Sintesi verde di liquido ionico a base di chinolina

Sommario

Nel presente lavoro, chiariamo la sintesi verde del liquido ionico (IL) a base di chinolina , vale a dire 1-esadecilchinolina-1-io bromuro {[C₁₆quin]Br} mescolando la chinolina con un eccesso di 1-bromoesadecano, insieme alla sua caratterizzazione dettagliata utilizzando la risonanza magnetica nucleare e le misure spettroscopiche all'infrarosso.

Abstract

La minaccia sempre crescente della resistenza antimicrobica (AMR) mette a repentaglio la potenza degli antibiotici prevalenti contro le infezioni che crescono inesorabilmente generate da batteri, virus, parassiti e funghi, che rappresentano una grande minaccia per la salute e il benessere umano. A questo proposito, diverse nuove molecole hanno dimostrato il loro valore, con i liquidi ionici (IL) che sono una delle alternative più ecologiche, non volatili e termicamente stabili agli antimicrobici esistenti, possedendo un alto potenziale di solvatazione e una bassa pressione di vapore. Inoltre, l'utilizzo di queste entità sia nella stabilizzazione che nella destabilizzazione delle strutture proteiche e nel miglioramento dell'attività enzimatica ha ulteriormente aumentato il loro potenziale nell'industria biomedica. In quest'ottica, presentiamo la sintesi e la caratterizzazione green dell'IL a base di chinolina, grazie alla sua immensa potenza antimicrobica, con bassa citotossicità e grande attività di chaperone artificiale. In questo caso, manovrare l'approccio di sintesi one-pot in condizioni di reazione più ecologiche e prive di solventi non solo ha migliorato l'efficienza della reazione, ma ha anche aumentato la resa chimica. La purezza dell'IL sintetizzato è stata corroborata utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H, la risonanza magnetica nucleare 13C e la spettroscopia infrarossa (IR). Il potenziale biologico del composto sintetizzato viene ulteriormente convalidato analizzando le sue proprietà di assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità (ADMET) e autenticato utilizzando il saggio di diffusione su disco.

Introduzione

La crescita monumentale della popolazione mondiale rappresenta un enorme aumento del consumo di una vasta gamma di prodotti negli ultimi anni, tra cui cibo, medicinali e altri prodotti cruciali per il sostentamento degli organismi mortali. Ciò ha rinvigorito la ricerca di nuovi composti chimici con proprietà eccezionalmente specializzate, ecologicamente valide e benefiche in tutto il mondo. I liquidi ionici (IL) si sono dimostrati felici in questo senso. L'implicazione di questi composti nel dominio scientifico ha rafforzato nuove iniziative nella ricerca nelle tecnologie chimiche contemporanee¹. A differenza degli approcci convenzionali, l'utilizzo di IL non solo facilita le condizioni di reazione progressive, ma promuove anche una strategia personalizzata per affrontare le varie sfide biochimiche legate alla ricerca e allo sviluppo sperimentale².

Tipicamente, le IL sono sali stabili costituenti cationi (organici) e anioni (inorganici), con un punto di fusione inferiore a 100 °C³. Rispettando i 12 principi della chimica verde, empiricamente, questi sono sostituti convincenti dei consueti solventi organici⁴. Le sorprendenti proprietà associate all'utilizzo di questi composti comprendono una grande conduttività intrinseca, polarità, tendenza alla solvatazione, stabilità termica, non volatilità, acidità/basicità, idrofilia/idrofobicità e sintonizzabilità, rendendo gli IL più adatti per la ricerca sperimentale⁵.

Oltre alle ampie applicazioni di varie classi di IL nella moderna sintesi organica⁶, catalisi⁷ e vari processi elettrochimici che coinvolgono sensori⁸, attuatori⁹, batterie¹⁰ e celle a combustibile¹¹, negli ultimi anni questa classe di composti ha ricevuto un riconoscimento epocale nel campo della biomedicina alla luce della resistenza antimicrobica. Gli studi attuali rivelano che le IL a base di imidazolio, piridina, colina e pirrolo sono estremamente efficaci come agenti terapeutici grazie alla loro elevata carica e idrofobicit๲. Tuttavia, le controparti a base di chinolina sono ancora considerate le più potenti contro i microbi patogeni¹². Ulteriori applicazioni biomediche che accompagnano questa classe di IL includono l'attività degli chaperoni artificiali¹³, la citotossicità contro le cellule cancerose¹⁴ e un'eccellente capacità di trasporto dei farmaci¹⁵.

Convenzionalmente, la fabbricazione di IL comporta l'utilizzo di mezzi solventi altamente tossici come diclorometano, benzene, tetracloruro di carbonio, dicloroetilene, ^ecc.16, ostacolando la biocompatibilità ed elevando la tossicità del composto, rendendoli indesiderabili per l'uso biologico. Inoltre, l'uso di solventi nocivi nei mezzi di reazione non solo rallenta il tempo di reazione, ma aumenta anche la produzione involontaria di sottoprodotti di scarto rilasciati nell'ambiente¹⁷. Inoltre, il solvente utilizzato nei mezzi di reazione influenza anche il pH del prodotto finale; Pertanto, la sua rimozione alla fine della reazione è vitale, soprattutto quando il composto desiderato è destinato ad essere utilizzato per sistemi biologici correlati alle proteine. Quindi, tenersi lontani dall'uso di tale solvente è favorevole nel regno della chimica verde.

In questo studio, riportiamo la sintesi one-pot di un¹³ IL biocompatibile e non tossico, vale a dire 1-Esadecilchinolina-1-io bromuro, utilizzando una via più verde. La presente strategia omette l'utilizzo di un solvente molecolare, sfruttando la capacità di autosolvatazione dell'IL formato all'interno della miscela di reazione, promuovendo un'elevata efficienza di reazione e resa chimica. La reazione di Menschutkin¹⁸costituisce la base dell'attuale metodologia di sintesi. La purezza del composto sintetizzato viene sondata utilizzando la spettroscopia NMR e IR. Il profilo farmacocinetico del composto e la tossicità sono stati esaminati attraverso gli studi ADMET. Inoltre, nello studio è stato dimostrato anche il potenziale antimicrobico dell'IL sintetizzato contro il ceppo patogeno di Candida albicans .

Protocollo

NOTA: L'1-esadecilchinolina-1-io bromuro{[C₁₆quin]Br} è stato sintetizzato come descritto in precedenza da Sharma et ^al.13.

1. Preparazione e sterilizzazione di apparecchi in vetro

NOTA: Questo dovrebbe essere fatto almeno 1 giorno prima di impostare la reazione per la sintesi del composto desiderato.

1. Lavare accuratamente un pallone a fondo tondo (RB) 24/29, 250 mL, a due colli, insieme ad altri apparecchi in vetro come cilindri dosatori, ecc., e risciacquare con acqua distillata seguita da acetone.
2. Asciugare l'apparecchio lavato in un forno ad aria calda a 60 °C fino a quando l'apparecchio non è completamente asciutto per un ulteriore utilizzo.
   NOTA: Di solito, l'apparecchio lavato deve essere posto per una notte in un forno di essiccazione per rimuovere completamente il film d'acqua e garantire che il sistema di reazione sia privo di impurità.

2. Installazione dell'apparecchio

NOTA: L'apparecchio deve essere bloccato correttamente per garantire un riscaldamento uniforme dei reagenti. Il diagramma schematico dell'impostazione della reazione è illustrato nella Figura 1.

1. Posizionare un bagno d'olio su una piastra calda con un agitatore magnetico. Preriscaldare il bagno d'olio a 80 °C prima dell'inizio della reazione.
2. Lasciare riposare l'RB in un bagno d'olio utilizzando un supporto per storta a tubo in modo che sia immerso per metà nel bagno d'olio posto su una piastra calda con agitatore magnetico.
3. Sigillare la bocca superiore del RB con un tappo di sughero che costituisce un ago di spurgo, ulteriormente collegato a una siringa con un palloncino N₂ attaccato ad essa.
4. Sigillare ermeticamente l'altro collo dell'RB utilizzando un altro tappo di gomma per evitare la fuoriuscita di N₂ dal mezzo di reazione.
5. Preriscaldare l'intero mezzo a 80 °C in un'atmosfera inerte mantenuta attraverso lo spurgo N₂ prima di aggiungere i reagenti all'RB.
6. Riempire ripetutamente il palloncino N₂ per garantire l'inerzia del sistema di reazione e mantenere la temperatura per tutto il tempo (quindi è preferibile il riscaldamento a bagno d'olio).

3. Aggiunta dei reagenti al sistema di reazione

1. Versare 0,1 M di chinolina e 0,105 M di 1-bromoesadecano nel sistema di reazione senza disturbare l'ambiente di reazione preimpostato.
2. Mescolare continuamente il contenuto a 2500-3000 giri/min per 3 giorni in ambiente inerte e temperatura costante.

4. Purificazione/Ricristallizzazione del composto

NOTA: L'intero prodotto non deve essere sottoposto a ricristallizzazione. Invece, la ricristallizzazione in batch dovrebbe essere scelta per evitare la perdita del prodotto.

1. Sciogliere il solido ottenuto in una miscela 1:2 di toluene/etanoato di etile. Raffreddare questa miscela a -15 °C in un congelatore (temperatura impostata a -15 °C) e filtrare sotto vuoto utilizzando un imbuto Buchner, collegato a una pompa a vuoto e a un pallone filtrante attraverso un tubo. Posizionare una membrana filtrante in polipropilene, con una dimensione dei pori di 0,45 μm, nell'imbuto Buchner, coprendo l'intero fondo del filtro. Versare una piccola quantità della miscela di solvente attraverso il filtro per creare una tenuta adeguata, evitando qualsiasi tipo di perdita d'aria attraverso l'installazione.
2. Lavare il prodotto filtrato con toluene freddo versando gradualmente il solvente attraverso l'imbuto, quindi essiccare a 70 °C in forno sottovuoto. Ripetere questa procedura 2 volte per garantire l'elevata purezza del composto desiderato.

5. Validazione del composto mediante spettroscopia NMR

1. Prima di sottoporre il composto a ¹H NMR e ¹³C NMR, scioglierlo in cloroformio deuterato (CDCl₃) misurando 1-10 mg del composto e sciogliendolo in circa 1 mL di CDCl_3.
2. Iniettare questa miscela in una provetta NMR utilizzando una siringa da 1 ml per l'analisi del campione con uno spettrometro NMR. La preparazione del campione è identica sia per la NMR ¹H che per la NMR ¹³C.

6. Caratterizzazione IR dell'IL sintetizzato

1. Non è richiesta alcuna preparazione del campione per ottenere gli spettri IR del composto.
2. Sottoporre alcuni mg del campione solido a uno spettrometro IR per ottenere una visione dei diversi gruppi funzionali presenti nel composto sintetizzato. Le letture sono state ottenute come dimostrato in precedenza¹⁹.

7. Previsione delle proprietà ADMET

1. Inserisci i SORRISI canonici dell'IL desiderato nel software online gratuito ADMETLAB 2.0 ed esegui il programma per ottenere vari parametri, rivendicando il potenziale biologico dello stesso.

8. Saggio di diffusione su disco che dimostri l'applicazione biomedica dell'IL sintetizzato

1. Pre-coltura del ceppo fungino di Candida albicans (ATCC 90028) in brodo di peptone destrosio di lievito (YPD) per quasi 16 ore in un incubatore con agitatore BOD a 37 °C.
2. Preparare il terreno di coltura in agar YPD mescolando l'1% di estratto di lievito, il 2% di peptone, il 2% di destrosio e l'1,5% di agar in 1 litro di acqua distillata doppia. Versare 25 mL di terreno di coltura per agar YPD appena formato in una piastra Petri da 90 mm dopo averla sterilizzata in autoclave per 15 minuti a 121 °C. Lasciare le piastre indisturbate per consentire una corretta solidificazione del supporto.
3. Una volta che la piastra è completamente solidificata, distribuire circa 100 μl dell'inoculo fungino appena preparato in modo omogeneo sulla piastra contenente il terreno, utilizzando uno spalmatore di vetro. Lasciare le piastre indisturbate per 5-7 minuti nella cappa a flusso laminare.
4. Posizionare un disco circolare sterile di carta del diametro di 5-6 mm al centro della stessa piastra, utilizzando una pinza.
5. Aggiungere 50 μl di soluzione acquosa 0,1 mM dell'IL sintetizzato sul disco, gradualmente, con l'aiuto di una pipetta da 20-200 μl.
6. Conservare in frigorifero la piastra per circa 30 minuti per garantire una corretta diffusione dell'IL nell'agar. Posizionare la piastra nell'incubatore BOD preimpostato a 37 °C per 24 ore.
7. Misurare la zona di inibizione (comprensiva del diametro del disco) utilizzando una scala di misurazione e calcolare l'area sotto questa zona secondo l'equazione 1.
   Area = πr² (1)

Risultati

La Figura 2 rappresenta lo schema di reazione della reazione di Menschutkin coinvolta nel determinare il processo di sintesi. Il bromuro di 1-esadecilchinolina-1-io, così sintetizzato, è stato caratterizzato utilizzando la spettroscopia NMR e IR. Si prevede che il prodotto oleoso così acquisito mostri ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) a δ 9,34 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 7,80 (t, 1H), 7,30-7,35 (m, 3H), 7,20 (d, 1H), 5,00 (t, 2H), 2,00 (p,2H), 1,30-1,35 (m, 26H), 1 (t, 3H), come dimostrato nella Figura 3. Il composto dovrebbe mostrare ¹³C NMR (Figura 4; 100 MHz, CDCl₃) a δ 143, 141, 131, 130,27, 130, 127,5, 126,3, 126, 60, 31, 29, 29, 28,5, 27, 23 e 14. Ogni picco è etichettato con il corrispondente numero di protoni menzionato nella struttura del composto, responsabile della realizzazione di quel segnale.

CDCl₃ è trasparente alla regione NMR (cioè la regione a radiofrequenza) degli spettri elettromagnetici a causa dell'assenza di atomi di H che impartiscono segnali prominenti in questa regione ed è quindi utilizzato come solvente per la preparazione del campione nella sua forma deuterata. Non interferisce con il campo magnetico applicato ed è di natura completamente inerte. Tuttavia, non è possibile eliminare il picco corrispondente a questo solvente (che appare a circa 7,26 ppm per spettri NMR 1H) poiché la deuterizzazione dei solventi NMR non può raggiungere esattamente il 100%. Tuttavia, il picco che appare di solito non è significativo e può essere completamente rimosso eseguendo uno spettro vuoto di CDCl₃ e integrando di conseguenza i picchi richiesti. Queste impostazioni possono essere effettuate direttamente all'interno dello strumento o tramite l'utilizzo di determinati software (come NMRium, ecc.). Nel caso in cui il campione non sia perfettamente essiccato, la caratteristica del picco dell'acqua può apparire in modo prominente negli spettri. Inoltre, CDCl₃ e altri solventi deuteriati possono anche contenere una certa quantità di acqua e quindi conferire i picchi attribuiti alla presenza di acqua. Questo problema è stato risolto asciugando correttamente il campione e mantenendo il solvente NMR a temperatura ambiente, coperto con una pellicola trasparente. In alcuni casi, alcuni agenti essiccanti inerti, come il carbonato di potassio o il solfato di sodio, vengono utilizzati anche per eliminare il contenuto d'acqua presente nella bottiglia di CDCl₃.

Ci si aspetta che gli spettri FTIR dell'IL (Figura 5) dimostrino bande di vibrazione a 3051 ^cm-1, 2917 ^cm-1 e 2853 ^cm-1, con la massima intensità, corrispondente alle vibrazioni di allungamento C-H esistenti nell'anello aromatico e per i carboni alchilici. Una spalla larga a 3440 ^cm-1 corrisponde alle vibrazioni di allungamento N-H. Un'altra fascia per le spalle osservata a 1357 ^cm-1 è caratteristica delle vibrazioni di stiramento che si verificano a causa del legame C-N. Bande notevoli a 820 ^{cm-1.770 cm-1} e 710 ^cm-1 sono associate alle vibrazioni di flessione C-H fuori dal piano. Il picco a 1155 ^cm-1è specifico per le vibrazioni di flessione C-H nel piano. Le vibrazioni di allungamento C-C prevalenti nell'anello aromatico sono convalidate dai picchi visibili a 1468 ^cm-1, 1520 ^cm-1 e 1585 ^cm-1. I risultati così ottenuti sono confrontabili con i dati precedentemente riportati da Sharma et ^al.13 e quindi confermano la formazione del composto desiderato.

I risultati ottenuti attraverso l'analisi ADMET sono riportati nella Tabella 1. Il potenziale biomedico di [C₁₆quin]Br è stato studiato utilizzando un saggio di diffusione di pozzi contro il ceppo di C. albicans (Figura 6). Questa tecnica valuta la potenza antimicrobica dell'IL misurando la zona di inibizione della crescita intorno al sito di applicazione del composto. È stato osservato che [C₁₆quin]Br ha mostrato un effetto antimicrobico statisticamente pronunciato (p < 0,05) contro C. albicans, rendendo questa classe di IL altamente potente ed efficace nel campo della biomedicina.

Resa percentuale della reazione
La resa teorica della reazione può essere calcolata come segue, secondo lo schema di reazione adottato (Figura 2).

Dallo schema, 1 M di chinolina porta alla formazione di 1 M di 1-Esadecilchinolina-1-io bromuro, cioè 129,16 g/mol di chinolina = 434 g/mol [C₁₆quin]Br. Quindi,

12,916 g (0,1 moli) di chinolina ×12,916= 43,4 g

Pertanto, la resa teorica della reazione è di 43,4 g.

Tuttavia

% di rendimento= ×100

Nel presente studio, la resa effettiva della reazione è risultata essere di 37,84 g dopo la completa essiccazione del prodotto ottenuto.

Quindi

% di rendimento= ×100=87,188% (87%)

Inoltre, il tempo di reazione più lungo, come si vede nello scenario attuale, è pertinente per consentire al sistema di reazione di raggiungere un completo equilibrio termodinamico, dove l'entropia del sistema è massimizzata minimizzando l'energia libera di Gibbs. Questo alla fine massimizza la resa della reazione. Tuttavia, le condizioni di reazione sono piuttosto lievi e quindi richiedono un tempo di reazione prolungato per garantire che l'intero reagente si sia convertito con successo nel prodotto. Il tempo di reazione, qui, è ottimizzato dopo ripetuti pragmatismi.

Figura 1: Impostazione della reazione. La figura mostra gli schemi generali della configurazione della reazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Meccanismo di sintesi. Rappresentazione schematica dello schema di reazione coinvolto nel processo di sintesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: NMR previsto ^{di 1}ora. Rappresentazione degli spettri NMR ^{1 H di}[C₁₆quin]Br. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Previsto ¹³CNMR. Rappresentazione degli spettri NMR ¹³C di [C₁₆quin]Br. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Spettri IR previsti. Rappresentazione degli spettri IR di [C₁₆quin]Br. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Studio antimicotico. Il saggio di diffusione su disco è stato eseguito con l'aggiunta di 50 μL di 0,1 mM di IL, che rappresenta il potenziale antifungino di [C₁₆quin]Br. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Proprietà	Valore	Commento
Regola di Lipinski	Accettato	MW ≤ 500; log P ≤ 5; accettore H ≤ 10; Donatore H ≤ 5. Se due proprietà sono fuori intervallo, è possibile uno scarso assorbimento o permeabilità, una è accettabile.
Assorbimento gastrointestinale	Alto	Maggiore efficacia della somministrazione orale
Solubilità in acqua	Moderato	Migliora la capacità di trasporto del farmaco del composto
Punteggio di biodisponibilità	0.55 (55%)	Influenza il potenziale terapeutico del composto

Tabella 1: Analisi ADMET. Tabella che rappresenta le proprietà importanti da considerare per convalidare il potenziale biologico dell'IL sintetizzato.

Discussione

Recentemente, gli IL hanno divulgato varie implementazioni promettenti nel campo delle scienze biochimiche, tra cui il ripiegamento delle proteine/attività chaperone, veicoli di somministrazione di farmaci e/o catalizzatori in diverse reazioni organiche. Le loro intriganti proprietà fisico-chimiche, come la sintonizzabilità, la biocompatibilità, la solubilità, la sostenibilità, la stabilità, ecc., li hanno resi potenziali candidati per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici²⁰. La ricerca proposta considera l'AMR come una questione di grave preoccupazione e una delle maggiori minacce alla salute globale, alla sicurezza alimentare e allo sviluppo di oggi, dando priorità al perseguimento della ricerca e dello sviluppo di nuovi composti farmaceutici nell'ambito della scienza biomedica. Nella scelta dell'IL a base di chinolina per l'applicazione nell'industria biomedica, riconosciamo la sua elevata potenza nella distruzione dei microbi patogeni. A parte l'effetto antimicrobico di questa classe di composti, la sua attività di chaperone artificiale ne aumenta il merito nell'aspetto biofisico del mondo scientifico.

In questo studio, abbiamo sintetizzato con successo l'IL desiderato utilizzando una via di reazione più ecologica. In contrasto con le metodologie convenzionali che si basano sull'utilizzo di solventi tossici, sviluppando sottoprodotti gassosi nocivi²¹, qui riportiamo un approccio più economico, ecologico e privo di solventi per la sintesi degli stessi. Il protocollo prevede l'utilizzo di un facile set-up di reazione e di un semplice apparato, che facilita la robusta sintesi in laboratorio del composto desiderato. Il prodotto qui acquistato può essere isolato senza sforzo attraverso una semplice tecnica di filtrazione. La formazione di sottoprodotti non sostanziali nel corso della reazione favorisce ulteriormente gli aspetti più ecologici della sintesi. La tecnica utilizzata in questo studio si è dimostrata efficiente sia in termini di resa chimica che di purezza del composto desiderato. La reazione, altrimenti in più fasi, è stata realizzata in un unico piatto, con l'intento di ridurre il tempo e le risorse. Questa tecnica è stata adottata per eliminare le prolungate fasi di separazione e purificazione coinvolte nella sintesi organica generale.

Tuttavia, le limitazioni che accompagnano il protocollo sopra menzionato riguardano una gestione approfondita della compatibilità delle condizioni di reazione (in particolare la temperatura) e la garanzia di un corretto spurgo del gas N2 al fine di perpetuare manualmente un ambiente di lavoro inerte. È fondamentale controllare e monitorare l'ambiente di reazione in modo tempestivo per la corretta esecuzione di ogni singolo passaggio. La scalabilità può essere un altro possibile ostacolo al protocollo suggerito, poiché lo scaling up di una sintesi one-pot per scopi industriali può essere estremamente impegnativo a causa delle preoccupazioni relative alla miscelazione omogenea e al controllo su ciascun parametro di reazione.

In conclusione, la metodologia riportata è una potente strategia nella chimica verde, che offre diversi vantaggi, con una serie di sfide che devono essere meticolosamente affrontate e ponderate durante la progettazione, l'esecuzione e l'ottimizzazione dei percorsi di reazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-bromoesadecano	Merck CAS	n. 112-82-3	puro al 95% (come determinato dall'analisi HPLC)
Acetato di etile	Merck	CAS n. 205-500-4	puro al 95% (come determinato dall'analisi HPLC)
Spettrometro a risonanza magnetica nucleare (NMR)	Jeol, modello: JNM-ECZ 400S	Nil
Nil Chinolina	Merck	CAS n.91-22-5	puro al 95% (come determinato dall'HPLC Toluene
	Merck	CAS n. 108-88-3	puro al 95% (come determinato dall'analisi HPLC)