Articolo metodologico

Induzione dell'ingresso di giovani in dispersione al terzo stadio di Bursaphelenchus xylophilus nella criptobiosi attraverso la regolazione osmotica

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DOI:

10.3791/67350

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27 dicembre 2024

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre la dispersione di giovani al terzo stadio (giovani pre-dauer, JIII.) di Bursaphelenchus xylophilus in criptobiosi attraverso la regolazione osmotica di ioni cloruro di potassio (KCl). Questo metodo può fornire supporto tecnico per la ricerca sui meccanismi di resistenza allo stress di B. xylophilus.

Abstract

La criptobiosi è uno stato in cui gli organismi perdono quasi tutta la loro acqua interna ed entrano in aniidrobiosi in condizioni di stress ambientale estremo. I giovani in dispersione al terzo stadio (giovani pre-dauer, figure-abstract-1) di Bursaphelenchus xylophilus possono entrare in criptobiosi attraverso la disidratazione e rianimarsi dopo la reidratazione quando le condizioni ambientali migliorano. La regolazione osmotica è fondamentale per la loro sopravvivenza in questo processo. In questo studio, campioni di B. xylophilus sono stati raccolti da Pinus massoniana morto a causa della malattia dell'appassimento del pino a Ningbo, nella provincia di figure-abstract-2 Zhejiang, in Cina. Dopo l'immersione in una soluzione figure-abstract-3 di cloruro di potassio (KCl) all'8%, B. xylophilus è entrato in uno stato criptobiotico dopo una graduale disidratazione dovuta all'aumento della pressione osmotica esterna dovuta all'evaporazione naturale dell'acqua. figure-abstract-4 B. xylophilus potrebbe resistere a stress a bassa temperatura a -20 °C. figure-abstract-5 B. xylophilus potrebbe rianimarsi dopo la reidratazione, con un tasso di sopravvivenza del 92,1%. Questo processo può regolare l'ingresso di figure-abstract-6 B. xylophilus nella criptobiosi, consentendogli di resistere ad ambienti estremi. Questo metodo descritto nel nostro studio è semplice e affidabile, fornendo supporto tecnico per lo studio dei meccanismi di resistenza allo stress di B. xylophilus.

Introduzione

La malattia dell'appassimento del pino è una delle malattie forestali più gravi in Cina1. Il nematode del pino Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) rappresenta una minaccia significativa per le specie di pino come il Pinus massoniana (P. massoniana) riproducendosi all'interno dell'ospite, portando a un rapido appassimento e morte. In condizioni ambientali sfavorevoli dopo la morte dell'ospite, i giovani riproduttivi di B. xylophilus possono entrare in giovani pre-dauer (figure-introduction-1). Questi giovani cercano insetti vettori per continuare il loro trasferimento e diffondersi, causando estese morie di pinete2.

La criptobiosi è uno stato in cui gli organismi perdono quasi tutta la loro acqua interna ed entrano in anidrobiosi in condizioni di stress ambientale estremo3. In questo processo, gli organismi si disidratano gradualmente, con conseguente arresto del movimento, riduzione del metabolismo e sospensione del ciclo di vita4. In condizioni adeguate, possono riprendersi dopo la reidratazione. La criptobiosi consente agli organismi di resistere ad ambienti estremi, come le basse temperature, e di prolungare la loro durata di vita5. I nematodi sopravvissuti alla criptobiosi per 30.000 anni sono stati trovati nel permafrost antartico6.

Studi precedenti hanno dimostrato che i nematodi possono adattarsi a vari fattori di stress abiotici, come la bassa temperatura, la siccità e l'alta pressione osmotica, durante la disidratazione, regolandola loro permeabilità superficiale. Inoltre, i nematodi possono arricciare i loro corpi per ridurre la superficie e ridurre al minimo il tasso di perdita d'acqua. Ad esempio, Caenorhabditis elegans regola l'equilibrio osmotico, consentendo agli ioni e alle piccole molecole di passare liberamente attraverso la sua cuticola, mentre le molecole più grandi non possono8. figure-introduction-2 B. xylophilus presenta anche criptobiosi. Durante le fasi di disidratazione e reidratazione della criptobiosi, la regolazione osmotica è essenziale per controllare lo scambio di sostanze attraverso la cuticola, rendendola fondamentale per l'ingresso o il recupero dalla criptobiosi9.

Il presente studio introduce un metodo per indurre la criptobiosi in figure-introduction-3 B. xylophilus attraverso la regolazione osmotica. Questo metodo è semplice, efficiente e altamente affidabile e fornisce supporto tecnico per la ricerca sui meccanismi di resistenza allo stress di figure-introduction-4 B. xylophilus.

Protocollo

1. Collezione di figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Raccolta di dischi infetti di P. massoniana
    NOTA: Tutte le procedure sono state conformi alle misure amministrative per l'area epidemica della malattia dell'appassimento dei pini e il legno infetto e ad altre normative applicabili. Una foresta di P. massoniana infettata da B. xylophilus nella contea di Xiangshan, nella città di Ningbo, nella provincia di Zhejiang, è stata selezionata come sito campione. P. massoniana, morta a causa dell'avvizzimento del pino, è stata abbattuta all'interno del sito di campionamento.
    1. Raccogli i tronchi rotondi (5 cm di spessore) dalle sezioni superiore, centrale e inferiore del tronco principale degli alberi abbattuti.
    2. Tagliare i tronchi rotondi di P. massoniana raccolti a fette spesse 0,5-1 cm, quindi rifilarli in piccole strisce di 2-3 cm di lunghezza.
    3. Metti le piccole strisce di legno in sacchetti sigillati e conservale in un laboratorio per un ulteriore utilizzo.
  2. Estrazione di figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Fissare un tubo di gomma all'estremità stretta di un imbuto di vetro a collo lungo con un diametro di circa 15 cm. Fissare il tubo di gomma con un rubinetto. Posizionare l'imbuto assemblato su un supporto per imbuto.
    2. Avvolgete completamente le piccole strisce di legno in un unico strato di carta velina e poi mettetele nell'imbuto. Aggiungere acqua distillata all'imbuto fino a quando tutte le strisce di legno sono sommerse.
      NOTA: Dopo essere rimasti in piedi per 12-24 ore, i nematodi sono usciti dalle strisce di legno e si sono depositati sul fondo dell'imbuto10. La carta velina impediva ai detriti di legno di depositarsi e permetteva il passaggio dei nematodi.
    3. Rilasciare lentamente il rubinetto sul fondo dell'imbuto e lasciare che 2000-5000 μl della miscela fuoriescano in una capsula di Petri (5 cm di diametro) per l'esame microscopico e l'identificazione morfologica.
    4. Identificare figure-protocol-3 B. xylophilus osservando caratteristiche come stiletti, bulbi esofagei mediani, goccioline lipidiche e forme della coda "a dito"11.
    5. Al microscopio, trasferire il singolo figure-protocol-4 B. xylophilus su un vetrino aspirando 10 μl di liquido insieme a un nematode utilizzando una pipetta da 10 μl ogni volta. Ripetere questo processo 30 volte per raccogliere circa 300 μl della miscela contenente nematodi.
    6. Dopo l'estrazione di figure-protocol-5 B. xylophilus, sterilizzare le strisce di legno rimanenti e i materiali legnosi infetti per evitare ulteriori contaminazioni.

2. Controllo del processo di regolazione osmotica

  1. Preparazione della miscela di regolazione osmotica
    1. Preparare una soluzione acquosa di KCl all'8%.
    2. Utilizzando una pipetta, aggiungere 10 μl della soluzione acquosa di KCl all'8% al vetrino contenente la miscela di figure-protocol-6 B. xylophilus, ottenendo circa 310 μl di una miscela di nematodi e soluzione di KCl.
  2. Regolazione dell'aumento della pressione osmotica e della disidratazione di figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio, lasciando che l'acqua evapori naturalmente. Aumenterebbe gradualmente la pressione osmotica dell'ambiente circostante, provocando la disidratazione dei nematodi in circa 30-60 minuti.
      NOTA: L'operatore deve solo attendere che l'acqua evapori naturalmente fino a quando i cristalli di KCL precipitano e osservare lo stato dei nematodi al microscopio. Ci vogliono circa 30-60 minuti perché 310 μL della miscela evaporino naturalmente fino a quando i cristalli di KCL precipitano.
    2. Osservare al microscopio il processo di disidratazione (ad esempio, arricciamento del corpo, aggregazione, ecc.) di figure-protocol-8 B. xylophilus . Quando l'acqua evapora completamente e i cristalli di KCl precipitano, figure-protocol-9 B. xylophilus smette di muoversi ed entra in criptobiosi.
  3. Trattamento da stress a bassa temperatura del criptobiotico figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Porre il criptobiotico figure-protocol-11 B. xylophilus in un ambiente a temperatura costante di -20 °C per 24 ore.
  4. Regolazione della diminuzione della pressione osmotica e reidratazione di figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Aggiungere circa 300 μl di acqua distillata intorno ai giovani che erano stati sottoposti a trattamento a bassa temperatura con pipetta. Il processo di reidratazione, della durata di circa 30-60 minuti, diminuisce gradualmente la pressione osmotica dell'ambiente circostante.
    2. Osservare al microscopio il processo di reidratazione di figure-protocol-13 B. xylophilus (ad esempio, allungamento del corpo, ripresa del movimento, ecc.). Calcola il tasso di sopravvivenza dopo 24 ore.

Risultati

Nella soluzione di KCl all'8%, quando l'acqua evaporava, figure-results-1 B. xylophilus mostrava inizialmente un notevole "arricciamento" pur rimanendo mobile (Figura 1A). Una volta evaporata completamente l'acqua, i nematodi cessavano di muoversi e si arricciavano, con superfici depresse e goccioline lipidiche accumulate (Figura 1B), indicando il loro ingresso nello stato criptobiotico. Dopo l'aggiunta di acqua distillata all'ambiente circostante, i nematodi si reidratano e si rianimano (Figura 1C). Dopo che l'acqua è evaporata, appariranno i cristalli di KCL (Figura 1D). La Figura 1E mostra le caratteristiche morfologiche di figure-results-2 B. xylophilus.

Un esperimento di disidratazione ha dimostrato che in una soluzione iniziale di KCl all'8%, l'evaporazione dell'acqua ha causato figure-results-3 la perdita di acqua da parte di B. xylophilus. Dopo la disidratazione, figure-results-4 B. xylophilus è stato sottoposto a stress a bassa temperatura a -20 °C per 24 ore; il tasso medio di sopravvivenza è stato del 92,1%11. Rispetto a un tasso di sopravvivenza dello 0% nel gruppo di controllo che non era entrato in uno stato criptobiotico, i dati di cui sopra suggerivano che la disidratazione potrebbe aumentare significativamente il tasso di sopravvivenza di B. xylophilus in condizioni di figure-results-5 bassa temperatura.

Durante la fase di reidratazione successiva alla criptobiosi di figure-results-6 B. xylophilus, abbiamo osservato che il 100% dei nematodi presentava "bolle" in vivo quando venivano trasferiti da una soluzione di KCl al 40% ad acqua distillata (Figura 2).

figure-results-7
Figura 1: Il processo di disidratazione-criptobiosi-reidratazione di figure-results-8 B. xylophilus. Questa immagine illustra il processo di criptobiosi in figure-results-9 B. xylophilus, tra cui (A) fase di disidratazione, (B) fase di criptobiosi, (C) fase di reidratazione, (D) fase di cristallizzazione KCL e (E) figure-results-10 B. xylophilus. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-11
Figura 2: Accumulo di granuli di grasso in B. xylophilus non rianimatofigure-results-12. Questa immagine mostra lo stato di figure-results-13 B. xylophilus dopo la reidratazione, caratterizzato dalla presenza di granuli di grasso a forma di bolla in vivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo studio, figure-discussion-1 B. xylophilus è stato raccolto da P. massoniana morto a Ningbo, nella provincia di Zhejiang. Va notato che figure-discussion-2 B. xylophilus è stato selezionato da una popolazione mista con diversi stadi. In particolare, sono stati scelti tronchi rotondi con un'alta densità di B. xylophilus, seguiti dallo screening di figure-discussion-3 B. xylophilus. Durante l'inverno, quando la temperatura minima giornaliera nella provincia di Liaoning è di circa -20 °C, un gran numero di B. xylophilus a stadio figure-discussion-4 singolo può essere ottenuto da Pinus tabuliformis morto, il che ha semplificato il processo di selezione in questo esperimento12.

Durante il processo criptobiotico, il lento tasso di disidratazione dei nematodi favorisce la loro sopravvivenza e previene danni strutturali alle loro proteine13. Il tempo di disidratazione è fondamentale per determinare il tasso di sopravvivenza di figure-discussion-5 B. xylophilus. In questo studio, è stata utilizzata una soluzione di KCl a una concentrazione iniziale dell'8% e la sua concentrazione è stata aumentata gradualmente con l'evaporazione naturale dell'acqua, consentendo figure-discussion-6 a B. xylophilus di disidratarsi lentamente ed entrare in criptobiosi. Se l'acqua evapora troppo rapidamente o i nematodi vengono posti direttamente in una soluzione di KCl ad alta concentrazione, il loro tasso di sopravvivenza diminuisce in modo significativo.

Il metodo descritto in questo studio presenta diversi vantaggi. I materiali sperimentali sono facilmente accessibili e richiedono solo una soluzione di KCl e acqua distillata per regolare la disidratazione e la reidratazione di figure-discussion-7 B. xylophilus. Le procedure sono semplici: la disidratazione è avvenuta attraverso l'evaporazione naturale e la reidratazione è stata ottenuta aggiungendo acqua distillata. L'intero processo può essere completato entro 2 ore. Questo metodo vanta alti tassi di successo e sopravvivenza, con la maggior parte di B. xylophilus che entra in criptobiosi dopo la disidratazione e la maggior parte che figure-discussion-8 si rianima dopo la reidratazione, rispettivamente11.

Il metodo proposto è applicabile per regolare lo stato criptobiotico sia di B. xylophilus che figure-discussion-9 dei giovani di dispersione al quarto stadio (figure-discussion-10)14. Tuttavia, potrebbe non essere efficace per la propagazione di B. xylophilus.

Negli ultimi anni, la malattia dell'avvizzimento del pino causata da B. xylophilus si è estesa dalla Cina meridionale alle aree settentrionali. figure-discussion-11 B. xylophilus, che abita i pini in queste regioni settentrionali più fredde, tende a mostrare una maggiore resistenza al freddo15. Il metodo proposto può indurre criptobiosi in figure-discussion-12 B. xylophilus, migliorandone la resistenza al freddo e alla siccità. Nel complesso, questo metodo può fornire supporto tecnico per lo studio dei meccanismi di resistenza allo stress di B. xylophilus e del meccanismo di trasmissione della malattia dell'avvizzimento del pino.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal Fondo di ricerca basale dell'Istituto scientifico centrale di interesse pubblico dello Stato, dal Laboratorio chiave di genetica e allevamento degli alberi (numero di sovvenzione CAFYBB2020ZY001-2), dai progetti di ricerca aziendale (202404016-4320) e dalla Fondazione nazionale per le scienze naturali della Cina (NSFC 32271896).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Scivolo in vetroBiolandGS7101-752575 mm &volte; 25 mm & tempi; 1 millimetro
Imbuto in vetro a collo lungoTecnologia sperimentale Nanjing KangluodaN/A150 millimetri
MicroscopioPhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
PetriTecnologia sperimentale Nanjing Kangluoda  TB-62493579274550 mm & tempi; 50 millimetri
RubinettoTecnologia sperimentale Nanjing Kangluoda  TB-62497331174336 mm & tempi; 11 millimetri &volte; 55 millimetri
PipettaEppendorf312300001210– 100 µ L
Cloruro di potassio (KCL)Solarbio Scienze della VitaP9921500 g
Tubo in gommaTecnologia sperimentale Nanjing KangluodaTB-6249234570947 mm & tempi; 5 millimetri
SterilizzatoreBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Carta velina Impronta cuore a cuoreM322,5 cm & tempi; 21,5 cm

Riferimenti

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