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Articolo metodologico

Una piattaforma di supporto alle decisioni mediche per l'identificazione della trombospondina 1 nella steatosi epatica non alcolica tramite analisi di immunoinfiltrazione

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DOI:

10.3791/67328

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30 agosto 2024

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha studiato le relazioni tra steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e infarto del miocardio (MI) attraverso geni co-espressi, identificando la trombospondina 1 (THBS1) come biomarcatore. L'analisi di immunoinfiltrazione ha rivelato che le cellule T CD8+ e i neutrofili sono fattori chiave, con THBS1 che mostra un potenziale come strumento diagnostico per NAFLD e MI.

Abstract

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e l'infarto del miocardio (MI) sono due importanti oneri sanitari con prevalenza e mortalità significative. Questo studio mirava a esplorare i geni co-espressi per comprendere la relazione tra NAFLD e MI e identificare potenziali biomarcatori cruciali di MI correlato a NAFLD utilizzando la bioinformatica e l'apprendimento automatico. È stata condotta l'analisi dell'arricchimento funzionale, è stato costruito un diagramma di rete di interazione co-proteina (PPI) e sono state impiegate tecniche di eliminazione delle caratteristiche ricorsive della macchina del vettore di supporto (SVM-RFE) e dell'operatore di restringimento e selezione minimo assoluto (LASSO) per identificare un gene differenzialmente espresso (DEG), la trombospondina 1 (THBS1). THBS1 ha dimostrato una forte performance nel distinguere i pazienti con NAFLD (AUC = 0,981) e i pazienti con infarto miocardico (AUC = 0,900). L'analisi dell'immunoinfiltrazione ha rivelato linfociti T CD8+ significativamente più bassi e livelli di neutrofili più elevati nei pazienti con NAFLD e MI. Le cellule T CD8+ e i neutrofili sono risultati efficaci nel distinguere la NAFLD/MI dai controlli sani. L'analisi di correlazione ha mostrato che THBS1 era correlato positivamente con CCR (recettore delle chemochine), classe MHC (classe del complesso maggiore di istocompatibilità), neutrofili, parainfiammazione e Tfh (cellule T helper follicolari) e correlato negativamente con le cellule T CD8+, l'attività citolitica e il TIL (linfociti infiltranti il tumore) nei pazienti con NAFLD e MI. THBS1 è emerso come un nuovo biomarcatore per la diagnosi di NAFLD/MI rispetto ai controlli sani. I risultati indicano che le cellule T CD8+ e i neutrofili potrebbero fungere da caratteristiche immunitarie infiammatorie per differenziare i pazienti con NAFLD/MI da individui sani.

Introduzione

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è un grave problema di salute pubblica, con una prevalenza del 25%-30%1. È stato riportato che la prevalenza di NAFLD è elevata tra i pazienti con diabete2. Tuttavia, il significato della NAFLD nei pazienti non diabetici non è ancora chiaro. Gli studi hanno suggerito che la NAFLD svolge un ruolo indipendente nella patogenesi dell'aterosclerosi 3,4. Inoltre, una meta-analisi ha dimostrato che la NAFLD è strettamente associata alla calcificazione dell'arteria coronarica, alla disfunzione endoteliale e all'aterosclerosi ed è emersa come fattore di rischio cardiovascolare indipendente5. La connessione tra NAFLD e malattie cardiovascolari richiede ancora ulteriori indagini.

L'infarto del miocardio (IM) è una malattia catastrofica che minaccia la salute e impone un onere economico significativo ai pazienti e alle loro famiglie in tutto il mondo6. L'infarto miocardico è anche una delle principali cause di morte nei pazienti con NAFLD. Uno studio clinico pubblicato sul British Medical Journal ha dimostrato che il rischio di infarto del miocardio nei pazienti con NAFLD è 1,17 volte maggiore rispetto ai pazienti non con NAFLD 7,8. Alcuni studi hanno identificato percorsi molecolari, tra cui l'infiammazione, lo stress ossidativo e il metabolismo lipidico, che contribuiscono all'MI 9,10,11 correlato alla NAFLD. Tuttavia, i meccanismi sottostanti che collegano NAFLD e MI rimangono poco chiari. È fondamentale identificare nuovi biomarcatori correlati alla prognosi di NAFLD e MI.

La crescente prevalenza della NAFLD, che colpisce un ampio segmento della popolazione, sottolinea un problema significativo di salute pubblica, in particolare data la sua associazione con il diabete. Tuttavia, l'impatto della NAFLD sui pazienti non diabetici rimane poco compreso. La NAFLD è stata implicata nella patogenesi dell'aterosclerosi ed è riconosciuta come un fattore di rischio cardiovascolare indipendente, essendo strettamente legata alla calcificazione dell'arteria coronarica, alla disfunzione endoteliale e all'aterosclerosi. Nonostante queste associazioni, i meccanismi precisi che collegano la NAFLD e le malattie cardiovascolari come l'infarto del miocardio (IM) richiedono ulteriori chiarimenti. L'infarto miocardico è una delle principali cause di mortalità in tutto il mondo e impone un onere economico significativo. Il rischio di infarto miocardico nei pazienti con NAFLD è notevolmente più elevato rispetto a quelli senza NAFLD, evidenziando la necessità di una comprensione più profonda dei percorsi molecolari che collegano queste condizioni. Mentre l'infiammazione, lo stress ossidativo e il metabolismo dei lipidi sono stati suggeriti come fattori che contribuiscono, i meccanismi esatti rimangono poco chiari. C'è un urgente bisogno di identificare nuovi biomarcatori in grado di fornire informazioni sulla prognosi e sulla gestione dell'infarto miocardico correlato alla NAFLD.

Di conseguenza, in questo studio, i set di dati di microarray di RNA per NAFLD e MI sono stati scaricati dal National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO, vedi Table of Materials) per identificare e analizzare l'interazione dei geni differenzialmente espressi (DEG) tra NAFLD e MI. Analisi dell'arricchimento, costruzione di diagrammi di rete di interazione proteina-proteina (PPI), eliminazione delle caratteristiche ricorsive della macchina del vettore di supporto (SVM-RFE), e gli algoritmi LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) sono stati utilizzati per identificare i geni hub 12,13,14,15,16,17,18,19. L'analisi di immunoinfiltrazione è stata eseguita per esaminare le cellule immunitarie nei pazienti con NAFLD e MI. Infine, questi metodi sono stati integrati per chiarire la relazione tra NAFLD e MI. La Figura 1 illustra la sequenza di progettazione seguita in questo studio. Combinando la bioinformatica, l'apprendimento automatico e l'analisi dell'immunoinfiltrazione, questo studio mira a contribuire allo sviluppo di una nuova piattaforma di supporto alle decisioni mediche.

I contributi chiave di questo articolo sono: (1) Identificazione di geni co-espressi: lo studio evidenzia la relazione tra NAFLD e MI identificando geni co-espressi, offrendo una comprensione più profonda dei legami molecolari tra queste due condizioni. (2) Applicazione della bioinformatica e dell'apprendimento automatico: utilizzando tecniche di bioinformatica e apprendimento automatico, tra cui l'eliminazione ricorsiva della macchina del vettore di supporto (SVM-RFE)17 e l'operatore di restringimento e selezione meno assoluto (LASSO)19, lo studio identifica THBS1 come un gene espresso in modo differenziale. THBS1 dimostra elevate prestazioni nel distinguere i pazienti con NAFLD e MI dai controlli sani. (3) Analisi di immunoinfiltrazione: lo studio conduce un'analisi di immunoinfiltrazione, rivelando livelli significativamente più bassi di cellule T CD8+ e livelli più elevati di neutrofili nei pazienti con NAFLD e MI. (4) Analisi di correlazione: la ricerca dimostra che THBS1 è correlato positivamente con diversi fattori immunitari, tra cui CCR (recettore delle chemochine), MHC di classe I (complesso maggiore di istocompatibilità di classe I), neutrofili, parainfiammazione e cellule Tfh (T helper follicolare). È correlato negativamente con le cellule T CD8+, l'attività citolitica e i linfociti infiltranti il tumore (TIL).

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Protocollo

I dettagli dei database, dei collegamenti web e dei software/pacchetti utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali. I parametri di simulazione utilizzati sono riportati nella Tabella 1.

1. Ottenere set di dati di microarray di RNA

  1. Scarica il set di dati sull'infarto del miocardio (MI), GSE66360, dal database NCBI-GEO .
  2. Scarica il set di dati sulla steatosi epatica non alcolica (NAFLD), GSE89632, dal database NCBI-GEO .
  3. Assicurarsi che i set di dati scaricati includano 49 campioni di MI, 50 controlli integri per GSE66360, 39 campioni di NAFLD e 24 controlli integri per GSE89632.

2. Identificazione dei DEG

  1. Pre-elaborazione dei dati e identificazione DEG
    1. Caricare i set di dati in RStudio usando le funzioni R appropriate.
    2. Utilizzare il pacchetto R limma per identificare i DEG12 con le seguenti soglie: P < 0.05P e | log FC | > 1.5.
    3. Utilizza i pacchetti R pheatmap, ggplot2 e Venn per generare mappe termiche e diagrammi di Venn per la visualizzazione dei DEG.
  2. Creare visualizzazioni
    1. Usa pheatmap per generare mappe termiche di DEG.
    2. Utilizzare ggplot2 per creare diagrammi di Venn che mostrino la sovrapposizione dei DEG tra NAFLD e MI.

3. Analisi dell'arricchimento

  1. Esecuzione dell'analisi di arricchimento GO, KEGG e DO
    1. Caricare i DEG nel pacchetto R clusterProfiler13.
    2. Conduci analisi di arricchimento di ontologia genica (GO) per classificare i DEG in funzioni molecolari, processi biologici e componenti cellulari.
    3. Eseguire l'analisi del percorso dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG) per mappare i DEG sui percorsi biochimici.
    4. Utilizza l'analisi dell'arricchimento dell'ontologia delle malattie (DO) per collegare i DEG a stati clinici specifici.

4. Analisi PPI mediante la costruzione di reti PPI

  1. Utilizza la piattaforma online STRING 14 per costruire diagrammi di rete di interazione proteina-proteina (PPI) di co-DEG con un punteggio di confidenza di 0,4.
  2. Visualizza le reti PPI utilizzando Cytoscape15.

5. Screening dei DEG dell'hub candidato applicando algoritmi di apprendimento automatico

  1. Utilizza gli algoritmi di regressione SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) e LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) in RStudio per selezionare i DEG più rilevanti 16,17,18.
  2. Assicurarsi che SVM-RFE classifichi e rimuova le feature in modo iterativo, mentre la regressione LASSO19 applica la regolarizzazione per identificare un set sparso di DEG.

6. Costruzione della curva ROC per la valutazione delle prestazioni diagnostiche

  1. Utilizzare RStudio per eseguire l'analisi della curva ROC (Receiver Operating Characteristic)20.
  2. Calcolare l'area sotto la curva (AUC) per i co-DEG cruciali.

7. Analisi di immunoinfiltrazione per esplorare l'infiltrazione immunitaria

  1. Eseguire l'analisi dell'arricchimento del set genico a campione singolo (ssGSEA) utilizzando i pacchetti R GSVA e GSEABase per analizzare l'infiltrazione immunitaria in NAFLD e MI21.
  2. Confrontare l'abbondanza relativa di tipi di cellule immunitarie tra i campioni di NAFLD e MI e i controlli sani.

8. Analisi statistica

  1. Esegui tutte le analisi statistiche in RStudio.
  2. Applicare l'analisi di correlazione di Pearson per esaminare i modelli di co-espressione genica.
  3. Garantisci la significatività statistica con P < 0,05.
    NOTA: assicurarsi che tutti i pacchetti software e R siano installati correttamente e aggiornati alle versioni più recenti prima di avviare il protocollo.

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Risultati

I risultati chiave dello studio proposto sono presentati qui, comprendendo varie analisi condotte per chiarire i meccanismi molecolari alla base di NAFLD e MI.

Identificazione dei DEG
Nel set di dati GSE89632, 76 geni up-regolati e 20 down-regolati sono stati identificati come NAFLD-DEG (Figura 2B, D), mentre il set di dati GSE66360 ha rivelato 118 geni up-regolati e 8 down-regolati come MI-DEG (Figura 2C

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Discussione

Il metodo descritto in questo studio ha implicazioni significative per la ricerca sui meccanismi molecolari alla base di NAFLD e MI. Identificando biomarcatori chiave come THBS1, il protocollo proposto offre potenziali bersagli sia per interventi diagnostici che terapeutici. Questo approccio può essere esteso ad altre malattie complesse che coinvolgono molteplici percorsi e risposte immunitarie, facilitando la scoperta di nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici. Inoltre, l'integrazione...

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Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 62271511, U21A200949), dalla Yucai Foundation of General Hospital of the Southern Theatre Command (2022NZC011), dal Guangzhou Science and Technology Program Project (2023A03J0170), dal National Clinical Research Center for Geriatrics (NCRCG-PLAGH-2023006) e dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2020A1515010288, No.2021A1515220101).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersione 3.6.1Utilizzato per la visualizzazione del set di dati MI delle reti di interazione proteina-proteina (PPI
) GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).Database NCBI-GEO-Per raccogliere set di dati di microarray di RNA per l'analisi
Pacchetto R clusterProfilerBioconductor-Utilizzato per analisi di arricchimento GO, KEGG e DO
Pacchetto R ggplot2CRAN-Utilizzato per creare diagrammi di Venn e altre visualizzazioni
Pacchetto R GSEABaseBioconductor -Utilizzato in combinazione con GSVA per l'analisi dell'arricchimento del set genico
Pacchetto R GSVABioconductor -Utilizzato per l'analisi dell'arricchimento del set genico su campione singolo (ssGSEA)
Pacchetto R limmaBioconductor -Utilizzato per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG)
Pacchetto R pheatmapCRAN&nbsp;-Utilizzato per generare mappe di calore
Pacchetto R vennCRAN&nbsp;-Utilizzato per creare diagrammi di Venn
Set di dati di microarray di RNA (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Set di dati di microarray di RNA disponibili pubblicamente utilizzati per l'analisi
RStudioRStudio, PBCVersione 1.4.1717Ambiente di sviluppo integrato per
il database R StringSTRING (www.string-db.org/)  -Strumento online per la costruzione di reti PPI

Riferimenti

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