Articolo metodologico

Interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA

DOI:

10.3791/67360

⸱

4 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

In questo articolo

Sommario

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Qui viene presentato un protocollo per la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nelle larve di Bombyx mori del baco da seta per indurre il silenziamento genico attraverso l'ingestione.

Abstract

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Il baco da seta, Bombyx mori, è un importante insetto economico con migliaia di anni di storia in Cina. Nel frattempo, il baco da seta è l'insetto modello dei lepidotteri con un buon accumulo di ricerche di base. È anche il primo insetto nei lepidotteri con il suo genoma completo sequenziato e assemblato, che fornisce una solida base per lo studio della funzionalità genica. Sebbene l'interferenza dell'RNA (RNAi) sia ampiamente utilizzata nello studio funzionale dei geni inversi, è refrattaria nei bachi da seta e in altre specie di lepidotteri. Precedenti ricerche di successo relative all'RNAi per fornire RNA a doppio filamento (dsRNA) sono state eseguite solo attraverso l'iniezione. La somministrazione di dsRNA attraverso l'alimentazione non viene mai riportata. In questo articolo, descriviamo le procedure passo dopo passo per preparare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA, che vengono somministrate alle larve del baco da seta mediante ingestione. Il protocollo include (i) la selezione dello stadio corretto delle larve del baco da seta, (ii) la sintesi del dsRNA, (iii) la preparazione delle nanoparticelle di chitosano/dsRNA e (iv) l'alimentazione delle larve del baco da seta con nanoparticelle di chitosano/dsRNA. Vengono presentati risultati rappresentativi, tra cui la conferma del trascritto genico e l'osservazione del fenotipo. L'alimentazione del dsRNA è una tecnica semplice per l'RNAi nelle larve del baco da seta. Poiché le larve del baco da seta sono facili da allevare e abbastanza grandi da poter essere utilizzate, fornisce un buon modello per dimostrare l'RNAi larvale negli insetti. Inoltre, la semplicità di questa tecnica stimola un maggiore coinvolgimento degli studenti nella ricerca, rendendo le larve del baco da seta un sistema genetico ideale per l'uso in classe.

Introduzione

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Il baco da seta, Bombyx mori, è un insetto addomesticato più di 5000 anni fa in Cina. Grazie alla sua capacità di produrre seta, il baco da seta è un importante insetto economico nell'agricoltura e nella sericoltura cinesi. Il baco da seta è secondo solo al moscerino della frutta come insetto modello. Come insetto modello nei lepidotteri, il baco da seta è facile da allevare, con un corpo di grandi dimensioni e molti mutanti. Nel frattempo, il baco da seta è il primo insetto lepidottero con il suo genoma completo sequenziato1. Sono inoltre disponibili al pubblico molti database che forniscono informazioni per il genoma2, il trascrittoma3, il tag di sequenza espresso (EST)4, l'RNA5 non codificante e il microsatellite6 . I fatti di cui sopra rendono il baco da seta un modello perfetto per la ricerca genetica.

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un processo cellulare in cui le molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) si legano e tagliano l'RNA messaggero complementare (mRNA), ottenendo così l'effetto di silenziamento del gene bersaglio. Questo meccanismo è naturalmente presente nei batteri per difendersi dall'invasione dei virus7. Successivamente, si è scoperto che l'RNAi è conservato negli animali, nelle piante e nei microbi. Grazie al suo potente effetto di silenziamento sequenza-specifico, l'RNAi viene utilizzato nella ricerca fondamentale per manipolare l'espressione genica e studiare la funzione genica. L'RNAi si ottiene attraverso la consegna di dsRNA nelle cellule.

Negli insetti, ci sono tre modi comuni per fornire il dsRNA, che sono la microiniezione, l'alimentazione e l'ammollo8. Al momento, i rapporti di RNAi di successo nei bachi da seta attraverso la somministrazione di dsRNA nudi sono condotti mediante iniezione di dsRNA9. I vantaggi della microiniezione sono la somministrazione immediata di dsRNA nell'emolinfa e il controllo preciso della quantità di dsRNA. Tuttavia, esistono anche alcuni svantaggi della microiniezione. Ad esempio, richiede molto tempo e dispositivi delicati. È anche importante ottimizzare gli aghi per iniezione, il volume di iniezione e la quantità di dsRNA. Pertanto, diventa necessario un modo alternativo per veicolare il dsRNA ai bachi da seta. Poiché l'esoscheletro di un insetto è una barriera a tenuta stagna fatta di chitina, l'ammollo delle larve di insetti per ottenere l'RNAi è raramente segnalato, il che non è una buona opzione per l'RNAi negli insetti. L'alimentazione del dsRNA è a risparmio di manodopera, economica e facile da eseguire10. Questo metodo è applicabile anche per lo screening genico ad alto rendimento11. Tuttavia, si è scoperto che una nucleasi non specifica per DNA/RNA, vale a dire la BmdsRNasi, è presente nell'intestino medio e nel succo dell'intestino medio delle larve del baco da seta12. Questa nucleasi ha dimostrato di digerire il dsRNA, preferibilmente13. Pertanto, somministrare dsRNA nudo al baco da seta per silenziare l'espressione genica sembra essere difficile.

Recentemente, il dsRNA schermato con nanoparticelle si è dimostrato una buona alternativa per aumentare l'efficienza dell'RNAi alimentando14. Il chitosano è un polimero economico, non tossico e biodegradabile, che può essere preparato mediante deacetilazione della chitina, un biopolimero presente in natura e il secondo più abbondante dopo la cellulosa15. Poiché il gruppo amminico nel chitosano è caricato positivamente e il gruppo fosfato sulla spina dorsale del dsRNA è caricato negativamente, le nanoparticelle di chitosano/dsRNA potrebbero essere formate dall'autoassemblaggio di policationi16. Le nanoparticelle di chitosano/dsRNA sono efficaci nel raggiungere l'RNAi attraverso l'alimentazione larvale nelle zanzare Aedes aegypti e Anopheles gambiae17, nel verme macchiato di cotone Earias vittella18 e nel ragnetto carminio Tetranychus cinnabarinus19.

Al fine di sviluppare una metodologia per la somministrazione di dsRNA mediante l'alimentazione dei bachi da seta per ottenere un'efficienza RNAi di successo, questo rapporto si concentra sulla descrizione delle procedure passo-passo su come preparare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA e alimentare le nanoparticelle alle larve del baco da seta. Questa metodologia è relativamente economica, fa risparmiare manodopera ed è facile da seguire, e può essere adattata per studi di silenziamento genico in altri insetti. Il nostro obiettivo è quello di fornire un protocollo più semplice per il metodo di somministrazione del dsRNA dei lepidotteri con una maggiore efficienza dell'RNAi.

Protocollo

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1. Specie di bachi da seta e allevamento

  1. Allevare almeno 120 larve di baco da seta appena nate di 1° stadio del ceppo P50 di B. mori con foglie di gelso fresche a 25 ± 1 °C, fotoperiodo 12 h Luce: 12 h Buio e 75% ± 5% di umidità relativa.

2. Selezione delle larve di baco da seta

  1. Scegli il giorno 1 delle larve del 5° stadio per l'esperimento RNAi; Le larve del baco da seta crescono velocemente dopo il giorno 3 del 5° stadio , il che è l'ideale per confrontare le differenze nell'aspetto larvale.
    NOTA: In alternativa, gli stadi più giovani, come il 3° o il 4° stadio , potrebbero essere utilizzati per l'esperimento RNAi. Tuttavia, richiede un trattamento costante con dsRNA fino al 5° stadio , che è relativamente costoso e costoso in termini di materiale.

3. Sintesi del dsRNA

  1. Identificazione del frammento bersaglio del dsRNA: selezionare la sequenza codificante di un gene bersaglio e allinearla con altri geni omologhi per determinare la regione conservata. Progettare primer gene-specifici nella regione non conservata per la successiva amplificazione del frammento bersaglio del dsRNA. Per gli esperimenti di RNAi negli insetti, il tipico frammento bersaglio del dsRNA è generalmente di 400-600 bp. La dimensione minima potrebbe essere di 200 bp.
    NOTA: Per migliorare l'efficienza e il tasso di successo degli esperimenti RNAi, è possibile utilizzare alcuni strumenti basati sul web per progettare il bersaglio del dsRNA, come il dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. Produzione del modello di prodotto PCR: aggiungere un promotore della RNA polimerasi T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') all'estremità 5' di uno dei primer progettati sopra. Eseguire la PCR standard per amplificare il frammento bersaglio del dsRNA. Eseguire un gel di agarosio all'1% in 1x TAE per verificare un singolo prodotto PCR della dimensione prevista. Successivamente, purificare il prodotto PCR con un kit di purificazione (Tabella dei materiali) e utilizzarlo per la successiva trascrizione.
    NOTA: Per conservare il prodotto PCR target a lungo termine e ottenere rese elevate, si consiglia di legare il prodotto PCR a un plasmide. Il plasmide deve essere linearizzato prima della reazione di PCR.
  3. Generazione di dsRNA: utilizzare un sistema RNAi T7 (Table of Materials) per generare il dsRNA. Impostare la reazione aggiungendo i componenti a temperatura ambiente secondo le istruzioni del produttore. Miscelare la reazione pipettando delicatamente e incubare a 37 °C per 30 minuti.
    NOTA: Per massimizzare la resa, l'incubazione a 37 °C può essere prolungata fino a 2-6 ore. Per i modelli contenenti una struttura secondaria o ricca di GC, l'incubazione può essere eseguita a 42 °C per migliorare la resa del dsRNA.
  4. Ricottura per formare dsRNA: Incubare la reazione a 70 °C per 10 minuti, quindi raffreddare lentamente a temperatura ambiente (~20 minuti). Questo ridurrà il dsRNA.
  5. Trattamento con DNasi e RNasi: Pipettare 1 μL della soluzione di RNasi fornita in 199 μL di acqua priva di nucleasi per ottenere una soluzione di RNasi appena diluita. Aggiungere 1 μL di soluzione di RNasi appena diluita e 1 μL di DNasi priva di RNasi RQ1 fornita per 20 μL di volume di reazione, mescolare delicatamente e incubare a 37 °C per 30 minuti. L'RNA a filamento singolo (ssRNA) e il DNA stampo nella reazione verranno rimossi dopo questo trattamento.
  6. Precipitazione alcolica: aggiungere alla reazione 1 volume di isopropanolo o 2,5 volumi di etanolo al 95% insieme a 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5,2). Mescolare la reazione per vortice e incubare su ghiaccio per 5 minuti per formare una massa torbida. Centrifugare alla massima velocità in una centrifuga per 10 minuti per raccogliere un pellet bianco sul fondo del tubo. Scartare il surnatante e lavare il pellet con 0,5 ml di etanolo freddo al 70% per rimuovere il sale residuo. Rimuovere l'etanolo dopo il lavaggio. Lasciare asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 15 minuti. Risospendere il pellet con acqua priva di nucleasi in 2-5 volte il volume di reazione iniziale. Conservare a -20 °C o -70 °C.
    NOTA: Il pellet di dsRNA non deve essere eccessivamente essiccato, poiché ciò potrebbe rendere difficile la risospensione completa. Per garantire una risospensione sufficiente, sono necessari almeno 2 volumi.
  7. Controllo della quantità e della qualità del dsRNA: diluire il dsRNA in acqua priva di nucleasi in un rapporto compreso tra 1:100 e 1:300. Determinare la concentrazione di dsRNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Per quantificare il dsRNA, moltiplicare la concentrazione per il volume. Per valutare la qualità del dsRNA, utilizzare l'elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all'1% in 1x TAE e diluire il dsRNA a 1:50 con acqua priva di nucleasi. Utilizzare 5 μL di dsRNA diluito per corsia e colorare il gel con 0,5 mg/mL di bromuro di etidio per almeno 15 minuti per la visualizzazione.
    NOTA: il dsRNA migra più lentamente del dsDNA.

4. Preparazione delle nanoparticelle di chitosano/dsRNA

  1. Preparare 100 mM di acetato di sodio (0,1 M NaC2H3O2 e 0,1 M di acido acetico, pH 4,5 in acqua deionizzata) e 100 mM di solfato di sodio (100 mM Na2SO4 in acqua deionizzata) tampone a temperatura ambiente.
  2. Sciogliere il chitosano commercializzato (da gusci di gamberetti, ≥75% deacetilato; Tabella dei materiali) in 100 mM di tampone di acetato di sodio per ottenere una soluzione di chitosano allo 0,02% (p/v).
  3. Sciogliere 20 μg di dsRNA in 50 μL di acqua priva di nucleasi e aggiungerlo a 50 μL di tampone solfato di sodio 100 mM per ottenere una soluzione di dsRNA da 100 μL.
  4. Aggiungere 100 μL di soluzione di chitosano a 100 μL di soluzione di dsRNA. Contemporaneamente, preparare un controllo aggiungendo 100 μL di soluzione di chitosano a 100 μL di 50 mM di solfato di sodio. Mescolare e scaldare i composti a 55 °C per 1 min.
  5. Agitare immediatamente la miscela con un vortice ad alta velocità per 30 s per consentire la formazione delle nanoparticelle.
  6. Centrifugare la miscela a 13.000 x g a temperatura ambiente per 10 minuti per ottenere un pellet bianco. Trasferire il surnatante in una provetta fresca da 1,5 mL. Lasciare asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti.
  7. Determinare la concentrazione di dsRNA nel surnatante utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi (Tabella dei materiali). Utilizzare il surnatante del controllo come spazio vuoto. Moltiplicare la concentrazione per il volume per calcolare la quantità totale di dsRNA rimanente nel surnatante. Calcola la percentuale di dsRNA incapsulato nelle nanoparticelle per la quantità rimanente nel surnatante divisa per la quantità iniziale di dsRNA.
    NOTA: Anche se le nanoparticelle possono essere conservate per 4-37 °C per almeno 15 giorni prima dell'uso14, si consiglia di utilizzare le nanoparticelle il prima possibile.

5. Nutrire le larve del baco da seta con nanoparticelle di chitosano/dsRNA

  1. Raccogli le larve di baco da seta del 5° stadio appena mutate (cioè il giorno 1 del 5° stadio) della stessa dimensione per l'esperimento di alimentazione. Posizionare le larve singolarmente in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti prima di chiudere il coperchio e lasciarle morire di fame per 24 ore.
  2. Sciacquare le foglie di gelso fresche con acqua deionizzata e asciugarle con carta da cucina pulita. Le foglie di gelso devono essere asciutte senza gocce d'acqua. Tagliare a dischi di foglie di gelso da 1 cm x 1 cm.
  3. Sciogliere le nanoparticelle di chitosano/dsRNA in acqua priva di nucleasi a 500 ng/μL prima dell'uso. Diluire le nanoparticelle di chitosano di controllo (preparate in 4.4) con lo stesso volume di acqua priva di nucleasi. Preparare il dsRNA nudo a 500 ng/μL in acqua priva di nucleasi.
  4. Utilizzare le nanoparticelle di chitosano/dsRNA per l'esperimento di knockdown dell'RNAi, le nanoparticelle di chitosano di controllo come controllo vuoto/negativo. Usa il dsRNA nudo per confrontare le differenze con le nanoparticelle di chitosano/dsRNA.
  5. Rivestire 10 μL di nanoparticelle di chitosano/dsRNA, chitosano e dsRNA nudo sulla superficie di ciascun disco fogliare, rispettivamente. Asciugare all'aria la soluzione di nanoparticelle e la soluzione di dsRNA sui dischi fogliari a temperatura ambiente per 5 minuti.
  6. Nutrire ogni larva con un disco fogliare rivestito di nanoparticelle o dsRNA al giorno. Fornire dischi fogliari rivestiti di nanoparticelle o dsRNA alle larve continuamente per 5 giorni. Le foglie di gelso fresche possono essere fornite dopo che il disco fogliare rivestito è stato completamente mangiato dalle larve ogni giorno.
  7. Il giorno 6, anestetizzare le larve sul ghiaccio fino a quando non si muovono e sezionare le larve per il campionamento. Taglia il torace con le forbici su una capsula di Petri pulita. Estrarre l'intestino medio con una pinzetta. Rimuovere il contenuto nell'intestino medio e lavare l'intestino medio in un'altra capsula di Petri riempita con acqua priva di nucleasi. Conservare l'intestino medio in una provetta da 1,5 ml e mantenerlo a -70 °C.

6. Conferma del silenziamento genico

  1. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) per calcolare la quantificazione del trascritto relativo. Per ogni replica biologica sono richieste almeno tre repliche biologiche e tre repliche tecniche. Si raccomanda almeno due geni di riferimento per normalizzare il relativo trascritto. Viene testato un gene Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). Valutare l'efficienza del silenziamento genico confrontando il valore medio del trascritto relativo con il gruppo di controllo e convertirlo in percentuale.
    NOTA: La condizione di amplificazione della qRT-PCR, le informazioni sul primer e il relativo calcolo della trascrizione sono disponibili nella nostra recente pubblicazione20.
  2. Analizzare il fenotipo dell'RNAi per valutare l'effetto di silenziamento genico. Osserva le dimensioni delle larve e dei bozzoli. Scatta foto ogni giorno per registrare le apparizioni.
    NOTA: L'RNAi può influenzare la morfologia, la metamorfosi, la fisiologia e il comportamento. L'osservazione dei fenotipi correlati all'RNAi dipende dai geni bersaglio.

Risultati

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Per valutare l'efficienza dell'RNAi, è stato scelto per l'analisi un gene immunitario che ha come bersaglio BmToll9-2 . Il gene BmToll9-2 è ben caratterizzato in laboratorio e il silenziamento genico mediante iniezione di dsRNA si traduce in larve più leggere e più piccole nella nostra recente pubblicazione20. Per confermare l'efficacia dell'RNAi mediante ingestione attraverso nanoparticelle di chitosano/dsRNA, sono state utilizzate nanoparticelle di chitosano come controllo e allo stesso tempo è stato confrontato il dsRNA nudo.

Rispetto al controllo, le nanoparticelle di chitosano senza dsRNA, il dsRNA nudo che ha come bersaglio il gene BmToll9-2 non mostra alcun effetto di silenziamento. L'alimentazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nel baco da seta inibisce significativamente il trascritto, con un knockdown del 79% (Figura 1). L'inibizione del relativo trascritto indica che il gene BmToll9-2 è stato silenziato con successo attraverso l'ingestione di chitosano/dsRNA.

Il knockdown del gene BmToll9-2 influisce in modo significativo sulla crescita del baco da seta. Quando si osservano le larve, le larve silenziate da BmToll9-2 sono più piccole delle larve di controllo (Figura 2A). Quando si confrontano i bozzoli, anche i bozzoli silenziati BmToll9-2 sono più piccoli (Figura 2B). Le nanoparticelle di chitosano/dsRNA mostrano effetti RNAi di successo sia nel trascritto che nel fenotipo nel baco da seta.

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Figura 1: Trascritto relativo di BmToll9-2 dopo l'ingestione di nanoparticelle chitosano/dsBmToll9-2 in larve di B. mori 5th instar. I livelli relativi di mRNA di BmToll9-2 nelle larve alimentate con nanoparticelle di chitosano come controllo, dsRNA nudo e nanoparticelle di chitosano/dsRNA. I dati sono stati rappresentati come medie ± deviazione standard di tre repliche biologiche. Per ogni replicazione biologica, c'erano tre repliche tecniche. Lettere diverse sulle barre indicano differenze significative in base all'analisi ANOVA unidirezionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Osservazione del fenotipo dopo l'alimentazione con nanoparticelle chitosano/dsBmToll9-2. Le nanoparticelle di chitosano sono utilizzate come controllo. (A) La comparsa di larve di baco da seta dopo l'ingestione di nanoparticelle. (B) La comparsa di bozzoli di bachi da seta dopo l'ingestione di nanoparticelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Uno stadio corretto è importante per l'osservazione del fenotipo dell'RNAi, a seconda dei geni bersaglio. I nostri risultati preliminari hanno mostrato che Toll9-2 è coinvolto nella crescita del baco da seta. Le dimensioni e il peso delle larve del baco da seta aumentano rapidamente al 5° stadio 21. Pertanto, le larve del 5° stadio sono selezionate come fase per l'esperimento di alimentazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA. È anche possibile selezionare le larve del 3° o 4° stadio per gli esperimenti di alimentazione e osservare le differenze di sviluppo al 5° stadio. Tuttavia, gli esperimenti di alimentazione con nanoparticelle richiedono un'alimentazione continua ogni giorno14. L'alimentazione delle larve in uno stadio più giovane richiede una maggiore preparazione di dsRNA, che è relativamente più costosa. Per i motivi di cui sopra, suggeriamo di selezionare le larve di baco da seta appena mutate del 5° stadio come punto di partenza dell'esperimento di alimentazione con nanoparticelle.

Anche l'ottimizzazione dei parametri di alimentazione delle nanoparticelle è importante. Un'alimentazione costante di nanoparticelle per 5-7 giorni per ottenere un RNAi efficiente è comune negli studi attuali 14,18,22,23. Poiché il dsRNA è l'ingrediente più costoso negli esperimenti RNAi, le nanoparticelle potrebbero essere somministrate alle larve a giorni alterni, il che potrebbe aiutare a ridurre della metà il costo della preparazione del dsRNA. Un altro modo per ridurre i costi è ottimizzare la quantità di dsRNA utilizzata nell'alimentazione. In questo protocollo, vengono utilizzati 5 μg di nanoparticelle di chitosano/dsRNA per ogni larva, che è la dose universale per l'iniezione di dsRNA in laboratorio. Considerando che 5 μg di dsRNA sono una dose elevata e l'inibizione da parte dell'alimentazione di nanoparticelle è significativa. Si suggerisce di ridurre la quantità di dsRNA nell'esperimento. Tuttavia, l'impatto dei due parametri di cui sopra sull'efficienza dell'RNAi deve essere valutato in esperimenti futuri.

Il rapporto tra chitosano e dsRNA potrebbe essere ottimizzato. In questo protocollo, 20 μg di chitosano in 100 μL di acetato di sodio vengono miscelati con 20 μg di dsRNA in 100 μL di solfato di sodio. Nel primo rapporto sulle nanoparticelle di chitosano/dsRNA, 20 μg di chitosano in 100 μL di acetato di sodio vengono miscelati con 32 μg di dsRNA in 100 μL di solfato di sodio16. In alcuni altri rapporti, 1 μg di chitosano in 100 μL di acetato di sodio viene miscelato con 1 μg di dsRNA in 100 μL di solfato di sodio18,23. Pertanto, la quantità di chitosano e dsRNA potrebbe essere ottimizzata per ottenere la migliore efficienza di caricamento delle nanoparticelle e un effetto di silenziamento RNAi ottimale.

È necessario considerare lo stoccaggio di nanoparticelle di chitosano/dsRNA. Le nanoparticelle di chitosano/dsRNA vengono preparate prima dell'esperimento di alimentazione e si suggerisce di utilizzarle immediatamente. Un recente rapporto ha dimostrato che le nanoparticelle di chitosano/dsRNA sono state conservate a 4 °C, 24 °C e 37 °C per 15 giorni ed erano ancora stabili19. Pertanto, le nanoparticelle di chitosano/dsRNA potrebbero essere preparate in anticipo e conservate a 4 °C in frigorifero poiché il dsRNA è più stabile a basse temperature.

Oltre al dsRNA, alcuni piccoli RNA, come il piccolo RNA interferente (siRNA) e l'RNA a forcina corta (shRNA), possono essere utilizzati nella preparazione di nanoparticelle per esperimenti di RNAi. Ad esempio, le nanoparticelle di siRNA migliorano la resistenza delle piante a Pseudomonas syringae24. La somministrazione di nanoparticelle di shRNA ha causato un effetto RNAi di successo nella cimice bruna neotropicale Euschistus heros25. Pertanto, le nanoparticelle possono essere applicate a qualsiasi molecola di RNA utilizzata nell'esperimento RNAi.

L'efficienza dell'RNAi nei lepidotteri, compresi i bachi da seta, è refrattaria26. La somministrazione del dsRNA avviene solo attraverso l'iniezione nei bachi da seta, che richiede tempo e manodopera. Con questo metodo di somministrazione di nanoparticelle chitosano/dsRNA, si osserva un significativo effetto di silenziamento sia nel trascritto che nel fenotipo nelle larve e nei bozzoli del baco da seta, possibile a causa della minore degradazione del dsRNA da parte della protezione del chitosano19. Questo metodo è poco costoso e facile da eseguire, che può essere adattato ad altri insetti. La facilità di questo protocollo può essere applicata non solo nella ricerca scientifica, ma anche nell'insegnamento in classe, nella dimostrazione e nella pratica. Il metodo di somministrazione delle nanoparticelle rappresenta una nuova direzione per il biocontrollo e la gestione dei parassitidel futuro 27.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (31501898), dal Science and Technology Program di Guangzhou (202102010465), dal Guangzhou Higher Education Teaching Quality and Teaching Reform Project (2022JXGG057) e dal progetto di ricerca del Comitato direttivo per i corsi online aperti delle università provinciali del Guangdong (2022ZXKC381).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga da 1,5 mLSangonF601620per la reazione di dsRNA o nanoparticelle
10 μ l. pipettaEppendorfP13473Gper aspirare o risospendere il liquido
100 μ l. pipettaEppendorfQ12115Gper aspirare o risospendere il liquido
2,5 μ l. pipettaEppendorfP20777Gper aspirare o risospendere il liquido
20 μ l. pipettaEppendorfH19229Eper aspirare o risospendere il liquido
200 μ l. pipettaEppendorfH20588Eper aspirare o risospendere liquidi
6 pozzetti Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC Costar3516per l'allevamento di bachi da seta singolarmente
Acido aceticoA116165 di Aladinoper fare TAE
Agarosio MBBI Life Sciencesper l'elettrofosi su gel di agarosio
Bilancia analiticaSartoriusBSA224Sal peso ingredienti
Centrifuga SartoriusCentrisart A-14Cper centrifugare per formare dsRNA o nanoparticelle
ChitosanSigma-AldrichC3646per combinare con dsRNA per la preparazione di nanoparticelle
EDTASangonA500895per fare TAE
EtanoloAladinoE130059per fare TAE, o per la precipitazione di dsRNA
CongelatoreSiemensiQ300per immagazzinare dsRNA o nanoparticelle
GoTaq Green Master MixPromegaM712per la reazione PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002per la reazione qRT-PCR
Isopropanolo AladdinI112011per la precipitazione del dsRNA
Spettrofotometro UV-Vis a microvolume NanoDropThermoFisherOneper determinare la concentrazione del ph metro di dsRNA
Sartorius  PB-10per preparare tamponi Kit
purificazione del prodotto per PCR in colonna SanPrepB518141 Sangonper la purificazione del prodotto PCR
Acetato di sodioSigma-AldrichS2889per produrre 100 mM di tampone in acetato di sodio
Solfato di sodio Sigma-Aldrich239313per produrre 100 mM di tampone solfato di sodio
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700per la sintesi di dsRNA
ThermoMixerEppendorfCper la generazione di dsRNA o il riscaldamento di nanoparticelle
Tris SangonA501492per fare TAE
Vortex.IKAVortex 3per preparare nanoparticelle di chitosano/dsRNA
a A610013 di

Riferimenti

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