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Articolo metodologico

Screening e isolamento dei batteri intestinali che scindono il glicoside C

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DOI:

10.3791/67346

⸱

28 febbraio 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio stabilisce una serie di procedure operative standard (SOP) per lo screening e l'isolamento efficiente dei batteri intestinali in grado di scindere i glicosidi C.

Abstract

I C-glicosidi si trovano comunemente nelle piante medicinali e mostrano un'ampia diversità strutturale insieme a varie bioattività, tra cui attività antibatteriche, antinfiammatorie, antivirali, antiossidanti e antineoplastiche. Nei C-glicosidi, il carbonio anomerico della porzione zuccherina è direttamente collegato a un aglicone attraverso il legame carbonio-carbonio. Rispetto agli O-glicosidi, i C-glicosidi sono strutturalmente stabili e resistenti agli acidi e agli enzimi. Di conseguenza, sono in genere infrangibili, con conseguente scarsa assorbibilità e bassa biodisponibilità. È interessante notare che alcuni batteri intestinali possono scindere i legami glicosidici C-C, fornendo un approccio biologico specifico e rispettoso dell'ambiente per degradare i glicosidi C. In questo studio, è stata sviluppata una serie di procedure operative standard (SOP) per lo screening dei batteri intestinali in grado di scindere i legami glicosidici C-C sulla base del modello di biotrasformazione dei composti naturali. Le SOP includono la preparazione e l'arricchimento dei batteri intestinali, lo screening orientato all'attività e la convalida dell'attività in un mezzo di origine a basse emissioni di carbonio. Questa metodologia fornisce un riferimento fondamentale per i ricercatori che mirano a isolare e studiare questi batteri funzionali specializzati.

Introduzione

I C-glicosidi sono un gruppo di composti caratterizzati dal legame diretto dei gruppi glicosilici agli agliconi attraverso i legami C-C1. In natura, l'orientina, la vitexina, la puerrina e i loro derivati sono comunemente identificati come C-glicosidi2. Questi composti si trovano frequentemente in piante medicinali come il Trollius chinensis3 e in animali come la Styela plicata4. Gli studi hanno dimostrato che questi composti forniscono benefici per la salute e mostrano varie bioattività, tra cui antibatterico 5,6,7, antinfiammatorio 8,9,10,11,12, antivirale 3,12,13, antiossidante 14,15,16 e attività antineoplastiche17.

A causa del legame dei gruppi glicosilici allo scheletro attraverso legami C-C, questi composti mostrano un'elevata stabilità e resistenza all'idrolisi acida ed enzimatica18, portando a una scarsa assorbibilità e bassa biodisponibilità19. Questa limitazione influisce sullo sviluppo e sull'utilizzo dei glicosidi C. Tuttavia, i farmaci contenenti C-glicosidi, spesso somministrati per via orale, sono deglicosilati da enzimi specifici, producendo agliconi bioattivi più potenti 20,21,22,23. Mentre gli enzimi dell'ospite non sono in grado di deglicosilare i glicosidi C, è stato riportato che i batteri intestinali metabolizzano alcuni tipi. Ad esempio, alcuni batteri intestinali convertono la mangiferina in noratiriolo, che mostra una maggiore potenza come agente antidiabetico o antineoplastico24. Nonostante questi risultati, è stato caratterizzato solo un numero limitato di batteri in grado di scindere i glicosidi C e i meccanismi sottostanti rimangono poco compresi. Uno screening efficiente e standardizzato di questi batteri migliorerà la comprensione delle loro funzioni e accelererà lo sviluppo dei glicosidi C.

Il metodo di screening è stato sviluppato e perfezionato nel tempo in un sistema maturo. Gli approcci principali includono l'arricchimento, lo screening orientato all'attività e la convalida dell'attività in mezzi sorgente a basse emissioni di carbonio. Questo metodo facilita l'isolamento di ceppi bersaglio puri, nonché l'identificazione di specie, dati genomici e tratti di microrganismi bersaglio. Utilizzando questo sistema, i batteri intestinali in grado di scindere i glicosidi C possono essere efficacemente sottoposti a screening e isolati.

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Protocollo

Gli esperimenti condotti hanno aderito alle normative locali, nazionali e internazionali di contenimento della biosicurezza appropriate ai rischi specifici per la biosicurezza associati a ciascun ceppo. I campioni fecali sono stati raccolti da volontari sani che non avevano assunto alcun farmaco per almeno una settimana. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Costruzione di un modello di trasformazione batterica intestinale umana in vitro

  1. Preparazione del terreno anaerobico generale (GAM)25
    1. Preparazione della soluzione A
      1. Combina 10,0 g di triptone, 10,0 g di peptone proteoso, 3,0 g di peptone di soia, 13,5 g di siero digestivo in polvere, 1,2 g di estratto di fegato in polvere, 2,2 g di estratto di manzo e 5,0 g di estratto di lievito in un pallone di Erlenmeyer da 500 ml.
      2. Aggiungere 500 ml di acqua distillata e mescolare sotto fuoco fino a quando le sostanze non si saranno completamente sciolte.
    2. Preparazione della soluzione B
      1. Preparare la soluzione B seguendo la stessa procedura della soluzione A, tranne per unire 3,0 g di glucosio, 5,0 g di amido solubile, 2,5 g di idrogeno fosfato dipotassico e 3,0 g di cloruro di sodio in un pallone di Erlenmeyer da 250 ml.
    3. Preparazione della soluzione C
      1. Preparare la soluzione C seguendo la stessa procedura delle soluzioni A e B, tranne combinare 0,3 g di L-cisteina cloridrato e 0,3 g di tioglicolato di sodio in un pallone di Erlenmeyer da 100 mL.
      2. Mescolare tutte e tre le soluzioni in un matraccio di Erlenmeyer da 1000 mL, regolare il pH a 7,2 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio al 10% e aggiungere acqua distillata per ottenere un volume finale di 1000 mL.
      3. Distribuire il terreno in matracci di Erlenmeyer da 250 mL e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare a 4 °C.
    4. Preparazione di un terreno anaerobico generale solido
      1. Aggiungere l'1%-2% di agar al terreno liquido GAM e scaldare fino a completa dissoluzione. Distribuire in matracci di Erlenmeyer da 250 mL e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 minuti.
    5. Preparazione di un terreno di origine a basse emissioni di carbonio
      1. Preparare il terreno di origine a basse emissioni di carbonio utilizzando la stessa procedura della GAM, ma omettendo l'estratto di lievito, il glucosio e l'amido solubile.
  2. Preparazione della flora intestinale umana mista
    1. Raccogliere 1-2 g di feci umane fresche in una provetta sterile monouso per la raccolta delle feci riempita di azoto gassoso. Sigillare prontamente il tubo. Aggiungere 5 mL di terreno GAM, sigillare e coltivare a 37 °C per 24 ore in un incubatore anaerobico sterile.
      NOTA: Utilizzare un misuratore di ossigeno per monitorare i livelli di ossigeno dell'incubatore anaerobico e sostituire l'azoto gassoso se necessario per mantenere le condizioni anaerobiche.
  3. Attivazione della flora intestinale umana mista
    1. Dopo 24 ore, trasferire 0,5 mL di sospensione batterica intestinale umana in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 4,5 mL di terreno GAM fresco.
    2. Sigillare e incubare a 37 °C per 24 ore in condizioni anaerobiche per ottenere una flora intestinale umana mista attiva.
  4. Preparazione di soluzioni di riferimento
    1. Pesare 5 mg ciascuno di orientina e luteolina e scioglierli separatamente in 1 mL di DMSO per preparare soluzioni di riferimento di orientina e luteolina a una concentrazione di 5 mg/mL.
  5. Screening della flora intestinale attiva in grado di scindere i C-glicosidi
    1. Miscelare 260 μL di flora intestinale attivata con 6 mL di terreno fresco a basso tenore di carbonio contenente 40 μL di soluzione di riferimento di orientina e incubare a 37 °C.
    2. Includere un gruppo di controllo (6 mL di terreno di origine a basse emissioni di carbonio, 40 μL di soluzione di riferimento di orientina e 260 μL di soluzione salina normale) e un gruppo bianco (6 mL di terreno di origine a basse emissioni di carbonio, 40 μL di soluzione salina normale e 260 μL di flora intestinale attivata).
      NOTA: Eseguire tutti i test in triplice copia in un'incubatrice anaerobica.
  6. Pretrattamento delle soluzioni di trasformazione
    1. Dopo 24 ore e 48 ore, pipettare 1 mL di soluzioni di reazione in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 13.400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i batteri.
    2. Aggiungere 200 μl di surnatante a 600 μl di metanolo, mescolare e centrifugare a 13.400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le proteine.
  7. Rilevamento dei prodotti di trasformazione
    1. Filtrare il surnatante utilizzando una membrana microporosa da 0,22 μm e analizzare il filtrato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Esecuzione di analisi HPLC su uno strumento dotato di colonna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
    2. Mantenere la temperatura del forno a colonna a 40 °C, con una portata di 1 mL/min. Utilizzare l'acetonitrile come fase mobile A e l'acido formico allo 0,1% in acqua purificata come fase mobile B.
      NOTA: Utilizzare un sistema di gradiente lineare come segue: 5%-55% A a 0-20 min, 55%-95% A a 20-25 min, 95%-5% A a 25-30 min e 5% A a 30-32 min.

2. Isolamento di singoli ceppi dalla flora batterica intestinale umana

  1. Attivazione della flora batterica intestinale umana mista
    1. Attivare la flora batterica intestinale umana mista in grado di scindere l'orientina, come descritto al punto 1.3, per ottenere la soluzione attivata di flora batterica intestinale umana.
  2. Preparazione di piastre GAM solide
    1. Sciogliere il terreno solido GAM preparato mediante riscaldamento e versarlo in piastre di Petri sterili monouso in un incubatore anaerobico. Lasciare solidificare il terreno per preparare piastre GAM solide.
  3. Screening preliminare di singoli ceppi della flora batterica intestinale umana
    1. Pipettare 100 μl della soluzione batterica attivata in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di soluzione fisiologica normale.
    2. Inoculare un volume appropriato di soluzione batterica su una capsula di Petri utilizzando un anello di inoculazione monouso. Sigillare la capsula e incubarla in un'incubatrice anaerobica.
  4. Osservazione della morfologia delle colonie
    1. Dopo 48 ore di incubazione a 37 °C, osservare le dimensioni, la morfologia e il colore delle colonie sulla piastra.
  5. Selezione di singole colonie per ottenere singoli ceppi
    1. Selezionare singole colonie batteriche distinte e coltivarle in provette da microcentrifuga da 10 mL contenenti 4,5 mL di terreno GAM fresco. Incubare in condizioni anaerobiche a 37 °C per 24 ore per ottenere ceppi singoli.
  6. Verifica dell'attività di un singolo deformazione
    1. Verificare l'attività dei singoli ceppi come descritto nei passaggi 1.5, 1.6 e 1.7. Eseguire la verifica dell'attività utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la marcatura su piastra25.
  7. Purificazione di singoli ceppi dalla flora batterica intestinale umana
    1. Purificare il singolo ceppo attivo come descritto al punto 2.1. Verificare la sua attività attraverso esperimenti di trasformazione con l'orientina, seguendo le procedure descritte nei passaggi 1.5, 1.6 e 1.7.

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Risultati

I campioni fecali di dieci volontari sani sono stati sottoposti a screening utilizzando esperimenti di trasformazione, ottenendo un campione che ha dimostrato attività nella deglicosilazione dell'orientina. Questa scoperta ha confermato la fattibilità dello screening per i campioni attivi. Il campione attivo è stato isolato utilizzando il metodo della marcatura su piastra. Sulla base della morfologia e delle caratteristiche delle colonie, sono state selezionate per ulteriori analisi circa 18 colonie batteriche singole co...

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Discussione

È stata stabilita una procedura operativa standard (SOP) per lo screening dei batteri intestinali umani in grado di scindere i glicosidi C. Utilizzando queste procedure, è stato ottenuto con successo un ceppo attivo puro e la sua proprietà di deglicosilazione è stata confermata attraverso test di trasformazione. La SOP consiste nella preparazione e nell'arricchimento di batteri intestinali, nello screening orientato all'attività e nella convalida dell'attività in un mezzo di origine a ba...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Il lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China 82374134.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetonitrileThermo Fisher ScientificF2408R205Incubatore anaerobico HPLC
Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTDYQX- II
Estratto di manzoBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
Siero digestivo in polvereBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-087
BR Dipotassico Idrogeno fosfatoBeijing Chemical WorksM26298AR
Tubo di raccolta feci sterili monousoLang Fu Co., LTD5 mL
Acqua distillataDipartimento di biofarmaceutica, Università di Medicina
di Pechino DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP TuboBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 mL/1,5 mL
Eppendorf Centrifuga EppendorfAG5418
GlucosioBeijing Chemical WorksGC205003AR
Cromatografo liquido ad alte prestazioniShimadzu CorporationLC-20
Sterilizzatore a vapore ad alta pressioneSanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 Colonna cromatograficaAgela Technologies Co., LTD4,6 mm &volte; 250 mm, 5 &; micro; m
L-cisteina cloridratoBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
Estratto di fegato in polvereBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
LuteolinaIstituti nazionali per il controllo>98%
Agitatore magneticoIka Werke Co., LTDRCT base
MetanoloThermo Fisher Scientific20240901312
Membrana filtrante AR MilliporeSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0,22 µ L &volte; 50 mm
OrientinYishiming (Pechino) Biotechnology Co., LTD19120601>98%
PeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
Petri DishBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD150 mm
Cloruro di sodioBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
Tioglicolatodi sodioShanghai Jianglai Biotechnology Co., LTDJ031S219019
Amido solubileBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765BR
Peptone di soiaBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptoneAgela Technologies Co., LTD1685787BR
Pulitore ad ultrasuoniKun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTDKQ-500DE
Estratto di lievitoBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-014BR
Tradizionale Cinese degli alimenti e dei farmaci AR

Riferimenti

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