchiti in IL-17, TNF, metabolismo lipidico e aterosclerosi, segnalazione del recettore toll-like, segnalazione del recettore della lectina di tipo C, legionellosi, artrite reumatoide e vie di segnalazione NF-κB (p < 0,05, Figura 3D). L'analisi dell'arricchimento dell'ontologia della malattia (DO) ha dimostrato che i primi tre DEG sia per la NAFLD che per l'infarto miocardico erano significativamente associati all'aterosclerosi, alla malattia cardiovascolare arteriosclerotica e all'arteriosclerosi (p < 0,05, Figura 3E-F).

Analisi dei diagrammi di rete PPI
Nel diagramma di rete PPI per la NAFLD, sono stati identificati 92 nodi e 250 bordi, che riflettono una complessa rete di interazioni tra le proteine associate a questa condizione. Allo stesso modo, il diagramma di rete PPI per l'infarto miocardico ha rivelato 117 nodi e 587 bordi, indicando una rete più intricata caratteristica del panorama molecolare dell'infarto del miocardio. Inoltre, i diagrammi di rete PPI per i co-DEG hanno identificato 14 nodi e 21 bordi, evidenziando potenziali interazioni chiave tra proteine condivise tra NAFLD e MI (Figura 4A-F).

Le reti PPI sono preziose per la costruzione e l'analisi di bersagli terapeutici e forniscono importanti informazioni sulle connessioni molecolari alla base di NAFLD e MI. Le topologie di rete uniche osservate nella NAFLD e nell'MI sottolineano i distinti meccanismi fisiopatologici coinvolti in queste malattie. Inoltre, la scoperta di connessioni condivise tra co-DEG suggerisce potenziali percorsi condivisi o reti regolatorie che mediano l'interazione tra MI e NAFLD. Ulteriori ricerche su queste connessioni potrebbero rivelare nuovi bersagli molecolari per l'intervento e lo sviluppo di terapie, offrendo potenzialmente nuove opzioni di trattamento per queste malattie complesse.

Screening dei DEG dell'hub candidato
L'algoritmo SVM-RFE17 è stato impiegato per lo screening di potenziali DEG cruciali, con conseguente identificazione di 6 geni in GSE89632 e 4 geni in GSE66360 (Figura 5A, B). Allo stesso modo, l'algoritmo LASSO19 è stato utilizzato per identificare i DEG cruciali candidati, producendo 4 geni in GSE89632 e 5 geni in GSE66360 (Figura 5C, D). In particolare, un diagramma di Venn ha rappresentato l'intersezione del DEG hub (THBS1) identificato dalle analisi di rete SVM-RFE, LASSO e co-PPI, sottolineando la sua importanza sia nella patogenesi della NAFLD che in quella dell'MI (Figura 5F).

Questi algoritmi avanzati di apprendimento automatico hanno fornito un solido framework per identificare i DEG chiave associati a MI e NAFLD e hanno offerto preziose informazioni sul loro potenziale come bersagli terapeutici o diagnostici. L'identificazione di THBS1 come gene hub attraverso molteplici tecniche analitiche evidenzia la sua importanza nelle vie molecolari alla base di entrambe le malattie. Ulteriori ricerche sul significato funzionale di THBS1 e sulle sue interazioni all'interno della rete co-PPI potrebbero chiarire nuovi meccanismi che collegano NAFLD e MI, aprendo potenzialmente la strada a terapie mirate e strategie di medicina di precisione.

Valore diagnostico di un DEG hub
L'analisi ROC è stata condotta per valutare l'efficienza diagnostica dei DEG hub identificati in entrambi i set di dati NAFLD e MI. Come illustrato nella Figura 6A, B, THBS1 ha dimostrato un elevato potere discriminatorio, con un'AUC di 0,981 (IC 95%: 0,949-1,000) nei pazienti con NAFLD e 0,900 (IC 95%: 0,834-0,956) nei pazienti con infarto miocardico. Le forti prestazioni di THBS1 come biomarcatore diagnostico evidenziano la sua potenziale utilità nella differenziazione tra NAFLD, MI e controlli sani.

Questi risultati suggeriscono che THBS1 potrebbe fungere da prezioso marcatore per lo stato della malattia, offrendo ai medici uno strumento utile per la valutazione del rischio e l'identificazione precoce. Per facilitare l'integrazione di THBS1 nella pratica clinica e migliorare la cura e la gestione dei pazienti, sono necessari ulteriori studi di convalida per confermarne l'accuratezza diagnostica in diverse popolazioni di pazienti e contesti clinici.

Analisi delle infiltrazioni immunitarie
ssGSEA è stato condotto per analizzare 29 geni immuno-correlati tra NAFLD/MI e il gruppo di controllo (CON). Rispetto al gruppo CON, l'infiltrazione delle cellule immunitarie era significativamente aumentata nei gruppi NAFLD e MI, in particolare per CCR, MHC classe I, neutrofili, parainfiammazione e cellule Tfh (p < 0,05, Figura 7A, B). Al contrario, l'infiltrazione delle cellule immunitarie è diminuita notevolmente nei gruppi NAFLD e MI rispetto al gruppo CON, in particolare per le cellule T CD8+, l'attività citolitica e i linfociti infiltranti il tumore (TIL) (p < 0,05, Figura 7C, D).

Questi risultati suggeriscono una disregolazione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie sia nella NAFLD che nell'MI, evidenziando il complesso panorama immunologico associato a queste condizioni. I cambiamenti osservati nella composizione delle cellule immunitarie forniscono preziose informazioni sui processi immunologici alla base dello sviluppo e della fisiopatologia di queste malattie. Un'ulteriore comprensione di queste caratteristiche immunitarie potrebbe rivelare nuovi bersagli terapeutici per l'intervento e supportare lo sviluppo di piani di trattamento individualizzati basati sui profili immunologici dei pazienti con NAFLD e IM.

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Figura 1: La sequenza di progettazione del sistema di supporto alle decisioni mediche per l'identificazione della THBS1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Diagrammi di Venn, diagrammi dei vulcani e mappe di calore. (A) Diagramma di Venn per GSE89632 e GSE66360. (B) Un diagramma vulcanico di geni differenzialmente espressi (DEG) in GSE89632. (C) Un diagramma vulcanico dei DEG in GSE66360. (D) Un diagramma della mappa termica dei DEG in GSE89632. (E) Un diagramma della mappa di calore dei DEG in GSE66360. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi dell'arricchimento di geni differenzialmente espressi (DEG). (A) Le prime cinque ontologie geniche arricchite (GO) NALFD-DEG nel processo biologico (BP), nella componente cellulare (CC) e nella funzione molecolare (MF). (B) I primi cinque MI-DEG arricchiti di GO in BP, CC e MF. (C) Le prime otto vie di segnalazione dei geni e dei genomi (KEGG) arricchite dai NALFD-DEG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). (D) I primi otto MI-DEG hanno arricchito le vie di segnalazione KEGG. (E) Le prime cinque ontologie della malattia arricchita (DO) di NALFD-DEG. (F) I primi cinque MI-DEG arricchiti da DO. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Diagrammi di rete di interazione proteina-proteina (PPI). (A) Un diagramma di rete PPI della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) ottenuto dalla piattaforma online String. (B) Un diagramma di rete PPI della NAFLD ottenuto da Cytoscape. (C) Un diagramma di rete PPI dell'infarto del miocardio (MI) ottenuto dalla piattaforma online String. (D) Un diagramma di rete PPI di MI ottenuto da Cytoscape. (E) Un diagramma di rete PPI delle interazioni proteiche. (F) Un diagramma di rete PPI di IL1B e FOS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Screening dei DEG dell'hub candidato. (A) Sei DEG cruciali ottenuti da SVM-RFE in NAFLD. (B) Quattro DEG cruciali ottenuti da SVM-RFE nell'infarto del miocardio (MI). (C) Quattro DEG cruciali ottenuti da LASSO in NAFLD. (D) Cinque DEG cruciali ottenuti da LASSO in MI. (E) Solo un DEG acquisito dai risultati di cui sopra nel diagramma di Venn. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Valore diagnostico di un gene a espressione differenziale (DEG) hub. (A) Curve ROC nella NAFLD. (B) Curve ROC in MI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Distribuzione delle cellule immunitarie infiltranti e correlazione tra THBS1 e cellule immunitarie infiltranti nella steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e nell'infarto del miocardio (MI). (A) Distribuzione delle cellule immunitarie infiltranti nella NAFLD. (B) Distribuzione delle cellule immunitarie infiltranti nell'infarto miocardico. (C) Correlazione tra THBS1 e cellule immunitarie infiltranti nella NAFLD. (D) Correlazione tra THBS1 e cellule immunitarie infiltranti nell'infarto miocardico. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

AbbreviazioneNomenclatura
AUCArea sotto la curva
BPProcesso biologico
CCComponente cellulare
TRUFFAREControlli
DEGGeni differenzialmente espressi
FAREOntologia delle malattie
ANDAREOntologia genetica
KEGGEnciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi
LACCIOOperatore di restringimento e selezione minimo assoluto
MFFunzione molecolare
MIInfarto del miocardio
NAFLDSteatosi epatica non alcolica
PPIInterazione proteina-proteina
ROCCurve caratteristiche dell'operatore del ricevitore
ssGSEAAnalisi dell'arricchimento del set genico a campione singolo
SVM-RFESupporto all'eliminazione delle funzioni ricorsive della macchina vettoriale
THBS1Trombospondina 1

Tabella 1: Parametri di simulazione utilizzati nella sperimentazione.

Discussione

Il metodo descritto in questo studio ha implicazioni significative per la ricerca sui meccanismi molecolari alla base di NAFLD e MI. Identificando biomarcatori chiave come THBS1, il protocollo proposto offre potenziali bersagli sia per interventi diagnostici che terapeutici. Questo approccio può essere esteso ad altre malattie complesse che coinvolgono molteplici percorsi e risposte immunitarie, facilitando la scoperta di nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici. Inoltre, l'integrazione di tecniche bioinformatiche e di apprendimento automatico fornisce un quadro versatile per la medicina personalizzata, consentendo strategie di trattamento su misura basate su profili molecolari individuali. Questo metodo può anche essere adattato per l'uso in contesti clinici per migliorare l'accuratezza diagnostica e migliorare gli esiti dei pazienti attraverso interventi mirati.

La NAFLD e l'infarto del miocardio (IM) sono due importanti problemi di salute con prevalenza e mortalità significative. La NAFLD è caratterizzata dall'accumulo di lipidi nel fegato1. Prove crescenti suggeriscono che la NAFLD influisce negativamente non solo sull'integrità strutturale del cuore, ma anche sulla sua funzione, in particolare nel contesto dell'MI 22,23,24. Inoltre, ci sono prove convincenti che indicano una forte correlazione tra NAFLD e aterosclerosi. Gli studi hanno scoperto che la prevalenza e la gravità della NAFLD nei pazienti con infarto miocardico non diabetico sono legate alla malattia coronarica25. È stato dimostrato che la NAFLD da moderata a grave è un fattore di rischio indipendente, aumentando di tre volte il rischio di lesioni coronariche multiple4. Tuttavia, questi studi si concentrano principalmente su NAFLD e MI, lasciando ancora poco chiari i meccanismi alla base dell'associazione tra NAFLD e aterosclerosi. Pertanto, è fondamentale esplorare questi meccanismi per prevenire l'infarto miocardico correlato alla NAFLD.

In questo studio, sono stati ottenuti due set di dati dall'NCBI-GEO. L'analisi ha rivelato 13 DEG up-regolati e 1 DEG down-regolato tra NAFLD e MI. È stata eseguita l'analisi dell'arricchimento funzionale, è stato costruito un diagramma di rete co-PPI e sono stati impiegati due algoritmi di apprendimento automatico per identificare i DEG hub. Di conseguenza, THBS1 è stato identificato come un nuovo biomarcatore con un'eccezionale efficienza diagnostica sia per la NAFLD che per l'infarto miocardico. La Support Vector Machine (SVM) è una tecnica di apprendimento automatico supervisionato ampiamente utilizzata per la classificazione e la regressione17. L'eliminazione ricorsiva delle caratteristiche (RFE) aiuta a selezionare i geni più significativi dal campione. L'algoritmo di regressione LASSO19 applica la regolarizzazione per migliorare l'accuratezza delle previsioni. Combinando questi algoritmi con i co-DEG, siamo stati in grado di selezionare i DEG ottimali.

Sulla base dell'analisi che utilizza due algoritmi di apprendimento automatico e co-DEG, la trombospondina 1 (THBS1 o TSP1) è stata identificata come un hub diagnostico chiave DEG. THBS1 è un membro delle proteine della matrice extracellulare ed è stato rilevato per la prima volta nelle piastrine in risposta alla stimolazione della trombina26. Varie cellule, tra cui le cellule endoteliali, le cellule stellate epatiche e le cellule muscolari lisce, possono produrre e secernere THBS1 nello spazio extracellulare 27,28,29. THBS1 interagisce con CD36, un noto ligando30, ed esercita un effetto anti-angiogenico regolando CD36 29,31, sottolineando il suo ruolo significativo nelle malattie cardiovascolari. Inoltre, THBS1 può regolare l'angiogenesi e l'aggregazione piastrinica attraverso le sue interazioni con recettori e proteine come CD47, il fattore di crescita trasformante β e le integrine32. Ciò suggerisce che THBS1 può svolgere un ruolo cruciale nella formazione di trombi, nella rottura della placca vulnerabile e nel successivo rimodellamento ventricolare durante l'infarto miocardico 33,34,35.

Inoltre, lo sviluppo della NAFLD è strettamente associato alla sintesi delle proteine secrete in circolazione. Uno studio registrativo pubblicato su EBioMedicine ha dimostrato che la THBS1, come proteina secreta, potrebbe fungere da nuovo biomarcatore per la NAFLD. Questo studio ha anche scoperto che la somministrazione esogena di THBS1 migliora la deposizione lipidica epatica inibendo le vie di sintesi lipidica36. In particolare, il CD36 è stato identificato come un recettore chiave per gli effetti di THBS1 contro la NAFLD. Inoltre, ABT-526, un analogo peptidico di THBS1, ha dimostrato di inibire la sintesi lipidica negli epatociti. Questi risultati forniscono nuove informazioni sulla diagnosi e il trattamento della NAFLD e suggeriscono che THBS1 potrebbe essere un nuovo biomarcatore sia per la NAFLD che per l'infarto miocardico, offrendo uno strumento diagnostico veloce, semplice e accessibile.

Recenti evidenze evidenziano il ruolo critico delle risposte immuno-infiammatorie nella progressione di NAFLD e MI. Le caratteristiche principali includono l'espressione delle citochine, la regolazione immunitaria e l'attivazione del sistema neuroendocrino. Wabitsch et al. hanno dimostrato che la metformina conferisce epatoprotezione inibendo l'espressione delle cellule T CD8+ nei topi NAFLD37. Dolejsi et al. hanno riportato una diminuzione delle cellule T CD8+ e una significativa riduzione della capacità di riparazione miocardica38. Qin et al. hanno scoperto che i neutrofili, come parte dell'indice di immuno-infiammazione sistemica, sono associati all'escrezione urinaria di albumina nei pazienti con NAFLD39. Zhang et al. hanno indicato che l'infiltrazione e la degranulazione dei neutrofili sono coinvolte sia nei processi di lesione che di recupero durante l'MI27.

In linea con questi risultati, i risultati attuali hanno rivelato un aumento dell'infiltrazione di cellule CCR, MHC classe I, neutrofili, para-infiammazione e Tfh, mentre le cellule T CD8+, l'attività citolitica e il TIL sono diminuiti nei pazienti con NAFLD e MI rispetto ai controlli sani. Inoltre, l'analisi di correlazione ha mostrato che THBS1 era correlato positivamente con CCR, MHC classe I, neutrofili, parainfiammazione e cellule Tfh e correlato negativamente con le cellule T CD8+, l'attività citolitica e il TIL nei pazienti con NAFLD e MI. Queste osservazioni suggeriscono che THBS1 può contribuire alla modulazione delle risposte immunitarie aumentando CCR, MHC classe I, neutrofili, parainfiammazione e cellule Tfh, diminuendo al contempo le cellule T CD8+, l'attività citolitica e il TIL durante lo sviluppo e la progressione di NAFLD e MI. Tuttavia, queste speculazioni giustificano ulteriori indagini per confermare il ruolo preciso di THBS1 in questi processi.

Questo studio mirava a chiarire le connessioni molecolari tra NAFLD e MI utilizzando approcci bioinformatici e di apprendimento automatico completi. I risultati hanno identificato 96 geni differenzialmente espressi (DEG) nella NAFLD e 126 nell'infarto miocardico, con 14 DEG che si sovrappongono tra le due condizioni. L'analisi dell'arricchimento funzionale ha rivelato che questi DEG sono coinvolti in processi e percorsi biologici critici, come la differenziazione delle cellule adipose, la chemiotassi dei leucociti e varie vie di segnalazione, tra cui IL-17, TNF e NF-κB. Questi risultati evidenziano l'intricata interazione delle vie infiammatorie e metaboliche nella NAFLD e nell'infarto miocardico. La costruzione di diagrammi di rete di interazione proteina-proteina (PPI), combinata con analisi di apprendimento automatico (SVM-RFE e LASSO), ha identificato THBS1 come un gene hub chiave. THBS1 ha dimostrato eccellenti prestazioni diagnostiche, con un'area sotto la curva (AUC) di 0,981 per NAFLD e 0,900 per MI, suggerendo il suo potenziale come biomarcatore robusto per entrambe le condizioni.

Inoltre, l'analisi dell'immuno-infiltrazione ha rivelato profili di cellule immunitarie distinti nei pazienti con NAFLD e MI rispetto ai controlli sani. In particolare, i pazienti con NAFLD e MI hanno mostrato un aumento dell'infiltrazione di cellule CCR, MHC di classe I, neutrofili, parainfiammazione e Tfh, mentre mostravano una diminuzione dei livelli di cellule T CD8+, attività citolitica e TIL. Queste caratteristiche immunitarie sottolineano la natura infiammatoria di entrambe le condizioni ed evidenziano il ruolo di THBS1 nella modulazione delle risposte immunitarie.

Questo studio fornisce nuove informazioni sui meccanismi molecolari condivisi alla base di NAFLD e MI, con THBS1 che emerge come un nuovo biomarcatore per la diagnosi e un potenziale bersaglio terapeutico. I risultati aprono la strada a future ricerche su interventi mirati e strategie di trattamento personalizzate per i pazienti con queste condizioni interconnesse. Integrando la bioinformatica, l'apprendimento automatico e l'analisi dell'immunoinfiltrazione, la ricerca contribuisce allo sviluppo di una piattaforma di supporto alle decisioni mediche volta a migliorare la gestione clinica di NAFLD e MI.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 62271511, U21A200949), dalla Yucai Foundation of General Hospital of the Southern Theatre Command (2022NZC011), dal Guangzhou Science and Technology Program Project (2023A03J0170), dal National Clinical Research Center for Geriatrics (NCRCG-PLAGH-2023006) e dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2020A1515010288, No.2021A1515220101).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersione 3.6.1Utilizzato per la visualizzazione del set di dati MI delle reti di interazione proteina-proteina (PPI
) GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).Database NCBI-GEO-Per raccogliere set di dati di microarray di RNA per l'analisi
Pacchetto R clusterProfilerBioconductor-Utilizzato per analisi di arricchimento GO, KEGG e DO
Pacchetto R ggplot2CRAN-Utilizzato per creare diagrammi di Venn e altre visualizzazioni
Pacchetto R GSEABaseBioconductor -Utilizzato in combinazione con GSVA per l'analisi dell'arricchimento del set genico
Pacchetto R GSVABioconductor -Utilizzato per l'analisi dell'arricchimento del set genico su campione singolo (ssGSEA)
Pacchetto R limmaBioconductor -Utilizzato per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG)
Pacchetto R pheatmapCRAN&nbsp;-Utilizzato per generare mappe di calore
Pacchetto R vennCRAN&nbsp;-Utilizzato per creare diagrammi di Venn
Set di dati di microarray di RNA (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Set di dati di microarray di RNA disponibili pubblicamente utilizzati per l'analisi
RStudioRStudio, PBCVersione 1.4.1717Ambiente di sviluppo integrato per
il database R StringSTRING (www.string-db.org/)  -Strumento online per la costruzione di reti PPI

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