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Articolo metodologico

Separazione di strati di granulosi e cellule di teca del follicolo preovulatorio aviario per applicazioni a valle

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DOI:

10.3791/67344

⸱

25 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1Department of Animal & Food Sciences, University of Delaware, 2Departments of Animal & Food Sciences, Biological Sciences, Medical & Molecular Sciences, and Microbiology Graduate Program, University of Delaware

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per separare il tuorlo, le cellule della granulosa e le cellule della teca nei follicoli preovulatori aviari. Questa manipolazione di precisione consente indagini critiche sul ruolo di questi strati nella funzione riproduttiva, aiutando la comprensione dello sviluppo follicolare, della regolazione ormonale e della ricerca sulle malattie per migliorare la resa agricola e le intuizioni biomediche.

Abstract

Le galline ovaiole (galline ovaiole) e i polli da carne (riproduttori di polli da carne) sono fondamentali per l'approvvigionamento alimentare mondiale come fonte affidabile di proteine. Sono anche un modello animale emergente per lo studio delle malattie riproduttive umane. Con lo sviluppo del campo della ricerca avicola, la salute e la funzione dell'ovaio riproduttore di galline ovaiole e polli da carne saranno un importante punto di studio sia per i ricercatori agricoli che per quelli biomedici. Una delle sfide presentate da questo interesse emergente è la necessità di tecniche replicabili che tutti i ricercatori possano impiegare nella raccolta di campioni ovarici. In particolare, è necessario stabilire un processo visivo dettagliato per definire la corretta separazione degli strati specializzati di granulosa e cellule della teca dai follicoli di gallina per ottenere accordo e coerenza tra i ricercatori.

Questo studio descrive l'estrazione dei follicoli preovulatori e del tessuto ovarico in galline bianche livornesi in età riproduttiva. La separazione di questi follicoli viene eseguita in condizioni fredde e liquide per congelare il tuorlo per una più facile manipolazione e per evitare che il peso del follicolo strappi gli strati cellulari durante il processo di separazione. Una volta completata la separazione, gli strati cellulari desiderati possono essere ulteriormente digeriti per approcci di coltura tissutale o possono essere crioconservati per analisi genomiche e proteomiche.

Introduzione

I polli produttori di uova sono una componente chiave della catena di approvvigionamento alimentare mondiale e sono un modello animale in evoluzione per lo studio della fertilità e del cancro ovarico. Il pollo ha una lunga storia di uso di laboratorio, dagli studi sugli ovuli sui vaccini antinfluenzali1 allo studio della crescita tumoralecancerosa 2, ed è un animale chiave per la comprensione dello sviluppo delle gonadi 3,4,5. Comprendere il ruolo del sistema riproduttivo di una gallina, in particolare, la natura ciclica dello sviluppo follicolare ovarico e i tipi di cellule coinvolte, è un'area di grande interesse e potenziale applicazione. Gli approcci multi-omici per interrogare l'ovaio della gallina hanno applicazioni per aumentare la resa agricola attraverso l'analisi della produttività e chiarire i fattori per la salute umana attraverso la gallina come modello per la malattia riproduttiva.

L'ovaio aviario ha stadi follicolari di sviluppo molto distinti composti da (1) piccoli follicoli primordiali e primari (>1 mm), (2) follicoli pre-reclutamento di dimensioni variabili (da bianco a giallo pallido, 2-8 mm) e (3) grandi follicoli preovulatori riempiti di tuorlo (giallo) (Figura 1)5,6,7. Un'ovaia aviaria sessualmente matura è composta da una corteccia esterna che ospita i follicoli ovarici e il midollo interno composto da muscolatura liscia, nervi e vascolarizzazione8. L'intero ciclo dello sviluppo follicolare si svolge nella corteccia. Tuttavia, è solo a circa cinque mesi di età che solo l'ovaio sinistro dimostra una completa gerarchia di sviluppo dei follicoli preovulatori (cioè gialli), e la gallina subirà la sua prima ovulazione e ovideposizione (deposizione delle uova). I follicoli preovulatori stabiliscono una gerarchia grossolanamente visibile di circa 5-6 follicoli che vanno dal più grande e vicino all'ovulazione - follicolo F1 - al follicolo meno sviluppato e più piccolo - F5 o F6. I follicoli preovulatori sono facilmente distinguibili dai follicoli più piccoli pre-reclutamento a causa delle loro dimensioni maggiori, dell'ampia innervazione e del tuorlo giallo intenso.

Tutti i follicoli contengono tipi di cellule specializzate che supportano vari ruoli nella segnalazione, nella crescita e nello sviluppo del follicolo mentre progredisce attraverso diverse fasi prima dell'ovulazione: queste sono le cellule della granulosa, le cellule della teca e gli ovociti (gameti femminili) (Figura 2A). In particolare, gli strati cellulari della granulosa creano la parete interna del follicolo e le cellule della teca formano l'altra parete che circonda l'ovocita. Man mano che un follicolo progredisce attraverso la gerarchia preovulatoria, gli strati cellulari della teca e della granulosa iniziano ad assottigliarsi, in particolare lungo un punto direttamente di fronte al gambo del follicolo preovulatorio. Il gambo è il punto di attacco del follicolo all'ovaio (Figura 2B). Questa linea degli strati della granulosa e della teca di fronte al gambo è chiamata stigma (Figura 2C). Manca completamente di vascolarizzazione e sarà il punto di rottura follicolare durante l'ovulazione di un follicolo F1. È visibile anche il disco germinale, ovvero il soffice strato bianco di cellule di supporto che circondano l'ovocita (Figura 2B).

Sia le cellule della granulosa che quelle della teca sono componenti chiave dello sviluppo del follicolo in quanto circondano e sostengono l'ovocita attraverso una complessa segnalazione ormonale. Lo strato cellulare della granulosa supporta le vie steroidogeniche tramite la segnalazione ciclica dell'AMP (cAMP) per determinare la produzione di progesterone 9,10,11. Le cellule della teca, d'altra parte, producono temporalmente estradiolo, che è in gran parte diverso rispetto ai mammiferi le cui cellule della teca producono androgeni e progesterone 12,13,14. Prese insieme alla segnalazione esterna, le cellule della granulosa e della teca sono fattori cruciali nella maturazione dei follicoli e nella deposizione delle uova. La tecnica di separazione degli strati di granulosa e teca è stata originariamente riportata da Gilbert et al. nel 197715. Ottenere una separazione completa degli strati di granulosa e teca e garantire che non rimanga materiale granuloso può presentare difficoltà con il metodo Gilbert. Inoltre, l'assenza di una chiara guida visiva per completare la separazione può rendere l'attività difficile da svolgere. Questo studio mira a descrivere l'estrazione e la separazione di strati di granulosa, teca e ovociti dai follicoli preovulatori, offrendo adattamenti e fornendo una chiara rappresentazione visiva attraverso l'uso di immagini e video (Figura 3). La visualizzazione di questa tecnica consentirà agli scienziati che studiano i follicoli ovarici aviari di catturare in modo riproducibile gli strati di granulosa e teca per approcci multi-omici sia agricoli che biomedici.

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Protocollo

Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati mantenuti e soppressi secondo il protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Delaware (Protocollo IACUC 110R).

1. Preparazione

  1. Sterilizzazione
    1. Autoclave di ciotole di vetro da 5 once utilizzando l'autoclave a spostamento di gravità (121 °C per 20 minuti) coperte con un foglio di alluminio con nastro adesivo per autoclave in cima per mantenere e indicare la sterilità.
      NOTA: Sarà necessaria una ciotola per ogni follicolo su cui viene eseguita la separazione.
    2. Strumenti di dissezione in autoclave con autoclave a spostamento per gravità (121 °C per 20 min), tra cui forbici, pinze curve e pinze diritte in buste di sterilizzazione.
  2. Allestimento dell'area di separazione
    1. Impostare l'area di separazione dei follicoli come mostrato nella Figura 4. Riempire i contenitori di contenimento con ghiaccio appena prima della separazione dei follicoli e rabboccare se necessario durante il processo di separazione dei follicoli.
  3. Soluzioni
    1. Diluire a 10x la concentrazione di PBS fino a 1x il materiale di lavoro e porre in frigorifero a +4 °C il giorno prima della dissezione.
    2. Diluire l'isopropanolo al 70% della concentrazione del materiale di lavoro nel flacone spray.

2. Dissezione

  1. Eutanasia di una femmina di uccello sessualmente matura.
    1. Scegli un uccello femmina sessualmente maturo (deve attualmente deporre le uova) e sopprimi16 anni con un metodo approvato (linee guida AVMA) secondo il protocollo di cura e utilizzo istituzionale, come la lussazione cervicale.
    2. Per la cattura del follicolo F1 più grande, sopprimere l'animale entro le prime 4 ore di insorgenza della luce per la giornata. Palpare il basso addome prima dell'eutanasia per confermare la presenza di un uovo con guscio duro nell'utero; Ciò garantisce che l'ovideposizione e, quindi, la prossima ovulazione non siano ancora avvenute.
  2. Accedi all'ovaio.
    1. Spruzzare la carcassa esterna e le piume con isopropanolo al 70%. Questo inumidisce le piume e pulisce il punto di incisione.
    2. Usando le forbici da dissezione e una mano guantata, pizzica e taglia una singola incisione orizzontale (trasversale) sulla linea mediana lunga circa 7,5 cm (3 pollici). Pizzica la pelle, i muscoli e gli strati di grasso prima dell'incisione per evitare la perforazione degli organi.
    3. Allargare l'incisione lateralmente sul lato destro dell'uccello e sondare con le dita guantate per spingere gli organi viscerali fuori dalla traiettoria delle forbici. Continuare fino a quando 2-3 costole dell'animale sono state tagliate sul lato destro.
    4. Allarga l'incisione verso il lato sinistro dell'uccello come fatto a destra. Procedi con maggiore cautela poiché i follicoli preovulatori dell'ovaio si trovano qui, sporgono dalla superficie dell'ovaio e possono rompersi facilmente. Usa una leggera pressione con le dita per tenere i follicoli preovulatori lontani dalle forbici mentre 2-3 costole vengono tagliate sul lato sinistro dell'uccello.
    5. Posizionare saldamente una mano sul basso addome dell'uccello e l'altra saldamente sul lato inferiore dello sterno e ritrarre manualmente il petto dell'uccello verso l'alto per consentire un ulteriore accesso alla cavità celomica dell'uccello.
    6. Tenendo ciascuna delle cosce dell'uccello vicino all'articolazione del garretto, spingile manualmente all'indietro per dislocare entrambe le articolazioni dell'anca contemporaneamente. Ora c'è un accesso completo all'ovaio sia visivamente che spazialmente.
  3. Rimuovere i follicoli preovulatori.
    1. Esegui tutti i passaggi con la vista visiva di routine. Se un individuo ha difficoltà a visualizzare in qualsiasi fase, utilizzare un microscopio da dissezione.
    2. Usando solo le dita guantate, afferra delicatamente ogni follicolo preovulatorio giallo visibile ed estrailo dall'ovaio. Pizzicare il gambo solo durante l'estrazione per facilitare la recisione del gambo. Non pizzicare il follicolo stesso, altrimenti potrebbe rompersi.
    3. Metti ogni follicolo nel contenitore sterile con PBS ghiacciato.
    4. Lasciare i follicoli preovulatori sul ghiaccio per almeno 5 minuti per consentire la coagulazione del tuorlo. Il tuorlo caldo aderirà agli strati di cellule follicolari circostanti, rendendo difficile l'esecuzione delle successive tecniche di separazione.

3. Separazione in laboratorio

  1. Prendi un follicolo isolato dal contenitore sterile e rimetti il contenitore con i follicoli rimanenti sul ghiaccio. Studiare il follicolo prima della manipolazione, prendendo nota della posizione di tre caratteristiche: il gambo, lo stigma e il disco germinale (Figura 2).
  2. Inizia rimuovendo la sierosa dalla superficie follicolare. Arrotolare delicatamente il follicolo su un tovagliolo di carta asciutto per rimuovere lo strato sierosa, tirandolo via delicatamente se necessario.
  3. Tieni il follicolo per il gambo sopra la ciotola piena di PBS. Usa la gravità per visualizzare dove finisce il gambo sulla superficie del follicolo e, usando le forbici, taglia solo il gambo senza perforare la superficie del follicolo. Proseguire con la rimozione della sierosa fino a quando non sarà più visibile.
  4. Utilizzando la lightbox per illuminare e il disco germinale come riferimento, riposizionare lo stigma sul lato opposto e tenere delicatamente il follicolo con il lato dello stigma visibile. Tieni il follicolo direttamente sopra la ciotola di PBS ghiacciato.
  5. Raccogli il bisturi, affettalo delicatamente lungo la lunghezza dello stigma e lascia cadere immediatamente il follicolo nel PBS quando il tuorlo inizia a cadere. Non tenere stretto il follicolo, in quanto ciò spingerà fuori il tuorlo invece di lasciarlo semplicemente cadere per gravità.
  6. Usando un paio di pinze per tessuti dritte e non dentate, staccare delicatamente lo strato rosa della parete follicolare dal tuorlo su un lato della fetta. Completa questa estrazione con piccoli movimenti di pizzicamento e trazione che sollevano la parete del follicolo dal tuorlo.
  7. La separazione degli strati funziona meglio quando circa 5 mm di tessuto della parete follicolare sono stati retratti dal tuorlo alla volta. Quando una sezione di 5 mm della parete follicolare viene retratta con successo dal tuorlo, utilizzare una pinza angolata in tandem con la pinza diritta per sondare lungo il guscio del follicolo.
  8. In alcuni casi, lo strato della granulosa può essere più strettamente associato al tuorlo rispetto allo strato della teca. In questa situazione, è sufficiente sondare molto delicatamente la superficie del tuorlo utilizzando una delle due pinze per cercare di estrarre lo strato simile a carta velina dal tuorlo. Una volta individuato lo strato di granulosa, pizzicarlo saldamente sullo strato di teca e procedere con l'estrazione di entrambi gli strati dal tuorlo come descritto in precedenza.
  9. Usa la pinza curva per spazzolare leggermente il tuorlo lontano dagli strati pizzicati. Spazzare via o rimuovere il tuorlo in eccesso dalla ciotola. Non raschiare lo strato di granulosa; Ciò causerà strappi. I movimenti vigorosi offuscheranno la soluzione PBS e ridurranno la visualizzazione. Procedi con movimenti attenti e deliberati.
  10. Dopo che ogni sezione di 5-10 mm di parete follicolare è stata retratta, fermarsi per prendere gli strati di teca e granulosa in ogni serie di pinze e assicurarsi che i due strati vengano staccati l'uno dall'altro gradualmente, proprio come entrambi vengono staccati dal tuorlo. Continua questo processo intorno all'esterno del follicolo. Se la manipolazione diventa difficile a causa del lembo dello strato di granulosa-teca, girare il follicolo per iniziare il processo dall'altro lato della fetta.
  11. Durante il processo di separazione, si incontrerà il disco germinale (gamete femminile e vescicola germinale). Si tratta di un'area estremamente aderente sia allo strato di granulosa che al tuorlo. Avvicinarsi al disco germinale con cautela, utilizzando le pinze diritte per tenere saldamente lo strato di granulosa allo strato di teca, poiché le pinze curve vengono utilizzate con leggeri movimenti di spazzolatura per spingere il disco germinale lontano dalle cellule della granulosa sulla superficie del tuorlo.
    1. Se si desidera utilizzare il disco germinale come campione di ricerca, spazzolare via il tuorlo a questo punto con una pinza angolata e conservare a piacere.
  12. Continuare a separare il tuorlo dalla parete follicolare con la pinza curva fino a quando l'intera sfera del follicolo non ha subito la rimozione del tuorlo.
  13. Una volta che il resto del tuorlo è stato spazzolato dagli strati, separare l'ultima porzione dello strato di granulosa dallo strato di teca. Lo strato di granulosa completamente separato potrebbe non essere completamente privo di tuorlo, ma assicurati che non ne sia rivestito. Posizionare lo strato di granulosa e lo strato di tecale in contenitori separati con temperatura di 4 °C PBS.
    1. Una volta che lo strato di granulosa si trova in un contenitore separato dallo strato di teca, agitare delicatamente lo strato di teca avanti e indietro nel PBS con una pinza per assicurarsi che eventuali resti rimanenti dello strato di granulosa si stacchino.
      NOTA: Alcuni metodi di lavorazione dopo la separazione possono tenere conto della rimozione dei detriti lipidici mediante digestione o centrifugazione, a seconda dello studio desiderato.
    2. Quando si pratica per la prima volta questa tecnica, preparare e analizzare istologicamente campioni separati rappresentativi per confermare un'accurata separazione e raccolta degli strati.
      1. Per fare ciò, fissare porzioni di tessuti separati in formalina tamponata neutra utilizzando cassette di tessuto a rete o spugne per prevenire la perdita del campione, quindi incorporare in paraffina, sezionare e colorare la sezione con ematossilina ed eosina (H&E).
      2. A causa della sua natura delicata, maneggiare con cura e posizionare lo strato di granulosa su spugne per biopsia in una cassetta istologica per garantire che lo strato cellulare rimanga intatto.
      3. Posizionare lo strato di teca direttamente all'interno di una cassetta istologica. In questo modo sarà anche possibile visualizzare il livello di contaminazione del campione da parte di altro tessuto follicolare (ad esempio, campione di strato cellulare della granulosa con adesione di proteina del tuorlo o cellule tecali).
        NOTA: Potrebbe non essere sempre possibile ottenere un solo strato di interesse a causa della stretta associazione dei tessuti follicolari. Tuttavia, conoscere il livello di possibile contaminazione può informare l'interpretazione dei successivi approcci multi-omici.

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Risultati

Questo protocollo consente la separazione degli strati di granulosa e cellule tecali dal follicolo ovarico (Figura 5 e Figura 6). Questi strati possono quindi essere preparati per l'esame istologico per confermare l'avvenuta separazione. Queste immagini istologiche, esaminate e acquisite da un patologo veterinario certificato (EMB), dimostrano chiaramente l'efficace separazione degli strati di granulosa e teca per i follicoli preovulatori F1 e F5 (

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Discussione

Questo studio delinea la procedura per la separazione distinta degli strati di cellule granulose e tecali dai follicoli preovulatori nel pollame. A differenza del metodo esistente stabilito da Gilbert et al. nel 1977, gli adattamenti apportati con questo metodo consentono un ambiente più controllato quando si separa manualmente lo strato cellulare della granulosa dallo strato della teca da tutti i follicoli preovulatori15. Inoltre, consente ai ricercatori di visua...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da segnalare.

Ringraziamenti

Siamo grati a Milos Markis (AviServe) per l'assistenza nella zootecnia, Nicole Guarino (Università del Delaware) per l'assistenza nella preparazione del manoscritto, Evelyn Weaver e Ramesh Ramachandran (The Pennsylvania State University) per l'assistenza nella dimostrazione della procedura e nella preparazione del manoscritto. La Figura 2A e la Figura 3 sono state create utilizzando BioRender.com utilizzando una licenza istituzionale sponsorizzata dall'Ufficio di ricerca dell'Università del Delaware. Questo lavoro è stato supportato dal Laboratorio di Patologia Comparata UD CANR. KME è supportato dalla sovvenzione USDA NIFA 2023-67011-40333. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della University of Delaware Research Foundation (UDRF) e del programma Delaware INBRE (sostenuto da una sovvenzione del National Institute of General Medical Sciences - NIGMS P20 GM103446 del National Institutes of Health e dello Stato del Delaware) ad AD.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3,5 pollici Piccole ciotole di vetro, 5 onceAmazonB0BXP5PJTNCiotole di vetro autoclavabili di almeno 3,5 pollici di diametro Foglio di
alluminioCostco720Copri ciotole per autoclave
Amazon Cuscinetti per l'addestramento degli animali domestici, regolari, 100 conteggiAmazonB0B58WTPFSPer l'uso come tamponi necrospia, qualsiasi tampone assorbente funzionerà
Nastro per autoclaveFisherbrand15-901-111
Cole-Parmer Illuminatori a fibre ottiche a LED Cole-ParmerEW-41723-02
Pinze a punta di precisione curve molto finiFisherbrand16-100-123
Microscopio da dissezione non seghettatoLeica S6E
Fisherbrand12-000-155non seghettate
con coperchio Set di 17 Congelatore per microonde trasparente/verde Lavabile in lavastoviglieAmazonB09QGZCRDBUtilizzare qualsiasi contenitore in grado di contenere ghiaccio E una piccola ciotola di vetro da 3,5 pollici
Pinzette/pinze a punta molto fine curve ad alta precisione a 45 gradi e affusolateFisherbrand12-000-125Non seghettate
Pinzette/pinze a punta molto fine diritte ad alta precisioneFisherbrand16-100-120Isopropanolo non seghettato
 FisherbrandA426P-4
McKesson Contenitore per campioni, sterile, tappo a vite, resistente alle perdite, 120 mLMcKesson16-95264 oz. / 120 cc,
soluzione salina graduata tamponata con fosfato (PBS, 10x), pH 7,6ThermoFisherJ62692. K7dovrà essere trasformato in 1x
flacone sprayCole-ParmerEW-06091-0170% di isopropanolo
#22Cincinnati Surgical122
buste di sterilizzazione 10 "x 16"AmazonB07MFB455C
pinza a punta ultrafine affusolata Fisherbrand Fisherbrand16-100-121
Tamponi per biopsia in schiuma non seghettati, rettangolariFisherbrand22-038-221
Soluzione di formalina, 10% (istologico)Fisher ChemicalSF98-4
Cassette per trattamento/inclusione di tessuti con coperchioSimport M490-2Z672122
Forbici di precisione fine Scatole per contenitori per alimenti PBS per lame chirurgiche sterili al

Riferimenti

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