Analisi della citometria a flusso dell'espressione dei fattori tissutali nelle piastrine umane

Sommario

Questo articolo illustra il protocollo per quantificare la percentuale di piastrine positive al fattore tissutale (TF) utilizzando la citometria del flusso sanguigno totale, valutando la proteina: (1) intracellulare in condizioni di riposo e (2) sulla superficie cellulare, sia in condizioni di riposo che attivate. Sono inoltre fornite indicazioni per valutare le piastrine TF-positive nel plasma ricco di piastrine.

Abstract

Un sottoinsieme di piastrine umane circolanti immagazzina intracellularmente il fattore tissutale (TF), il principale attivatore della cascata di coagulazione del sangue e della formazione del trombo. All'attivazione delle piastrine, la TF viene esposta sulla membrana cellulare, dove si lega alla FVII, portando infine alla generazione di trombina. Considerando che (1) i livelli di piastrine TF-positive aumentano in vari contesti clinici, contribuendo al fenotipo protrombotico del paziente, e (2) diversi farmaci possono modulare l'espressione della TF associata alle piastrine, un metodo standardizzato per valutare le piastrine TF-positive è prezioso, poiché la sua valutazione è stata controversa in passato. Qui, delineiamo un protocollo per misurare la percentuale di piastrine TF-positive utilizzando la citometria di flusso nel sangue intero e nel plasma ricco di piastrine (PRP)/lavato. Questo protocollo mira a fornire istruzioni dettagliate per quantificare la percentuale di piastrine TF-positive valutando la proteina (1) intracellulare in condizioni di riposo e (2) sulla superficie cellulare, sia in condizioni di riposo che attivate. La prima sezione fornisce informazioni essenziali per eseguire correttamente il prelievo del sangue, al fine di garantire che le procedure pre-analitiche non influenzino i risultati. Successivamente, il protocollo si concentra sulle procedure di preparazione e etichettatura del campione per l'analisi della citometria a flusso. Vengono descritti passaggi dettagliati per la stimolazione, l'etichettatura, la fissazione e la permeabilizzazione cellulare — dove necessario — in particolare. Infine, vengono descritte istruzioni per le impostazioni della citometria a flusso per identificare correttamente la popolazione piastrinica e analizzare gli eventi TF-positivi. Infine, il metodo include la procedura per preparare il PRP se si devono misurare piastrine TF-positive in piastrine isolate. Poiché solo un sottoinsieme di piastrine contiene TF, è importante assicurarsi che queste piastrine non vengano perse durante le fasi di centrifugazione necessarie per ottenere il PRP.

Introduzione

Il fattore tissutale (TF), una glicoproteina transmembrana e attivatore chiave della cascata di coagulazione del sangue, è espresso da un sottoset, ~20%-30%, delle piastrine umane^{circolanti 1}, in particolare quelle con dimensioni^{maggiori 2}. Attivando da parte di agonisti piastrinografici classici come adenosina difosfato (ADP) e trombina, le piastrine espongono TF funzionalmente attivo sulla superficie in modo dipendente dalla concentrazione, permettendo loro di legarsi al fattore VII/VIIa, portando infine alla generazione ^{di trombina} 1,3,4,5,6. In particolare, in condizioni patologiche come la malattia coronarica (CAD⁾⁷, l'infezione da sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus-2 (SARS-CoV-2^{) 8}, emicrania con aura associata al forame ovale patentato (MHA-PFO⁾⁹, il cancro¹⁰ e la sepsi¹¹, il numero di piastrine TF-positive aumenta significativamente, contribuendo al maggiore rischio trombotico osservato in questi contesti clinici.

Nonostante queste prove convincenti, la rilevazione delle piastrine TF-positive rimane oggetto di dibattito all'interno della comunità^{scientifica 6,12,13}. Sono state suggerite sfide metodologiche, tra cui variabili pre-analitiche, preparazione del campione e specificità degli anticorpi, come possibili ragioni per i risultati contraddittori riportati^{in letteratura} 2,4,12,14. Pertanto, è fondamentale stabilire un saggio standardizzato basato su un protocollo ben definito per la misurazione della TF nelle piastrine umane.

In questo contesto, la citometria del flusso sanguigno totale è l'unica tecnologia che consente l'analisi delle piastrine TF-positive con una gestione minima del campione, fondamentale per evitare la perdita di questo sottoinsieme piastrinico.

In questo articolo proponiamo un protocollo per misurare la TF associata alle piastrine utilizzando la citometria del flusso sanguigno totale, valutando la proteina (1) intracellularmente in condizioni di riposo e (2) sulla superficie cellulare sia in condizioni di riposo che attivate. Vengono inoltre fornite istruzioni se è necessaria la valutazione delle piastrine TF-positive nel plasma ricco di piastrine (PRP).

Protocollo

Il protocollo fu approvato dal Comitato Etico dell'Istituzione (n.70/24, CE 18.06.24), e fu ottenuto il consenso informato scritto da tutti i donatori di sangue. Il protocollo guiderà l'utente attraverso sette fasi principali (Figura 1). Il primo passo riguarda la procedura per il prelievo di sangue. I passaggi 2 e 3 illustrano il protocollo di titolazione degli anticorpi e la preparazione del campione per l'analisi dell'espressione intracellulare di TF utilizzando un anticorpo monoclonale (mAb) marcato con ficoeritrina (PE) con αCD142/HTF1. Il passaggio 4 descrive il protocollo per valutare la proteina esposta sulla superficie delle piastrine utilizzando un metodo di colorazione indiretta con αCD142/HTF1 mAb. A causa dell'ostacolo sterico del fluorocromo, l'mAb marcato con PE utilizzato per la colorazione intracellulare non si lega al dominio catalitico della proteina esposta in superficie. Pertanto, viene proposto un protocollo per la colorazione indiretta con un mAb secondario marcato con Alexa Fluor 633. I passaggi 5 e 6 dettagliano le fasi dell'analisi della citometria a flusso. L'ultimo passaggio delinea la procedura per preparare il plasma ricco di piastrine (PRP) per evitare la perdita della sottopopolazione piastrinica di grandi dimensioni. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Ritiro di sangue

NOTA: Il prelievo del sangue umano deve essere effettuato solo dopo aver ottenuto l'approvazione del Comitato Etico.

1. Prelevare campioni di sangue tramite vena periferica o cannula a ago da un braccio non colpito da infusioni venose periferiche, preferibilmente dalla vena antecubitale.
   1. Per il campionamento venoso periferico, applicare il laccio emostatico e, dopo aver inserito un ago a farfalla G19 nella vena, rimuoverlo per prevenire l'attivazione delle piastrine (Figura 2).
      NOTA: Non usare un ago a farfalla più piccolo di G21 per evitare l'attivazione delle piastrine.
   2. Per il campionamento venoso con una cannula ad ago, non applicare mai il laccio emostatico durante il campionamento. Se necessario, lava il campione con soluzione salina allo 0,9% prima di prenderlo. Elimina sempre i primi 5 mL di sangue prima di iniziare a riempire i tube.
2. Preleva 2 mL di sangue in un aspiratore EDTA (da usare per il conteggio delle cellule del sangue). Mescola delicatamente il tubo tre volte per assicurarti una completa miscelazione di sangue e anticoagulante.
3. Prelevare sangue in un vacutainer di citrato di sodio 0,129 M per l'analisi dell'espressione della TF associata alle piastrine. Riempi con cura il vuoto al livello indicato per mantenere il corretto rapporto sangue/anticoagulante. Invertire delicatamente i tubi cinque volte per garantire una completa miscelazione del sangue con l'anticoagulante, prevenendo la formazione di coaguli e l'emolisi dei campioni.
   NOTA: Si raccomanda l'uso dell'anticoagulante 0,129 M citrato per ottimizzare la rilevazione della TF associata a piastrine con il clone HTF1 dell'αCD142 mAb. Se è necessario isolare le piastrine dal sangue intero, prelevare un secondo vacutainer di citrato di sodio 0,129 M per la preparazione del plasma ricco di piastrine (PRP).
4. Tieni gli aspirapolvere in posizione verticale in un supporto per tubo. Non scuoterli su piastre rotanti o inclinabili ed evita i sistemi di trasporto pneumatici. Non mettere in frigorifero i campioni di sangue per prevenire l'attivazione delle piastrine.
   NOTA: I campioni di sangue dovrebbero preferibilmente essere processati entro 15 minuti dal ritiro se si vuole misurare un altro marcatore di attivazione piastrinica associato ai granuli insieme alla TF. Altrimenti, i campioni devono essere processati entro 3 ore dalla raccolta (Figura 3).

2. Titolazione dell'anticorpo anti-TF (per la valutazione intracellulare della TF)

NOTA: La determinazione della TF immagazzinata intracellularmente viene effettuata utilizzando il PE-αCD142/HTF1 mAb.

1. Titolazione degli anticorpi tramite perle
   NOTA: L'uso delle sfere consente di definire la quantità corretta di anticorpi da utilizzare (cioè la concentrazione di anticorpi che produce la massima separazione dei picchi di fluorescenza tra campioni positivi e negativi). Questa analisi viene effettuata utilizzando due campioni, uno veramente positivo e uno veramente negativo. La concentrazione di anticorpi non viene riportata dal produttore (vedi Tabella dei materiali), quindi la titolazione degli anticorpi viene effettuata utilizzando cinque punti di diluizione.
   1. Centrifuga l'anticorpo a 17.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Per preparare i cinque punti di diluizione degli anticorpi, pipettare 40 μL di anticorpi nel tubo 1 e 20 μL di PBS nei tubi da 2 a 5. Effettuare quattro diluizioni serie consecutive 1:2 trasferendo 20 μL dal tubo 1 al tubo 2 e successivamente in seguito.
   2. Prepara una provetta per ogni volume di anticorpi da testare. Aggiungi una goccia di sfere negative e una goccia di sfere positive a ogni provetta. Aggiungere immediatamente 20 μL di ciascuna diluizione di anticorpi alla provetta e formare un vortice. Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 minuti.
   3. Aggiungi 1 mL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a ogni tubo e vortice.
   4. Acquisire i campioni sul citometro di flusso secondo le istruzioni del produttore e registrare un file dati di 10.000 eventi nella porta delle "perle". La concentrazione ottimale di anticorpi è quella che fornisce la maggiore separazione tra picchi positivi e negativi.
2. Titolazione degli anticorpi sulle piastrine
   NOTA: Di norma, la concentrazione ottimale di anticorpi identificata tramite le sfere deve essere verificata sulle cellule da colorare - in questo caso, piastrine nel sangue intero.
   1. Fissazione
      1. Inverti delicatamente il vuoto di citrato di sodio cinque volte per mescolare bene sangue e anticoagulante. Trasferire 50 μL di sangue in un tubo da 1,5 mL, aggiungere 950 μL di paraformaldeide (PFA) all'1%, mescolare delicatamente e incubare il campione per 90 minuti a temperatura ambiente.
      2. Centrifuga il campione a 1.500 x g per 5 minuti, con freno, a temperatura ambiente.
      3. Rimuovi il sovrantato e risospezioni il pellet pipettando delicatamente 1 mL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg^++, pH 7,4.
   2. Permeabilizzazione
      1. Prepara un tubo per ciascun volume di anticorpo da testare (testare il volume identificato con la titolazione delle sfere insieme a una diluizione superiore e una inferiore, ad esempio 10 μL, 5 μL, 2,5 μL se il volume identificato è 5 μL) e un tubo per il controllo Fluorescenza Meno Uno (FMO).
      2. Somministra 100 μL di sangue fisso in ogni tubo e centrifugali a 1.500 x g per 5 minuti, con freno, a temperatura ambiente.
      3. Rimuovere il soprantantante, risospendere il pellet in 100 μL di 0,1% di Triton-PBS per permeabilizzare i campioni e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   3. Colorazione
      1. Centrifugare l'anticorpo a 17.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Aggiungere i volumi di anticorpi necessari a ciascun provettato come determinato in 2.2.2.1 e mescolare.
      2. Incubare i campioni per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
      3. Aggiungi 300 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a ogni tubo e mescola. Acquisire i campioni sul citometro di flusso (vedi passo 5).
      4. Calcola l'indice di colorazione secondo la seguente formula¹⁵:
                                
         dove MFI_pos è l'intensità media di fluorescenza degli eventi positivi, MFI_negativo è quello degli eventi negativi, e SD è la deviazione standard della popolazione negativa.
      5. Scegli la concentrazione di anticorpi più bassa che fornisce il più alto indice di colorazione.
         NOTA: Nelle attuali condizioni sperimentali, l'indice di colorazione più alto per il PE-αCD142/HTF1 mAb si ottiene utilizzando 5 μL di anticorpi.

3. Preparazione del campione per l'analisi della citometria a flusso dell'espressione intracellulare di TF

1. Fissazione del sangue intero e permeabilizzazione
   1. Per l'analisi intracellulare della TF, fissare e permeabilizzare il sangue intero secondo la procedura descritta nel passo 2.
2. Procedura di colorazione
   NOTA: Nel protocollo seguente, la popolazione piastrinica viene identificata tramite colorazione αCD61-PerCP. Altri marcatori di popolazione possono essere utilizzati a discrezione dell'operatore.
   1. Prepara un tubo per il controllo Fluorescence Minus One (FMO) e un tubo per la colorazione TF. Aggiungere 100 μL di sangue intero fisso e permeabilizzato a ciascun tubo insieme agli anticorpi elencati nella Tabella 1.
   2. Incubare i campioni per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
   3. Aggiungi 300 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a ogni tubo e mescola. Conservare i campioni colorati al buio fino all'analisi citometrica del flusso (vedi passo 5).
      NOTA: Per calcolare la matrice di compensazione, preparare i campioni come descritto nella Tabella 2.

4. Preparazione del campione per l'analisi della citometria di flusso dell'espressione di TF associata alla superficie cellulare nelle piastrine a riposo e attivate

NOTA: Per la rilevazione della TF associata alla superficie cellulare, utilizzare come anticorpo secondario per la rilevazione del segnale αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) non marcato e Alexa Fluor 633 anti-goat anti-mouse (2 mg/ml). L'adenosina 5'-difosfato (ADP) viene utilizzata come agonista piastrinico per indurre l'esposizione della TF sulla superficie cellulare. Un anticorpo marcato con PE viene utilizzato come marcatore della popolazione piastrinica per minimizzare lo spillover, che verrà controllato tramite compensazione del segnale.

1. Colorazione TF
   1. Diluire αCD142/HTF1 mAb 1:100 in 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, per ottenere una concentrazione operativa di 10 μg/mL. Diluire Alexa Fluor 633 anti-topo IgG 1:10 in 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, per ottenere una concentrazione operativa di 200 μg/mL.
   2. Preparare i tre tubetti campione e dispensare 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, come indicato nella Tabella 3.
   3. Somministrare 7,5 μL di αCD142/HTF1 mAb diluito e aggiungere 5 μL di ADP (200 μM) per ottenere una concentrazione finale di 10 μM di ADP. Inverti delicatamente il vuoto di citrato 5 volte per mescolare bene sangue e anticoagulante, poi somministra 5 μL di sangue intero in ogni tuba. Mescola delicatamente i campioni.
   4. Incubare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente.
2. Fissazione del campione
   1. Fissare ogni campione aggiungendo 300 μL di paraformaldeide (PFA) all'1% e incubare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente.
      NOTA: I campioni marcati, fissati con PFA all'1% e conservati a 4 °C, rimangono stabili fino a 4 giorni.
   2. Aggiungi 300 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a ciascun tubo e centrifuga a 1500 x g per 5 minuti con il freno a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet a 95 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, pipettando delicatamente.
3. Colorazione con l'anticorpo secondario
   1. Somministrare 5 μL di Alexa Fluor 633 IgG diluito e incubare i campioni per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
   2. Aggiungi 300 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a ciascun tubo e centrifuga a 1500 x g per 5 minuti con il freno a temperatura ambiente. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet a 95 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4.
   3. Dispensare 5 μL di αCD41-PE in ciascun tubo (vedi Tabella 4). Incubare i campioni per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
   4. Aggiungi 300 μL di 1x PBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a ogni tubo e mescola.
   5. Conservare i campioni colorati al buio fino all'analisi della citometria a flusso (vedi passo 6).
      NOTA: Per calcolare la matrice di compensazione, preparare i campioni secondo i Passaggi 4.1-4.3 e come delineato nelle Tabelle 5 e 6.

5. Analisi della citometria a flusso dell'espressione intracellulare di TF

NOTA: La seguente procedura si riferisce alle acquisizioni su un citometro di flusso di riferimento; Pertanto, le ambientazioni e i grafici riportati dovrebbero essere considerati rappresentativi. Il protocollo può essere applicato a qualsiasi citometro a flusso di nuova generazione ad alta sensibilità. Accendi il citometro di flusso ben prima dell'acquisizione del campione per garantire la stabilità del laser. Lava accuratamente la fluidica e la cella di flusso, poiché le piastrine sono piccole e eventuali detriti cellulari possono interferire con la visualizzazione della popolazione piastrinica nell'area di scattering frontale/area di dispersione laterale (FSC-A/SSC-A). Esegui il controllo qualità con le perline QC secondo le istruzioni del produttore e lava nuovamente i fluidici per rimuovere eventuali residui di perla.

1. Configurazione dell'acquisizione
   1. Crea un grafico di punti FSC-A/SSC-A su scala logaritmica che mostri tutti gli eventi (Figura 4A). Crea un grafico di punti CD61-A/SSC-A su scala logaritmica che mostra tutti gli eventi (Figura 4B).
   2. Regola il guadagno di PE (Y-585) e PerCP (B690) in base al controllo qualità giornaliero. Imposta la soglia approssimativamente a 2000 per SSC-H e a 1000 per PerCP (B690-H) per visualizzare la popolazione piastrinica. Imposta la portata su BASSO.
   3. Disegna una regione tra 10³ e 10⁵ chiamata "CD61⁺" per identificare la popolazione piastrinica.
   4. Acquisire controlli a singola colorazione per calcolare la matrice di compensazione e poi acquisire i campioni. Registra un file dati di 10.000 eventi all'interno della porta "CD61⁺" (Figura 4D,E). Inizia a registrare 5-10 secondi dopo l'inizio dell'acquisizione del campione.

6. Analisi della citometria a flusso dell'espressione TF superficiale

1. Realizzare un grafico dei punti FSC-A/SSC-A su scala logaritmica che mostra tutti gli eventi (Figura 5A) e un grafico di punti CD41-A/SSC-A su scala logaritmitica che mostra tutti gli eventi (Figura 5B).
2. Regola il guadagno di Alexa Fluor 633 e il guadagno di PE (Y-585) secondo il controllo qualità giornaliero, imposta la soglia approssimativamente a 1000 su SSC-H e a 2500 su PE (Y585-H) per visualizzare la popolazione piastrinica come mostrato nella Figura 5B. Imposta la portata su BASSO.
3. Disegna una regione tra 10⁴ e 10⁵ chiamata "CD41⁺" per identificare la popolazione piastrinica.
4. Acquisire controlli a singola colorazione per calcolare la matrice di compensazione e poi acquisire i campioni. Registra un file dati di 10.000 eventi all'interno della porta "CD41⁺" (Figura 5D,E). Inizia a registrare 5-10 secondi dopo l'inizio dell'acquisizione del campione.

7. Analisi delle piastrine TF-positive in plasmi ricchi di piastrine

1. Preparazione del plasma ricco di piastrine (PRP)
   NOTA: L'isolamento delle piastrine deve essere effettuato a temperatura ambiente per prevenire l'attivazione cellulare. Assicurati che la temperatura dei reagenti e degli strumenti sia compresa tra 18 °C e 22 °C. Evita pipetare velocemente e scuotere vigorosamente durante tutta la procedura.
   1. Mescola delicatamente il vacutainer di citrato di sodio 0,129 M 5 volte e misura due volte il conteggio delle piastrine su un contatore di globuli sanguigni per calcolare la percentuale di piastrine recuperate.
      NOTA: Utilizzare il valore medio delle due determinazioni come concentrazione piastrinica.
   2. Centrifugare il vuoto di citrato di sodio a 0,129 M a 100 x g per 10 minuti, senza freno, a temperatura ambiente (Figura 6). Raccogliere il PRP ottenuto, trasferirlo in un tubo di polipropilene da 10 mL e registrare il volume raccolto.
      NOTA: Non usare tubi di polistirene per evitare l'attivazione delle piastrine.
   3. Contare le piastrine due volte nel PRP utilizzando un contatore di globuli del sangue e calcolare la percentuale di recupero piastrino come segue:
      
      NOTA: Se il recupero è inferiore al 65%, la popolazione piastrinica non rappresenta pienamente quella del sangue totale. Considera di abbandonare la preparazione.
2. Preparazione del campione per l'analisi della citometria di flusso dell'espressione intracellulare e di TF associata alla superficie nel PRP
   1. Per analizzare l'espressione di TF intracellulare e associata alla superficie nel PRP, utilizzare lo stesso protocollo descritto per l'analisi del sangue totale (vedi passaggi 3-6).

Risultati

Un riassunto dell'analisi dell'espressione TF associata a piastrine è descritto nel diagramma di flusso mostrato in Figura 1. I passaggi includono: (1) Raccolta del sangue: Raccogliere sangue dalla vena periferica umana, preferibilmente dalla vena antecubitale, utilizzando un ago a farfalla G19 o una cannula a ago senza laccio emostatico e con vacuatori contenenti anticoagulanti. (2) Elaborazione dei campioni: Elaborare i campioni in base al tipo di valutazione TF da eseguire. (3) Etichettatura dei campioni: Etichettare i campioni con anticorpi specifici. (4) Analisi della citometria a flusso: Analizzare i campioni per rilevare TF superficiali e intracellulari.

Durante il prelievo del sangue, bisogna prestare particolare attenzione per evitare l'attivazione delle piastrine. A tal fine, si osservano due precauzioni: rimuovere il laccio emostatico poco dopo aver inserito l'ago nella vena e scartare il sangue nel primo aspiratore estratto. Senza l'uso del laccio emostatico, la popolazione piastrinica, mostrata in un grafico FSC-A/SSC-A, ha una forma tipica, come mostrato nella Figura 2A. Al contrario, con l'uso del laccio emostatico, le proprietà fisiche della popolazione piastrinica producono una forma allungata che ricorda la morfologia osservata dopo la stimolazione con un agonista piastrinico classico, come ADP (Figura 2B,C).

Esperimenti condotti per valutare la stabilità dell'espressione della TF associata a piastrine nel tempo hanno mostrato che è rimasta stabile per 3 ore dalla prelievo del sangue (Figura 3). Quando si combina la misura dell'espressione di TF con quella di un marcatore di attivazione piastrinica, come la P-selectina, si consiglia di processare il campione di sangue il prima possibile per evitare la degranulazione piastrinica.

Per l'analisi della TF immagazzinata intracellulare, il sangue intero viene fissato nell'1% di PFA, permeabilizzato con PBS-Triton e poi colorato con un anticorpo marcato con PE. La popolazione piastrinica è identificata su un grafico logaritmico FSC-A/SSC-A (Figura 4 A,D) e tramite colorazione αCD61 mAb (Figura 4 B,E). I risultati dell'analisi della TF intracellulare in soggetti sani (n = 377) indicano che la TF è presente nel 26,8% ± 4,8% delle piastrine circolanti (Figura 4F).

L'analisi della citometria a flusso dell'espressione di TF associata alla superficie è stata effettuata in condizioni di riposo e dopo stimolazione cellulare con ADP 10 μM. La popolazione totale di piastrine ematiche, marcata con αCD41 mAb, è stata identificata su un grafico logaritmico FSC-A/SSC-A (Figura 5A,B). I risultati hanno mostrato che nei soggetti sani (n = 377), la TF è espressa dal 2,8% ± dall'1,4% delle piastrine a riposo (Figura 5D-F) e aumenta fino al 24,5% ± 5,8% all'attivazione (Figura 5G-I). TF è espressa dal sottoinsieme delle piastrine con la dimensione più grande (Figura 5D,G, punti verdi). Inoltre, l'analisi tramite citometria di flusso di imaging evidenzia che il segnale TF è associato solo a eventi positivi a αCD61 e non a eventi positivi a αCD45 (Figura 7).

Come già accennato, la TF è immagazzinata in un sottoinsieme di piastrine caratterizzate dalla dimensione più grande all'interno dell'intera popolazione. Pertanto, è importante non perdere questa frazione piastrinica durante la preparazione del PRP. Seguendo le indicazioni fornite nella sezione metodico (passo 7), è possibile isolare una popolazione piastrinica all'interno del PRP che sia rappresentativa di quella presente nel sangue totale. Come mostrato nella Figura 6, il grafico a punti della citometria di flusso della popolazione piastrinica ottenuta tramite centrifugazione di 100 x g del sangue intero è molto simile a quello del sangue totale in termini di distribuzione delle FSC (Figura 6 A,B). Al contrario, utilizzando una forza maggiore e tempi di centrifugazione più lunghi, come spesso riportato nella^letteratura 12,14,16, la popolazione piastrinica recuperata presenta una FSC inferiore rispetto a quella del sangue intero (Figura 6C), suggerendo la perdita delle piastrine di dimensioni maggiori, cioè quelle altamente TF-positive.

Figura 1: Diagramma schematico per l'analisi dell'espressione TF associata a piastrine e l'isolamento piastrino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Grafici di densità rappresentativa della popolazione piastrinica analizzati tramite citometria del flusso sanguigno totale. (A) Popolazione piastrinica analizzata in un campione di sangue prelevato senza laccio emostatico o (B) con il laccio emostamico. (C) La popolazione piastrinica stimolata con ADP è riportata per il confronto. WBC: Globuli Bianchi; RBC: Globuli rossi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Stabilità dell'espressione di TF associata alla superficie cellulare nel tempo. L'espressione della TF associata a piastrine a riposo è stata analizzata in 4 diversi momenti temporali dopo il prelievo ematico riportata nell'asse x come segue: T0 = immediatamente dopo il prelievo di sangue; T1 = 1 ora dopo il prelievo di sangue; T2 = 2 ore dopo il prelievo del sangue; T3 = 3 ore dopo il prelievo di sangue. I dati sono riportati come media ± SD, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso della TF immagazzinata intracellularmente. La popolazione piastrinica (rossa) nel sangue intero è identificata nel grafico dei punti FSC/SSC-A (A,D) e tramite colorazione αCD61 mAb (B,E). L'espressione della TF viene analizzata utilizzando un mAb PE- αCD142/HTF1 (punti verdi). I grafici istogrammatici sono utilizzati per identificare eventi negativi (C) e positivi (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle piastrine TF-positive associate alla superficie. Il sangue integrale fresco viene marcato con αCD142/HTF1 mAb, poi fissato con PFA all'1% e marcato con il mAb secondario e l'αCD41 mAb. La popolazione piastrinica (rossa) nel sangue intero è identificata nel dot plot FSC/SSC-A (A, D, G) e tramite colorazione αCD41 mAb (B,E,H). L'espressione di TF in condizioni di riposo (D-F) e dopo stimolazione ADP (G-I) viene quantificata tramite marcatura con αCD142/HTF1 mAb (punti verdi). Vengono riportati grafici istografici rappresentativi di campioni negativi (C) e positivi (F,I). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Effetto delle diverse forze di centrifugazione sulla preparazione del PRP. (A-C) Analisi citometrica a flusso della popolazione piastrinica nel sangue intero, PRP preparato a 100 x g e a 350 x g. L'intervallo di riferimento della popolazione piastrinica su FSC-H/SSC-H è indicato da linee tratteggiate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Valutazione dell'espressione di TF nelle piastrine e nei leucociti tramite citometria di flusso per imaging. Sono mostrate immagini rappresentative del campo chiaro (BF, grigio), fattore tissutale (TF, verde), αCD61 (rosso), αCD45 (grigio), colorazione dei nuclei con Hoechst (magenta) e l'immagine composita (fusione), acquisita a ingrandimento 60x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ID del tubo campione	Fissaggio/permanente del sangue intero (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tabella 1: Protocollo di colorazione per l'analisi della citometria a flusso dell'espressione intracellulare di TF.

ID del tubo campione	Fissaggio/permanente del sangue intero (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Senza macchie	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tabella 2: Controllo a una singola colorazione per la matrice di compensazione dell'espressione intracellulare della TF.

ID del tubo campione	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sangue fresco intero (μL)	PFA 1% (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Riposo	87.5	7.5	-	5	300
ADP attivato	82.5	7.5	5	5	300

Tabella 3: Protocollo di colorazione per l'analisi della citometria di flusso dell'espressione superficiale della TF.

ID del tubo campione	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Riposo	90	5	5
ADP attivato	90	5	5

Tabella 4: Protocollo secondario di colorazione degli anticorpi per l'analisi TF associata alla superficie.

ID del tubo campione	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sangue fresco intero (μL)	PFA 1% (μL)
Senza macchie	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tabella 5: Preparazione della matrice di compensazione per l'analisi intracellulare TF.

ID del tubo campione	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Senza macchie	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tabella 6: Preparazione della matrice di compensazione per l'analisi TF associata alla superficie.

Discussione

Questo manoscritto riporta protocolli dettagliati per la valutazione delle piastrine TF-positive tramite citometria del flusso sanguigno totale, tenendo conto dell'analisi della proteina espressa sia all'interno che sulla superficie piastrina.

Negli ultimi 20 anni, la presenza di TF nelle piastrine umane è stata ben^consolidata 1,2,3,4,5,17,18. Un sottoinsieme di piastrine, che rappresenta il 20%-30% della popolazione totale di piastrine^{circolanti 2}, esprime la proteina, rafforzando il concetto di eterogeneità piastrinica che sta diventando sempre più rilevante nel campo^19,20. Vale la pena menzionare che le piastrine TF-positive hanno un volume medio piastrino elevato, come precedentemente dimostrato dalla citometria a flusso di imaging^{altamente sensibile 2}. È di cruciale importanza considerare questa caratteristica, specialmente quando l'espressione di TF deve essere analizzata nelle piastrine isolate dagli altri componenti delle cellule del sangue. È possibile, infatti, che la fase di centrifugazione utilizzata per l'isolamento delle piastrine possa causare la perdita di piastrine^{di grandi dimensioni 2}. Questa questione pre-analitica è probabilmente uno dei principali motivi della controversia - durata fino a pochi anni fa - sulla presenza di TF nelle^{piastrine 7, 12, 13}. La citometria del flusso sanguigno totale è un approccio estremamente utile in questo senso, permettendo l'analisi di tutti i sottoinsiemi piastrini senza la necessità di isolarli.

Un secondo motivo che ha alimentato la discussione sulla presenza di TF nelle piastrine è stata la scelta dell'anticorpo anti-umano contro TF utilizzato per l'analisi. Esistono molti anticorpi disponibili in commercio che sono stati utilizzati per la valutazione della TF associata a piastrine e che riconoscono diversi epitopi della proteina. Alcuni anticorpi, come i cloni TF9-10H10 3,21,22 e ^{VIC7 1,3}, si legano a una regione non funzionale della TF senza influenzare il legame FVII/FVIIa. Altri anticorpi, inclusi i cloni^{VD8 1,2,3} e^{HTF11 18} - questi ultimi utilizzati nei protocolli attuali - riconoscono il sito catalitico della proteina, competendo con FVII/FVIIa per il legame a TF, bloccandone così la funzione procoagulante. È importante notare che, a seconda dello stato di glicosilazione del dominio extracellulare e della conformazione del sito catalitico di TF²³, che potrebbe essere modificato in condizioni particolari (come attivazione cellulare o malattia), alcuni di questi anticorpi potrebbero essere in grado di riconoscere differenzialmente, tramite citometria di flusso, l'espressione superficiale della TF associata a piastrine. Inoltre, anche le condizioni di colorazione, cioè se il campione da analizzare sia fresco, fisso e/o permeabilizzato, potrebbero influenzare la conformazione dell'epitopo e, di conseguenza, il legame^{antigene-anticorpo 14}.

Un'ulteriore considerazione che merita attenzione è la scelta del fluorocromo legato all'anticorpo. Poiché la TF è espressa solo dal 20%-30% della popolazione piastrinica, i fluorocromi a bassa emissione, insieme all'uso di citometri a flusso a bassa sensibilità, potrebbero non essere adatti a discriminare segnali positivi bassi. Per questo motivo, sono preferiti anticorpi marcati con fluorocromi brillanti, come PE o APC. È importante notare, tuttavia, che le grandi dimensioni di un fluorocromo come il PE possono ostacolare il legame dell'anticorpo marcato alla^{proteina 24}. Per superare questo problema, nel protocollo attuale, la colorazione superficiale con TF è stata eseguita come un'etichettatura indiretta con un αCD142/HTF1 mAb non coniugato, poi rivelata tramite l'uso di un anticorpo secondario. L'ostacolo PE-sterico non influisce sul legame di αCD142/HTF1 mAb alla TF immagazzinata intracellulare, dove il sito catalitico è più accessibile al legame degli anticorpi. È chiaro che la valutazione dell'espressione superficiale della TF associata alle piastrine tramite marcatura diretta, rispetto a quella indiretta, sarebbe preferibile - se possibile - per ridurre i tempi di lavorazione del campione. Questo approccio, tuttavia, deve tenere conto delle questioni critiche sopra menzionate e relative alla capacità di legame dei diversi anticorpi commercialmente disponibili contro la TF piastrinica, dovuta alla conformazione della proteina stessa, o alle condizioni di colorazione, nonché all'ostacolo sterico dei diversi fluorocromi utilizzati. Pertanto, per evitare risultati falsi negativi, l'etichettatura diretta della TF piastrina associata a espressione superficiale richiede un processo di ottimizzazione accurato e obbligatorio. Questi aspetti sono oggetto di uno studio in corso volto a valutare l'efficienza della colorazione diretta con i diversi cloni di anticorpi commercialmente disponibili etichettati con fluorocromi all-in uso.

Diversi studi hanno mostrato che l'espressione di TF è elevata in varie condizioni patologiche caratterizzate da un alto rischio^trombotico 8,9,10,11,17. Recentemente, sono state fornite evidenze che i livelli di piastrine TF-positive e quantificati accuratamente tramite analisi citometrica a flusso, possono identificare pazienti cardiovascolari che, nonostante una risposta ottimale al trattamento farmacologico con aspirina e antagonisti P2Y₁₂, mantengono un alto rischio^{trombotico 25}. Infatti, la TF associata alle piastrine è funzionalmente attiva e quindi potenzialmente in grado di sostenere la generazione di ^{trombine 1,3,4}. In questo contesto, la capacità di eseguire un'analisi di citometria a flusso su pochi microlitri di sangue è un vantaggio significativo che consente di estendere l'analisi TF associata a piastrine al contesto clinico. A tal fine, vale la pena menzionare che la validazione della misurazione della TF associata a piastrine tramite citometria a flusso è stata l'obiettivo di un progetto internazionale che abbiamo recentemente coordinato, con il supporto della International Society of Haemostasis and Thrombosis, per fornire indicazioni metodologiche per la sua valutazione.

A differenza di altri marcatori classici dell'attivazione piastrinica, come la P-selectina e gli aggregati piastrino-leucociti, che devono essere analizzati immediatamente dopo il prelievo di sangue per evitare artefatti, l'espressione di TF è molto più stabile. Infatti, il campione di sangue può essere elaborato entro poche ore dopo il prelievo senza alcun cambiamento significativo nell'espressione delle piastrine TF; Inoltre, la possibilità di fissare il campione e di etichettarlo/processarlo successivamente rende questa analisi adatta a molti ospedali/laboratori. È degno di nota che, sebbene il protocollo descritto in questo manoscritto sia relativamente semplice da eseguire, la tecnica della citometria a flusso richiede comunque una formazione tecnica specializzata. Per questo motivo, la tecnologia si sta muovendo verso lo sviluppo di citometri sempre più semplici destinati ai test al punto di cura.

In conclusione, il protocollo proposto fornisce metodi per l'analisi corretta della TF associata a piastrine, sottolineando i vantaggi di una tecnica basata sull'analisi della citometria di flusso per la sua determinazione. Inoltre, evidenzia le variabili pre-analitiche che possono influenzare l'analisi di questa proteina, sottolineando le misure da adottare per evitarle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenosina 5'-difosfato (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	Agonista delle piastrine
Alexa Fluor 633 capra α-mouse IgG	Invitrogen	A21052	Anticorpo secondario
Biotubo 10 mL	Biosigma	BSP048	Per la raccolta PRP
Ago Farfalla G19	Soluzione PIC	02044019030010	Per la prelieva ematica
CytExpert Software	Beckman Coulter		Analisi dei dati della citometria a flusso
Cytoflex S	Beckman Coulter		Citometro a flusso
Tubi Eppendorf 1,5 mL	Eppendorf	1,20,086	Fissazione del sangue
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Citometro di flusso a immagini
Kaluza Software	Beckman Coulter		Analisi dei dati della citometria a flusso
Paraformaldeide	Antibioticos e ndash; Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Per sistemare sangue e piastrine
PerCP-& alpha; CD45	BD	345809	Marcatore della popolazione leucocitaria
PerCP-& alpha; CD61	BD	347408	Marcatore di pollazione piastrinica
PE-α CD142	BD	550312	Anticorpo anti-fattore tessutale umano
PE-α CD41	Beckman Coulter	A07781	Marcatore di pollazione piastrinica
Soluzione salina tampone di fosfato (PBS) 1x senza calcio e magnesio	Gibco	10010-015	Per anticorpi e diluizione del campione
Punte per pipette 10 & micro; L	Gilson	F161630	Per preparare i campioni
Punte per pipette 1000 & micro; L	Gilson	F161670	Per preparare i campioni
Punte per pipette 200 & micro; L	Gilson	F161930	Per preparare i campioni
Tubo a fondo rotondo 5 mL	Corning	352052	Per l'acquisizione del citometro a flusso
Cloruro di sodio 0,9%	BD	306575	Per lavare la cannula a ago dopo il prelievo ematico
Sysmex XN-450	Dasit		Analizzatore di cellule del sangue
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Per permeabilizzare la membrana delle cellule sanguigni
Tubi di citrato di vacuainer 0,129M	BD	363079	Per la raccolta del sangue
Tubi Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	Per la raccolta del sangue
Adattatore Luer a campione multiplo Vacutainer	BD	367300	Per la prelieva ematica
Portaaspirapolvere monouso	BD	364815	Per la prelieva ematica
Kit per perline di cattura anticorpi Versacomp	Beckman Coulter	B22804	Titolazione degli anticorpi
α CD142 (clone HTF-1)	Invitrogen	16-1429-82	Anticorpo anti-fattore tessutale umano