Articolo metodologico

Microbiota dei giardini delle formiche di Attine: visualizzazione di un paesaggio microbico mediante microscopia elettronica a scansione

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

In questo articolo

Sommario

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Proponiamo un protocollo ottimizzato di microscopia elettronica a scansione per la visualizzazione di campioni altamente eterogenei e delicati contenenti biomassa vegetale e fungina, insieme a microbiota e biofilm. Questo protocollo consente di descrivere le dimensioni spaziali dell'organizzazione del microbiota.

Abstract

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Negli ecosistemi su macroscala, come le foreste pluviali o le barriere coralline, la localizzazione spaziale degli organismi è la base della nostra comprensione dell'ecologia delle comunità. Nel mondo microbico, allo stesso modo, gli ecosistemi su microscala sono ben lungi dall'essere una miscela casuale e omogenea di organismi e habitat. L'accesso alla distribuzione spaziale dei microbi è fondamentale per comprendere il funzionamento e l'ecologia del microbiota, poiché le specie conviventi hanno maggiori probabilità di interagire e influenzare la fisiologia dell'altra.

Un ecosistema microbico interregno è al centro delle colonie di formiche che coltivano funghi, che coltivano funghi basidiomiceti come risorsa nutrizionale. Le formiche attine si nutrono di diversi substrati (per lo più a base vegetale), metabolizzati dal fungo coltivato mentre formano una struttura spugnosa, un "giardino microbico" che funge da intestino esterno. Il giardino è una rete intrecciata di ife fungine che crescono metabolizzando il substrato, aprendo nicchie per l'insediamento di un microbiota caratteristico e adattato. Si ritiene che il microbiota contribuisca alla degradazione del substrato e alla crescita fungina, anche se la sua organizzazione spaziale deve ancora essere determinata.

Qui, descriviamo come impieghiamo la microscopia elettronica a scansione (SEM) per indagare, con dettagli senza precedenti, il microbiota e l'organizzazione spaziale del biofilm in diversi sistemi di fungicoltura di formiche che crescono funghi. L'imaging SEM ha fornito una descrizione della struttura spaziale e dell'organizzazione del microbiota. Il SEM ha rivelato che il microbiota si assembla comunemente in biofilm, una struttura diffusa dei paesaggi microbici nella fungicoltura. Presentiamo i protocolli impiegati per fissare, disidratare, asciugare, spruzzare il rivestimento e visualizzare una comunità così complessa. Questi protocolli sono stati ottimizzati per trattare campioni delicati ed eterogenei, comprendenti biomassa vegetale e fungina, nonché il microbiota e il biofilm.

Introduzione

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Gli ecosistemi sono composti da organismi interconnessi da processi in una specifica posizione geografica (ad esempio, l'ambiente). Gli organismi interagiscono con il loro ambiente nel tempo, da cui emergono modelli spaziali complessi ed eterogenei. La modellazione spaziale determina la diversità e la stabilità ecologica e, in ultima analisi, il funzionamento dell'ecosistema 1,2,3,4. Negli ecosistemi su macroscala, come le zone umide, le savane, le barriere coralline e gli ecosistemi aridi, i modelli spaziali sono correlati al flusso e alla concentrazione delle risorse. Consentendo l'ottimizzazione delle risorse, l'eterogeneità spaziale e la modellizzazione si ottengono ecosistemi più resilienti rispetto a quelli omogenei2. La localizzazione spaziale degli organismi, essendo alla base dell'ecologia di comunità, viene tradotta anche nel mondo microbico.

Gli ecosistemi microbici, lontani da organismi mescolati casualmente e in modo omogeneo in tutti i microhabitat, mostrano modelli spaziali che definiscono gran parte del loro funzionamento 5,6,7. Dalle colonne di Winogradsky al microbiota associato all'ambiente e all'ospite, questi ecosistemi sono organizzati in modo eterogeneo nello spazio, con disposizioni spaziali che suscitano diverse risposte fenotipiche. Le specie conviventi hanno maggiori probabilità di interagire e influenzare la fisiologia dell'altra. Così, l'organizzazione spaziale della comunità, più che la sua composizione di per sé, delimita le proprietà dell'ecosistema e le nicchie ecologiche 5,7,8. Illustrando questi concetti, i cambiamenti nel pattern spaziale sembrano correlati alla progressione patologica delle placche dentali, della carie, delle malattie gengivali 9,10, delle malattie infiammatorie intestinali11, delle infezioni polmonari da fibrosi cistica, delle infezioni croniche delle ferite12,13, del cancro del colon-retto e degli adenomi14.

Nell'ambito della biogeografia microbica (lo studio della distribuzione e della modellizzazione della biodiversità nello spazio e nel tempo su microscala), la conoscenza degli ecosistemi microbici è enormemente avvantaggiata dalla comprensione dei loro modelli spaziali 6,13,15,16,17. Abbiamo esaminato i modelli spaziali di un ecosistema microbico costruito da insetti, che si trova al centro delle carismatiche colonie di formiche attine (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina) che crescono funghi. Lì risiede un "giardino microbico", incentrato su un fungo basidiomicete della tribù Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) o della famiglia Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Il giardino è una struttura spugnosa che emerge da una rete intrecciata di ife che cresce metabolizzando il substrato per lo più vegetale incorporato dalle formiche (Figura 1). Questi possono includere, secondo i generi attini: parti secche di piante, escrementi e carcasse di insetti, foglie appena tagliate, semi e parti floreali23,24. Analogamente a un intestino erbivoro esterno, l'orto converte enzimaticamente e chimicamente i polimeri recalcitranti in risorse nutritive labili, fornendo alle formiche aminoacidi essenziali, lipidi e zuccheri solubili 21,25,26,27,28.

Le analisi ultrastrutturali, enzimatiche e trascrittomiche effettuate per giardini dei generi Atta e Acromyrmex suggeriscono che questi ambienti strutturano un continuum di degradazione del substrato e macchie nutrizionali 26,29,30,31,32. Le parti giovani del giardino tendono ad essere più scure a causa del substrato appena incorporato dopo essere stato frammentato. Questi substrati aggiunti di recente sono spesso colonizzati dai bordi, che sono stati tagliati dalle formiche operaie e inoculati con grumi miceliali. Irradiandosi dai bordi tagliati, le ife fungine si diffondono sul substrato 29,32,33. L'abbondanza ife aumenta con il progredire della degradazione del substrato, con conseguente comparsa di regioni biancastre e metabolicamente attive 30,31,32. Le regioni più vecchie, con substrato più degradato e un abbondante microbiota29,32, tendono a presentare toni brunastri e maggiore umidità. I lavoratori rimuovono i frammenti di questa regione, separandoli in cumuli di rifiuti, dove prendono anche substrati che danneggiano il simbionte fungino 34,35,36. I cumuli di rifiuti, anche se fisicamente staccati dal giardino, sono un punto di continua degradazione del substrato e di ciclo dei nutrienti da parte dell'abbondante microbiota abitante 29,32,37,38,39.

Un microbiota composto principalmente da Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas e Serratia, abita anche il giardino, apparentemente condiviso da diversi sistemi di fungicoltura attina. Codificando vie metaboliche che potrebbero integrare il metabolismo fungino, il microbiota partecipa potenzialmente alle risposte fisiologiche del giardino 40,41,42,43,44. Non solo i dati metagenomici indicavano che il microbiota era presente 41,42, ma anche l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) della fungicoltura delle formiche tagliafoglie ha mostrato per lo più batteri a forma di bastoncino sul substrato vegetale32. Sebbene i batteri (compresi i ceppi cellulolitici) fossero isolati dall'intero giardino, venivano visualizzati solo nelle parti più vecchie del giardino e nei cumuli di rifiuti, così come nel pellet iniziale trasportato dalle regine fondatrici29,32. Era anche incerto se il microbiota potesse formare biofilm in vivo (cioè in giardino e nei rifiuti), come suggerito dalla loro capacità metabolica42 e osservato in vitro44.

Qui, abbiamo impiegato il SEM per comprendere ulteriormente l'organizzazione spaziale del microbiota nelle regioni del giardino, dettagliando le interazioni fisiche microbiota-substrato e microbiota-ife. Fornendo immagini con una maggiore profondità focale, il SEM consente osservazioni di strutture microscopiche tridimensionali ad alta risoluzione, consentendo un'analisi approfondita dei modelli spaziali del microbiota del giardino. Descriviamo in dettaglio i passaggi per fissare, disidratare, asciugare, polverizzare il pelo e visualizzare campioni a base fungina così eterogenei e delicati. Rimuovendo la fase di postfissazione utilizzando tetrossido di osmio (OsO4) e riducendo il tempo di disidratazione, abbiamo semplificato i protocolli 32,33,45 per la preparazione di campioni di giardino e rifiuti per l'analisi SEM. Questo protocollo adattato preserva i modelli strutturali ifali, nonché l'organizzazione spaziale del microbiota e del biofilm, e potrebbe essere applicato ad altri delicati ecosistemi microbici e biofilm.

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Figura 1: Giardini microbici di Attine. Il giardino è una struttura spugnosa risultante da una rete intrecciata di ife che cresce metabolizzando il substrato per lo più vegetale incorporato dalle formiche. Abita il giardino anche il microbiota, che codifica le vie metaboliche che potrebbero integrare il metabolismo fungino. I dati metagenomici e le precedenti analisi di microscopia elettronica a scansione indicavano la sua presenza, anche se avevamo scarsa conoscenza della sua organizzazione spaziale e delle interazioni fisiche con il substrato e le ife fungine. Abbiamo impiegato il SEM per svelare l'organizzazione spaziale e il pattern del microbiota e del biofilm. Illustrazioni di Mariana Barcoto (giardino e microbiota adattati da Barcoto e Rodrigues 94) e foto di Mariana Barcoto ed Enzo Sorrentino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

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1. Campionamento delle colonie in campo

NOTA: Quando si raccolgono colonie di formiche, certificare che tutte le autorizzazioni richieste dalla legislazione locale siano state ottenute prima della raccolta. Nel nostro caso, il permesso di raccolta #74585 è stato rilasciato dall'Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Quando i campioni provengono da una colonia di laboratorio, vai alla sezione 2.

  1. Individua e contrassegna la colonia. Scavare una trincea che circonda l'area del nido fino a quando la camera del giardino non è esposta (Figura 2A).
    NOTA: Alcune specie di attine possono costruire le loro colonie sotto la lettiera di foglie o all'interno di tronchi marci. In questi casi, girare con cura la lettiera o rompere con cura i tronchi per raccogliere i campioni. Per informazioni dettagliate sulla localizzazione, la raccolta e il mantenimento di colonie viventi di diverse specie di formiche attine, vedi Sosa-Calvo et al.46.
  2. Aprire lateralmente la camera del giardino per evitare che il terreno cada sulla superficie del giardino. Raccogli con cura i campioni del giardino usando una pinza entomologica, un cucchiaio o una schiumarola da cucina, a seconda delle dimensioni del giardino.
    NOTA: Assicurarsi di sterilizzare gli strumenti prima di raccoglierli. Quando raccogli i giardini delle formiche che tagliano le foglie, indossa guanti di stoffa spessa per prevenire (o almeno attenuare) i morsi delle operaie. Per altre specie di attine, i guanti in tessuto sono opzionali.
  3. Trasferisci i campioni del giardino in un recipiente di plastica pulito contenente uno strato di intonaco per bilanciare l'umidità del giardino. Dopo aver trasferito il giardino e le formiche operaie, chiudere ermeticamente il recipiente per evitare l'essiccazione del campione. Conservare i campioni da giardino a 23-25 °C fino alla lavorazione.
  4. Chiudere la trincea con il terreno precedentemente rimosso.

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Figura 2: Protocollo di preparazione del campione. (A) Campionamento delle colonie di campo. (B) Elaborazione dei campioni. (C) Brevi fondamenti e flusso di lavoro per la preparazione del campione: 1. Fissaggio: per rafforzare e preservare la struttura del campione. 2. Disidratazione: il contenuto d'acqua dei campioni viene sostituito con etanolo. 3. Essiccazione del punto critico: la CO2 liquida sostituisce l'etanolo ed evapora. 4. Montaggio: campione visualizzato per l'analisi. 5. Rivestimento sputtering con oro: impedisce la carica del campione. 6. Imaging. Illustrazioni e foto di Mariana Barcoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Reagenti

NOTA: Tenere presente che le seguenti soluzioni devono essere preparate in anticipo.

  1. Preparare un tampone di cacodilato di sodio 0,2 M. Per questo, sciogliere 42,8 g di cacodilato di sodio in 800 ml di acqua distillata, mescolando fino alla dissoluzione e stabilizzando il pH a 7,2 (se necessario, regolare il pH con acido cloridrico). Portare il volume della soluzione a 1 L aggiungendo acqua distillata. Conservare la soluzione a 4 °C (per ~1 mese).
    ATTENZIONE: La glutaraldeide e la paraformaldeide sono tossiche e devono essere maneggiate all'interno di una cappa aspirante. Indossare sempre guanti in nitrile e occhiali protettivi durante la manipolazione di tali reagenti.
  2. Prepara il fissativo di Karnovsky (modificato da Karnovsky)47. Per questo, aggiungere 10 mL di soluzione acquosa di glutaraldeide al 25% e 10 mL di soluzione acquosa di paraformaldeide al 20% a 25 mL di tampone cacodilato di sodio 0,2 M e mescolare. Aggiungere 1 mL di cloruro di calcio 0,1 M (CaCl2) e portare il volume a 100 mL aggiungendo acqua distillata. Conservare la soluzione a 4 °C (per un massimo di 1 mese).
    ATTENZIONE: Il fissativo di Karnovsky è dannoso se inalato e può causare irritazione alla pelle e agli occhi. Pertanto, evitare di respirare i vapori, utilizzando solo all'aperto o in un'area ben ventilata. Indossare sempre guanti in nitrile e occhiali protettivi quando si maneggia la soluzione.
  3. Utilizzando etanolo assoluto (grado analitico), preparare soluzioni di etanolo al 30%, 50%, 70% e 90% in acqua distillata; È inoltre necessario il 100% di etanolo.

3. Fissazione del campione

NOTA: I fissativi induriscono e conservano i campioni, mantenendo inalterate le caratteristiche morfologiche. Le aldeidi (come la paraformaldeide e la glutaraldeide) sono fissativi non coagulanti di tipo reticolante, che inducono legami incrociati all'interno e tra le proteine e gli acidi nucleici48.

  1. Rimuovere le operaie, le uova, le pupe e le larve dai campioni del giardino utilizzando una pinza entomologica (Figura 2B). Mettere da parte i frammenti di giardino di dimensioni non superiori a 5 mm3. Aggiungere i frammenti in una provetta da 2 mL (Figura 2C).
  2. Alle provette contenenti i campioni, utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per aggiungere ~1 mL di soluzione fissativa Karnovsky (assicurarsi che il campione sia completamente coperto). Mescolare agitando delicatamente per aiutare il campione ad immergersi e incubare a 4 °C per almeno 24 ore prima di continuare il trattamento del campione (Figura 2C.1).
    NOTA: Quando le seguenti fasi di disidratazione non vengono eseguite immediatamente dopo la fissazione, il protocollo può essere messo in pausa in questa fase e i campioni possono essere conservati per ~1 anno a 4 °C.
    Si consiglia di utilizzare una pipetta in vetro Pasteur, poiché è composta da un materiale inerte ed è più facile da pulire per essere riutilizzata in seguito. Il materiale da giardino è altamente idrofobo, tendente a galleggiare sulla superficie della soluzione fissativa. Di solito ci vogliono fino a 5 minuti per essere completamente immersi nel fissativo. Assicurati che il fissativo copra i frammenti del giardino poiché il suo volume tende a ridursi man mano che entra nei pori del campione. Abbiamo verificato empiricamente che dopo che il campione è stato immerso e si è bagnato, i suoi componenti (in particolare, il delicato micelio fungino) sono diventati suscettibili di frantumarsi quando mescolati ulteriormente. Pertanto, si consiglia di evitare il più possibile di agitare i campioni.

4. Disidratazione del campione

NOTA: La serie di lavaggio dell'etanolo scambia gradualmente l'acqua nei campioni con etanolo. È importante iniziare con una soluzione di etanolo a bassa concentrazione (vedi sotto) per evitare di danneggiare eccessivamente o far collassare campioni così delicati49.

  1. Rimuovere completamente la soluzione fissativa di Karnovsky utilizzando una pipetta di vetro, facendo attenzione a non distruggere il campione (Figura 2C.1).
    NOTA: Scartare il fissativo di Karnovsky in un recipiente adeguatamente etichettato per la gestione dei residui chimici tossici.
  2. Subito dopo aver rimosso il fissativo, aggiungere 1 mL di etanolo al 30%, facendo attenzione a non disturbare il campione, e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (Figura 2C.2).
    NOTA: I campioni devono essere sempre immersi nella soluzione. Assicurarsi di sostituire rapidamente le soluzioni durante la serie di lavaggio graduale con etanolo. Poiché il giardino perde il suo aspetto poroso e si aggrega sul fondo della provetta, 1 mL di etanolo tende ad essere sufficiente per coprire il campione (quando il campione non è più grande di 5 mm3). Tuttavia, se i campioni non sono completamente coperti, aggiungere etanolo fino a coprire completamente il campione.
  3. Rimuovere completamente l'etanolo al 30% con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non disturbare il campione. Scartare correttamente l'etanolo al 30%.
    NOTA: Per l'intera serie di lavaggio graduale con etanolo, gettare l'etanolo in un recipiente adeguatamente etichettato per la gestione dei residui chimici tossici.
  4. Aggiungere 1 mL di etanolo al 50% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente l'etanolo al 50% con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non disturbare il campione. Scartare correttamente l'etanolo al 50%.
  5. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente l'etanolo al 70% con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non danneggiare il campione. Scartare correttamente l'etanolo al 70%.
    NOTA: Nella fase di lavaggio con etanolo al 70%, l'utente può mettere in pausa il protocollo, se necessario, poiché le provette del campione possono essere conservate durante la notte a 4 °C, quando il materiale non verrà immediatamente lavorato.
  6. Aggiungere 1 mL di etanolo al 90% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente l'etanolo al 90% con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non disturbare il campione. Scartare correttamente l'etanolo al 90%.
  7. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente l'etanolo al 100% con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non disturbare il campione. Scartare correttamente l'etanolo al 100%.
  8. Utilizzando una pinza e/o una spatola, trasferire con cura i campioni in contenitori per campioni per l'essiccatore a punto critico (CPD), contenenti etichette di identificazione del campione (realizzate in precedenza con carta e matita). Per evitare l'essiccazione dei campioni, questo trasferimento viene effettuato con il contenitore posto in una capsula di Petri ricoperta di etanolo al 100%.
  9. Mettere i coperchi sui contenitori e immergerli in un becher di vetro graduato contenente etanolo al 100% sufficiente per immergere i contenitori. Coprire il bicchiere di vetro e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente; Quindi scartare correttamente l'etanolo al 100%.
  10. Trasferire i contenitori dei campioni in un altro becher di vetro graduato contenente una quantità sufficiente di etanolo al 100% per immergere i contenitori. Coprire il bicchiere di vetro e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente; Quindi, trasferire i contenitori dei campioni nell'essiccatore del punto critico.
    NOTA: Dopo la serie di lavaggi, le pipette e i becher di vetro devono essere abbondantemente risciacquati con acqua distillata e l'acqua residua deve essere gettata in un recipiente adeguatamente etichettato per la gestione dei residui chimici tossici. Dopo il risciacquo, gli oggetti in vetro possono essere lavati con un detergente neutro, risciacquati con acqua di rubinetto e asciugati all'aria.

5. Essiccazione del punto critico

NOTA: Un essiccatore a punti critici sostituisce l'etanolo nei campioni con anidride carbonica liquida (CO2), che evapora dal campione a temperature e pressioni più elevate. Si prega di seguire le istruzioni del produttore per tali procedure.

  1. Accendere l'apparecchiatura.
  2. Aprire la camera, posizionare i contenitori dei campioni all'interno e aggiungere etanolo al 100% fino a coprire i contenitori. Chiudere la camera.
  3. Attivare l'opzione Freddo e attendere che la temperatura raggiunga i 10 °C.
  4. Aprire la valvola della bombola di CO2 e attivare l'opzione Agitatore .
  5. Attiva l'opzione CO2 in , controllando sempre la camera per verificare quanta CO2 l'ha già riempita. Quando la camera è quasi piena, disattivare l'opzione CO2 in e attivare l'opzione Scambio , mantenendola attivata fino a quando non c'è abbastanza CO2 solo per coprire i contenitori. Assicurarsi che i contenitori siano sempre coperti con CO2 (ad esempio, disattivare l'opzione Sostituisci prima che tutto il CO2 abbia lasciato la camera). Ripetere il passaggio 5.5 6 volte.
  6. Attivare la CO2 un'ultima volta e riempire la camera fino a coprire i contenitori.
  7. Attiva l'opzione Calore e disattiva l'opzione Agitatore . Chiudere la valvola della bombola di CO2.
  8. Attendere che la temperatura salga a 35 °C; quindi, attiva l'opzione Gas out .
    NOTA: A circa 30 °C, la camera raggiunge pressioni di 70-80 bar, raggiungendo il punto critico, dove il liquido scompare.
  9. Quando la pressione della camera raggiunge 1 bar, tutto il contenuto di gas è stato rimosso. Aprire la camera e rimuovere i contenitori.
  10. Spegnere l'apparecchiatura.

6. Montaggio

  1. Preparare i portacampioni SEM (ad esempio, tronchetti di alluminio; Figura 2C.4).
    1. Avvolgere i tronchetti con un foglio di alluminio, coprendo solo la parte superiore, per facilitare la pulizia dei tronchetti dopo l'analisi.
    2. Identificare i mozziconi scrivendo il codice/numero di campione sul fondo del supporto, garantendo l'identificazione di ciò che è posto sopra.
    3. Coprire la parte superiore con nastro biadesivo in carbonio. Posizionare i tronchetti in un portacampioni.
  2. Aprire il coperchio del contenitore del campione e trasferire con cura il campione essiccato in una capsula di Petri di vetro utilizzando una pinza e una spatola.
    NOTA: I giardini essiccati a punto critico tendono ad agglomerarsi formando campioni altamente impacchettati che devono essere accuratamente separati come frammenti di dimensioni non superiori a 1 mm3.
  3. Posiziona con cura i frammenti sulla superficie adesiva del mozzicone ricoperto di nastro adesivo. Una volta che il frammento di giardino tocca il nastro, è molto difficile (ri)spostarlo, quindi fai attenzione a non posizionarlo in luoghi o posizioni indesiderate. Aggiungi fino a nove frammenti per stub.
  4. Ripetere i passaggi 6.2 e 6.3 per ciascun campione.

7. Rivestimento sputtering con oro

NOTA: Il rivestimento del campione è necessario per impedirne la carica. Seguire le istruzioni del produttore per regolare impostazioni come la pressione del gas di funzionamento (0,5 × 10-1 mm Hg di pressione del gas in questo protocollo), il tempo di sputtering (220 s), lo spessore dello strato d'oro (~120 Å), la corrente (50 mA) e la tensione di alimentazione. Lo sputtering tende a seguire un flusso di lavoro comune, anche se le apparecchiature di produttori diversi possono funzionare in modo leggermente diverso.

  1. Aprire il braccio di mira incernierato e posizionare i tronchetti sul tavolo del campione.
  2. Chiudere il braccio di mira incernierato e controllare se il paraschegge della camera a vuoto in vetro è incorporato correttamente.
  3. Aprire la valvola della bombola di argon e accendere l'interruttore di alimentazione principale.
  4. Seguire l'aumento del vuoto sul display dell'apparecchiatura fino a raggiungere il segno di 0.5 × 10-1 mm Hg sul display; quindi, attiva il risciacquo. Ripetere l'operazione 5 volte.
  5. Accendere il sistema di circolazione dell'acqua, attivare l'opzione HV On e aprire il coperchio della pellicola d'oro. Conferma che il colore del plasma sia rosato. Per seguire questo protocollo, impostare 220 s di sputtering con una tensione di 50 mA, che depositerà uno strato d'oro di ~120 Å (12 nm).
  6. HV On si spegne automaticamente. Spegnere il sistema di circolazione dell'acqua e chiudere il coperchio della pellicola d'oro.
  7. Spegnere l'interruttore di alimentazione principale, consentendo all'aria di entrare nella camera a vuoto. Per campioni di giardino e rifiuti, ripetere i passaggi 7.1-7.7 3x.
    NOTA: Se l'imaging non avviene immediatamente dopo la preparazione del campione, conservare i tronchetti in un contenitore ermetico riempito con uno strato di silice per evitare di reidratare i campioni.

8. Imaging

NOTA: Seguire le istruzioni del produttore per regolare le impostazioni SEM, come il diametro dell'apertura dell'obiettivo, la tensione di esercizio, l'allineamento del sistema a fascio di elettroni, l'allineamento assiale e gli stigmatori.

  1. Posizionare i mozziconi nel supporto del campione, prendendo appunti sulla posizione di ciascun campione.
    NOTA: Indossare guanti quando si inserisce o si rimuove il supporto del campione e mantenerlo il più pulito possibile.
  2. Avviare il software operativo dal desktop.
  3. Selezionare le impostazioni dello strumento. Visualizzazione di campioni da giardino con diametro dell'apertura dell'obiettivo di 30 μm (cioè nel secondo stadio), funzionamento in alto vuoto, rilevamento di segnali da elettroni secondari (SED), tensione di accelerazione di 20 kV, distanza di lavoro di 15 - 20 mm, corrente della sonda di 40,0 (in modalità ad alta corrente) e variazione dell'ingrandimento in base al campione.
  4. Seguendo le istruzioni di navigazione, premere l'icona Vent e attendere che la camera del campione venga ventilata. Una barra di avanzamento indica lo stato del vuoto.
  5. Quando la pressione atmosferica è stata raggiunta, aprire la camera del campione e inserire con cautela il supporto del campione.
  6. Chiudere delicatamente lo sportello della camera e premere l'icona Evac per evacuare lo strumento, seguendo lo stato del vuoto attraverso la barra di avanzamento. Il sistema di navigazione mostrerà la posizione del tavolino in movimento e fornirà un grafico del supporto quando il trasloco è completato. Premere l'icona Fotocamera per registrare una foto del supporto per ottenere una vista dall'alto che aiuterà a navigare tra i campioni durante l'imaging.
  7. Premi l'icona Osservazione per accendere il cannone elettronico e attendi che si formi l'immagine. Utilizzare l'interfaccia utente manuale (controllo manuale) per spostare manualmente l'asse Z all'altezza corretta (in base all'altezza del campione e alla distanza di lavoro determinata).
    NOTA: Per prolungare la durata del filamento di tungsteno, mettere in pausa la funzione di osservazione ogni volta che non si esegue l'imaging attivo.
  8. Utilizzare le opzioni mostrate sullo schermo o il controllo manuale per modificare la velocità raster e la posizione dell'immagine. Sposta il tavolino per ottenere una visione completa del campione, utilizzando la funzione RDC per concentrarti su aree specifiche. Quando si osserva una struttura target (o interessante), regolare di conseguenza l'ingrandimento, la messa a fuoco, la luminosità, il contrasto e la stigmatizzazione . Correggere la stigmatizzazione utilizzando l'interfaccia utente manuale per spostare il tavolino nelle direzioni X e Y.
    1. Regola l'ingrandimento tra 100x e 700x per visualizzare gli aspetti generali del giardino (come la densità ifale, il substrato e i modelli di colonizzazione).
    2. Regola l'ingrandimento tra 700x e 1.500x per visualizzare i modelli spaziali del microbiota.
    3. Regola l'ingrandimento tra 1.500x e 3.000x per osservare le interazioni fisiche tra microbiota e biofilm.
    4. Regola l'ingrandimento tra 3.000x e 4.000x per concentrarti su specifici cluster microbici.
  9. Per salvare un'immagine, utilizzare la funzione Blocca , fare clic sull'icona Foto e impostare il percorso del file. Come standard, analizzare almeno tre frammenti di giardino, riprendendo ciascuno di essi in tutti gli intervalli di ingrandimento menzionati al punto 8.8. Ciò si traduce in almeno 12 immagini per campione, anche se un numero maggiore di immagini può supportare descrizioni più dettagliate. Suggeriamo che 15-25 immagini per campione, che vanno tutti gli ingrandimenti nel passaggio 8.8, tendano a fornire dettagli precisi per la descrizione del campione.
    NOTA: Il rastering e il salvataggio di un'immagine richiedono alcuni secondi, durante i quali è necessario evitare qualsiasi vibrazione sulla tavola mobile SEM.
  10. Dopo aver terminato l'imaging, premere l'opzione Sfiato per sfiatare la camera, seguendo lo stato del vuoto attraverso la barra di avanzamento. Rimuovere con cautela il supporto, chiudere delicatamente lo sportello della camera e premere Evac per evacuare la camera.
  11. Non appena l'evacuazione è completata, uscire dal software operativo.
  12. Regola la luminosità e il contrasto per migliorare la visualizzazione utilizzando un editor di immagini.

Risultati

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Qui, abbiamo presentato un protocollo semplificato per visualizzare i componenti del giardino di attine e i campioni di scarto, come ife fungine, substrato, microbiota e biofilm. Il SEM ha migliorato la nostra comprensione di come il giardino e i rifiuti impalcano i modelli strutturali del microbiota (Figura 3). Nei giardini attini, le ife fungine sono strutture simili a rami che coprono porzioni della superficie del substrato. Poiché le ife fungine tendono ad essere molto sensibili alla disidratazione e alla rottura, l'utente può essere guidato dall'aspetto delle ife per valutare i risultati della preparazione del campione. Come osservato anche nei lavori precedenti 32,33,45, le ife presentano un aspetto tubolare; ife intatte a forma di tubo indicano un'efficace preparazione del campione (Figura 3A e Figura 4C). Quando le ife sono a forma di nastro, tale appiattimento è probabilmente un artefatto della tecnica (Figura 4C).

Le superfici del substrato vegetale possono essere riconosciute dagli strati cuticolari ed epidermici, nonché dagli stomi e dai tricomi. Tali strutture sono più riconoscibili quando i substrati non sono ancora colonizzati dalle ife fungine e dal microbiota (Figura 3A e Figura 4C). Quando il substrato viene colonizzato, il microbiota e/o le ife fungine coprono la sua superficie in modo tale che le strutture vegetali specifiche non sono facilmente distinguibili (Figura 3A). Il microbiota può colonizzare le ife fungine o il substrato, ognuno di questi in un'organizzazione spaziale apparentemente distinta. Nella Figura 3, tali modelli spaziali sono stati illustrati schematicamente e inscatolati nelle rispettive immagini SEM dove sono stati identificati; ciò può facilitare il collegamento tra i risultati del SEM e la loro interpretazione.

I microbioti colonizzatori ifani sono meno comunemente osservati e, quando trovati, sono composti da bastoncelli o cellule coccoidi che si trovano isolati o in piccoli gruppi attaccati alla superficie ifale. Si può osservare una matrice esopolisaccaridica (EPS) di biofilm, che assomiglia a una struttura di "tessuto di pizzo", che circonda le ife in piccoli grumi (Figura 3A). Abbastanza più comune è il microbiota che colonizza il substrato, che si trova nei giardini di diverse specie di formiche attine. I modelli di colonizzazione sembrano definiti in una certa misura dalle fasi di deterioramento del substrato. Pertanto, durante la colonizzazione di substrati non ancora degradati, il microbiota può presentarsi come singole cellule o riunirsi in piccoli gruppi. Il microbiota può stratificare il substrato quando presenta segni microscopici di deterioramento (ad esempio, quando gli strati cuticolari/epidermici delle piante e altre strutture vegetali non sono distinguibili e i solchi e le rientranze sono abbondanti).

In questi "tappeti microbici", la morfologia delle cellule è più riconoscibile quando la matrice EPS è assente. Nei casi in cui le cellule microbiche sono incorporate nella matrice EPS, la loro morfologia non è facilmente distinguibile. In base alla loro organizzazione spaziale, abbiamo caratterizzato i biofilm come "diffusi" o come "tridimensionali". Quando il biofilm viene diffuso, le cellule microbiche e la matrice EPS coprono in modo intermittente la superficie del substrato, formando uno strato piatto dello spessore di 1-3 cellule (Figura 3B). Quando il biofilm è tridimensionale, le cellule microbiche e la matrice EPS si accumulano, formando cluster con spessori di diverse cellule. Le regioni giardino costituite da substrati deteriorati (come vecchi giardini e rifiuti) ospitano il microbiota nei suoi solchi e nelle sue rientranze, dove formano spesse comunità (Figura 3C). In particolare, i substrati ampiamente degradati nei campioni di rifiuti ospitano un microbiota abbondante, il più morfologicamente diversificato tra tutte le regioni. I lieviti aggiungono più complessità a questa comunità, interagendo fisicamente con i procarioti tramite biofilm. Nei campioni di scarto di Atta sexdens e Acromyrmex sp., le matrici EPS sono state osservate formare un cospicuo reticolo fibrillare che circonda procarioti a forma di bastoncino e coccoidi, nonché lieviti fusiformi e sferici (Figura 3C).

Risultante da una rete intrecciata di ife, la struttura spugnosa del giardino richiede un'ulteriore sputtering per rivestire il campione in modo più uniforme. Tali passaggi evitano la dispersione di elettroni che distorce l'immagine e ne ostacola la risoluzione (Figura 4A). Le fasi di preparazione dei campioni hanno preservato la maggior parte della struttura del giardino, svelando la distribuzione spaziale e l'organizzazione del microbiota. Vale la pena ribadire, però, che strutture come le ife fungine e la matrice EPS sono molto sensibili alla disidratazione e molto difficili da preservare, soprattutto per il SEM. La struttura ifali era relativamente ben conservata, ma è ragionevole considerare che il biofilm visualizzato in alcuni campioni di giardino potrebbe essere privo di alcuni componenti strutturali della matrice EPS. Sebbene lo strato più esterno liscio di polisaccaridi che racchiudeva il microbiota fosse conservato in alcuni campioni (Figura 3A, B), alcuni di essi avevano conservato le caratteristiche morfologiche del microbiota ma non avevano una matrice EPS. Tuttavia, non è chiaro se la matrice EPS fosse effettivamente assente o se sia stata rimossa durante la preparazione del campione.

Da un lato, la rimozione dello strato liscio del biofilm compromette la comprensione della struttura precisa del biofilm. D'altra parte, rivela la morfologia, l'organizzazione spaziale e le interazioni fisiche delle cellule che vivono sotto lo strato, che è il nostro principale obiettivo di ricerca. Studi precedenti hanno riportato la conservazione sia delle ife fungine che della matrice del biofilm impiegando il vapore di tetrossido di osmio (OsO4) come fissativo primario 44,50,51,52,53,54. Quindi, abbiamo condotto un esperimento comparativo fissando campioni di giardino fresco con vapore di OsO4, che apparentemente ha preservato l'aspetto liscio dei biofilm (Figura 4B). Questo metodo, tuttavia, ha causato un esteso appiattimento delle ife e del microbiota. Questo appiattimento ha comportato la perdita degli aspetti spaziali generali del giardino descritti in precedenza 29,33,32,45, limitando così ulteriori studi sui modelli strutturali del giardino. Il fissaggio con OsO4 ha reso difficile sia distinguere la morfologia e la distribuzione microbica sia differenziare le strutture cellulari dagli artefatti tecnici, complicando così l'interpretazione dei dati.

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Figura 3: Modelli architettonici del microbiota. Il microbiota colonizza le ife fungine e il substrato in un'organizzazione spaziale distinta. Tali pattern spaziali sono stati schematicamente illustrati e sono stati inscatolati nelle rispettive immagini SEM dove sono stati identificati (delimitati nella figura da quadrati bianchi): (A) I microbiota colonizzatori ifali sono composti da isolati o piccoli gruppi di cellule, con matrice esopolisaccaridica biofilm rilevabile in alcuni campioni. (B) Il microbiota che colonizza il substrato si diffonde in tutto il substrato, con la matrice EPS che copre le cellule in modo tale che la loro morfologia non sia facilmente distinguibile. (C) Microbiota che colonizza il substrato formando gruppi tridimensionali, costituenti biofilm mono o multimorfologici, in alcuni casi evidenziando la matrice EPS. Illustrazioni di Mariana Barcoto. Abbreviazione: EPS = matrice esopolisaccaridica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Imaging infruttuoso. Immagini di bassa qualità che restituiscono risultati inefficaci e/o ostacolano l'interpretazione dei modelli architettonici. (A) La diffusione di elettroni distorce l'immagine, ostacolandone la risoluzione e, di conseguenza, l'identificazione morfologica. Questo è stato osservato frequentemente nei campioni rivestiti con polverizzazione catodica solo una volta ed è stato ridotto da un rivestimento aggiuntivo. (B) Il fissaggio di campioni di giardino fresco con vapore di tetrossido di osmio (OsO4) come fissativo primario 44,50,51,52,53,54 ha apparentemente preservato l'aspetto liscio dei biofilm. Tuttavia, ha causato l'appiattimento esteso delle ife e del microbiota, danneggiando i modelli architettonici dei giardini. (C) La preparazione del campione con il fissativo di Karnovsky ha prodotto immagini di qualità superiore rispetto alle preparazioni con OsO4, preservando la maggior parte della struttura ifale, la distribuzione del microbiota e i modelli spaziali dei giardini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il SEM utilizza un fascio di elettroni per scansionare il campione, generando un'immagine ingrandita di esso in modo tale da poter visualizzare microstrutture tridimensionali ad alta risoluzione. Poiché il SEM funziona in alto vuoto, è necessaria la rimozione di fino a / più del 99% di acqua dai campioni. All'interno della camera a vuoto SEM, i campioni parzialmente idratati possono disidratarsi e collassare, oltre a disperdere elettroni. Per l'imaging ad alta risoluzione nel SEM, la preparazione del campione dovrebbe includere procedure per rimuovere l'acqua mantenendo al minimo le variazioni di volume e morfologia, nonché il rivestimento per prevenire la carica durante l'imaging 55,56,57.

In primo luogo, il campione viene fissato chimicamente reticolando le sue proteine e gli acidi nucleici, ottenendo con diverse tecniche. Un metodo ampiamente utilizzato prevede la combinazione di glutaraldeide e formaldeide (o paraformaldeide) in un tampone, come la piperazina-1,4-bis [acido 2-etansolfonico] (PIPES); acido N-[2-idrossietil]-piperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES); soluzione salina tamponata con fosfato (PBS); o cacodilato di sodio. La fissazione chimica rafforza il campione, preservandone la struttura per l'essiccazione. A seconda della loro natura, i campioni possono richiedere una fissazione secondaria (nel tetrossido di osmio) e persino una fissazione terziaria (nell'acetato di uranile). In secondo luogo, i campioni devono essere disidratati. Poiché l'essiccazione all'aria provoca un ampio collasso delle strutture fini, una tecnica alternativa comune è l'essiccazione dei punti critici (CPD). Nella CPD, il campione non viene sottoposto a tensione superficiale, impedendo la formazione di artefatti. Da un lato, l'acqua raggiunge il punto critico a 228,5 bar e 374 °C, il che distruggerebbe facilmente il campione. D'altra parte, il punto critico di CO2 è di 73,8 bar e 31 °C, giustificandone l'uso come fluido di transizione. All'aumentare della temperatura, la CO2 viene convertita in forma gassosa e rimossa dal campione 58,59,60,61,62,63. In terzo luogo, i campioni non conduttivi dovrebbero essere rivestiti per prevenire la loro carica e aumentare la resa di elettroni secondari, che di conseguenza contribuisce a ottenere segnali di immagine nitidi64.

Il protocollo qui presentato combina le procedure per la conservazione dei campioni fungini 32,33,45,65,66,67,68 e dei biofilm 69,70, semplificando il processo rimuovendo le fasi di postfissazione e riducendo il tempo di disidratazione. Tuttavia, ha preservato la delicata struttura del giardino, dettagliando ulteriormente le interazioni fisiche del microbiota e svelando la struttura spaziale del biofilm. L'assemblaggio spaziale del microbiota è essenziale sia per stabilire le interazioni che per impostare i loro modelli regolatori. La distribuzione spaziale modella le dinamiche sociali microbiche, da cui possono emergere proprietà intrinseche. Questi sono necessari per affrontare la variabilità e la complessità affrontate negli ecosistemi microbici 71,72,73. I nostri risultati rafforzano il microbiota che integra i modelli strutturali del giardino, supportando la loro presunta partecipazione alle risposte fisiologiche 32,42,43,44. Abbiamo fornito la prova in situ che i biofilm sono rilevanti per le interazioni microbiche nella fungicoltura attinica42,44. I biofilm sono sistemi multicellulari complessi ed eterogenei, in cui i microrganismi incorporati in una matrice EPS autosecreta formano reti sociali. In modo cooperativo e/o antagonistico, le interazioni all'interno del biofilm determinano l'apertura, l'occupazione e la modifica delle nicchie 71,72,73,74. Il SEM ha permesso di comprendere ulteriormente l'organizzazione spaziale del microbiota nelle regioni del giardino, dettagliando le interazioni fisiche microbiota-substrato e microbiota-ife, semplificando al contempo i metodi per la ricerca futura in questo settore.

La ricerca sul microbiota del giardino sta ricevendo un'attenzione crescente, in particolare, concentrandosi sui processi che potrebbero modellare la composizione di queste comunità uniche75,76, nonché la loro funzione e interazioni 42,43,44. Le interazioni batterio-fungine tra le colture potrebbero aiutare il fungo a solubilizzare il fosfato, produrre siderofori e degradare la cellulosa e la chitina. Tali interazioni, che potrebbero verificarsi come un continuum mutualismo-antagonismo, potrebbero regolare il funzionamento del giardino44. L'approccio metodologico qui presentato consente di gettare uno sguardo, in situ, alla dimensione strutturale in cui potrebbero avvenire le interazioni. Sottolinea che, come la maggior parte degli ecosistemi microbici già studiati, i giardini attini sono modellati, organizzati in modo eterogeneo nello spazio 5,7,8. Il SEM ha già fornito una prospettiva spaziale in situ sulle dinamiche del microbiota in diverse comunità associate all'ospite, come cianospugne77, pelle di megattera78, funghi66, cnidari79, intestino umano80, licheni81, contribuendo anche alla descrizione della plastisfero (un nuovo ecosistema di derivazione antropogenica)82. Ciascuno di questi studi, tuttavia, ha impiegato un metodo graduale leggermente distinto per la preparazione del campione.

I campioni di giardino sono molto delicati ed eterogenei, con ife fungine che si ritiene siano adattate per non perdere acqua26, oltre a una serie diversificata di substrati incorporati24, il microbiota e il suo biofilm. Tuttavia, il protocollo di preparazione dei campioni che abbiamo adattato ha preservato la maggior parte di tali strutture e ci ha permesso di espandere la caratterizzazione della struttura spaziale del microbiota. Riteniamo che la fissazione con la soluzione di Karnovsky sia il passaggio critico del protocollo, poiché l'aspetto tridimensionale di un campione così delicato può collassare e/o appiattirsi a questo punto. I campioni complessi a base di funghi vengono solitamente preparati per il SEM fissando con glutaraldeide e postfissando con OsO4 65,66,67,68. La combinazione di aldeidi (paraformaldeide e glutaraldeide), tuttavia, è stata segnalata per migliorare la conservazione del biofilm per SEM69,70. I metodi per conservare i biofilm possono anche includere lo 0,15% di blu di alcia o lo 0,15% di rosso rutenio per il fissativo iniziale di Karnovsky, nonché l'1% di acido tannico e l'1% di osmio per la postfissazione. Fissaggio di giardini e rifiuti con quelli di Karnovsky e postfissaggio con batteri conservati OsO4 in vecchi campioni di giardino e rifiuti, anche se non evidenziano il biofilm32. Poiché i nostri campioni avevano la struttura del giardino, il microbiota e i biofilm conservati senza la fase di postfissazione dell'osmio impiegata nei precedenti protocolli 32,33,69,70, abbiamo preferito semplificare il protocollo rimuovendo questa fase. OsO4 è un agente ossidante utilizzato per fissare (specialmente) i componenti delle cellule lipidiche83. Poiché è altamente corrosivo, OsO4 può causare gravi ustioni a contatto con la pelle e le mucose, oltre a danneggiare il tratto respiratorio o gastrointestinale se inalato o ingerito84,85. Rimuovendo la post-fissazione di OsO4, il protocollo riduce di conseguenza il numero di reggenti tossici da manipolare.

Suggeriamo anche la serie di lavaggio con etanolo invece di utilizzare l'acetone, che potrebbe essere troppo aggressivo per campioni delicati86. La serie di lavaggio dell'etanolo con passi lunghi 10 minuti semplifica anche i precedenti protocolli SEM45 senza ostacolare la risoluzione dell'immagine. Inoltre, abbiamo verificato empiricamente che ulteriori passaggi di sputtering hanno prodotto immagini di qualità superiore, il che era coerente per i campioni di giardino di tutte le specie che abbiamo testato. Tali passaggi aggiuntivi potrebbero rivestire i campioni in modo più uniforme, poiché la diffusione degli elettroni era molto più frequente nei campioni rivestiti una sola volta (Figura 4A). Pertanto, incoraggiamo il lavoro futuro di test di additivi e condizioni che potrebbero migliorare il protocollo per la visualizzazione del biofilm nei campioni di giardino.

Il SEM è un potente strumento per dettagliare la morfologia cellulare del microbiota e la disposizione spaziale dell'EPS nelle superfici, rivelando la topografia e la consistenza dei campioni di giardino in alta risoluzione e ingrandimento70,87. Tuttavia, non fornisce una discriminazione tassonomica per i membri della comunità e, di conseguenza, non abbiamo una distinzione di chi è dove. Inoltre, nonostante l'elevata profondità focale del SEM, non fornisce informazioni sulle caratteristiche tridimensionali del campione. Per una descrizione completa del giardino microbico attinomico, compresa la biogeografia tassonomica e la risoluzione spaziale tridimensionale, l'analisi SEM potrebbe essere considerata una prima procedura nelle tecniche di imaging graduale per campioni di giardino. Per la risoluzione tassonomica, il SEM potrebbe essere accoppiato con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)88,89 e le sue varianti, come la FISH ad alta risoluzione filogenetica (HiPR-FISH)90, la marcatura combinatoria e l'imaging spettrale FISH (CLASI-FISH)9,91 e le proiezioni 3D92. L'analisi della microstruttura tridimensionale potrebbe essere ulteriormente dettagliata mediante microtomografia a raggi X (μCT a raggi X)93. Finora, il SEM ci ha permesso di osservare in dettaglio l'organizzazione spaziale del microbiota che circonda le ife e nella superficie del substrato, nei solchi e nelle rientranze. Tale patterning microbico sta costruendo la nostra conoscenza delle presunte interazioni microbiche nei giardini di attine. Riteniamo che le fasi di preparazione che abbiamo presentato potrebbero essere ampiamente applicate per perfezionare gli studi sull'organizzazione spaziale microbica in altri delicati ecosistemi microbici.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) per il sostegno finanziario (Grant #2019/03746-0). MOB ringrazia per la borsa di dottorato ricevuta da FAPESP (processo 2021/08013-0) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasile (CAPES) - Codice finanziario 001. AR ringrazia anche il Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) per una borsa di ricerca (#305269/2018). Gli autori ringraziano Marcia Regina de Moura Aouada e Antonio Teruyoshi Yabuki per l'aiuto nei test pilota per la preparazione del campione, Renato Barbosa Salaroli per l'assistenza tecnica e Enzo Sorrentino per l'aiuto nello shooting fotografico. Questo studio è stato condotto nell'ambito dell'autorizzazione all'accesso al patrimonio genetico # SISGen AA39A6D.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da 2 mLAxygenMCT-200-C-BRAPer fissare e disidratare i campioni
Cloruro di calcio anidroMerckC4901CaCl2 anidro per preparare Karnovsky' s fissativo
Essiccatore per punti criticiLeicaEM CPD 300Per l'essiccazione dei punti critici
Nastro biadesivo conduttivo in carbonio, 12 mm (L) X 5 M (L)Microscopia elettronica Scienze77819-12Per il montaggio di campioni
Pinze entomologicheNessun fornitorePer manipolare campioni da giardino
Alcool etilico (=etanolo), puro (≥ 99,5%)Sigma-Aldrich459836Per la disidratazione
PinzeNessun fornitorePer manipolare campioni da giardino
Bicchiere di vetroNessun fornitorePer la disidratazione
Piastra di Petri in vetroNessun fornitorePer manipolare campioni da giardino
Pipetta in vetroNessun fornitorePer fissare e disidratare i campioni
Glutaraldeide (Glutaraldeide acquosa EM Grado 25%)Scienze della microscopia elettronica16220Per preparare Karnovsky' s fissativo
Obiettivo dell'oro Ted Pella, Inc.8071Per spruzzare con oro
Acido cloridricoSigma-Aldrich320331Per regolare le soluzioni pH
Editor di immaginiPhotoshopqualsiasi versionePer regolare le immagini
Paraformaldeide (Paraformaldeide 20% Soluzione acquosa Grado EM)Microscopia elettronica Scienze15713Per preparare Karnovsky' s fissativo
Destinatario di propileneNessun fornitorePer il mantenimento in vita di colonie di formiche
Microscopio elettronico a scansioneJEOL IT300 SEMPer l'imaging del campione 
Cacodilato di sodio triidratoSigma-AldrichC0250Per la preparazione di tampone di cacodilato di sodio
SpatolaNessun fornitorePer manipolare campioni da giardino
Contenitori per campioni con diametro 15 mm x 10 mm di altezzaTed Pella, Inc.4591Per l'essiccazione del punto critico
Sputter coaterBaltec SCD 050Per rivestire con oro
Stub (montaggio in alluminio, perno a estremità piatta) 12,7 mm x 8 mm Microscopia elettronica Sciences75520Per il montaggio di campioni
specifico specifico specifico specifico specifico specifico specifico

Riferimenti

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