Articolo metodologico

Analisi comparativa del cariotipo delle popolazioni di erbe di Lycoris aurea utilizzando bande fluorocromiche e rDNA-FISH 45S e 5S

DOI:

10.3791/67363

⸱

29 novembre 2024

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo studia la distribuzione dell'eterocromatina in otto popolazioni di Lycoris aurea (L'Her) Herb, utilizzando la colorazione cromosomica combinata PI e DAPI, l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) con le regioni geniche 18S-5.8-26S rRNA (regioni 45S rDNA) e le sonde di DNA ribosomiale 5S.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per comprendere la variazione del cariotipo in otto popolazioni, i cariotipi dettagliati sono stati meticolosamente stabiliti utilizzando misurazioni cromosomiche, bande di fluorescenza e segnali rDNA FISH. Il numero di siti di rDNA 45S varia da una a cinque coppie per popolazione, con il numero più comune per cariotipo di quattro coppie. Il locus 45S rDNA è localizzato prevalentemente nei bracci corti e nelle regioni terminali dei cromosomi, mentre il locus 5S rDNA si trova principalmente nel braccio corto e nelle regioni terminali o prossimali. Le popolazioni HBWF, HNXN, HBBD e HNZX hanno mostrato una distribuzione simile dei siti di rDNA 45S, così come GXTL, HBFC e SCLS, indicando una stretta relazione tra popolazioni con distribuzioni simili di siti di rDNA 45S. I cariotipi di tutte le popolazioni studiate sono simmetrici, comprendenti centromeri stabili e metastabili o centromeri esclusivamente stabili. I grafici a dispersione di MCA e CVCL distinguono efficacemente le loro strutture cariotipiche. L'analisi include sei parametri quantitativi (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Inoltre, i risultati indicano che la PCoA basata su questi sei parametri è un metodo robusto per determinare le relazioni biologiche del cariotipo tra le otto popolazioni. Il numero di cromosomi nelle popolazioni di Lycoris è x = 6-8. Sulla base degli studi e della letteratura attuali, la differenziazione genomica di queste popolazioni è discussa in termini di dimensioni del genoma, eterocromatina, siti di rDNA 45S e 5S e asimmetria del cariotipo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris è una famiglia che comprende diverse importanti piante orticole1. Lycoris aurea (L'Hér.) Erba. è una pianta medicinale tradizionale cinese con una lunga storia. L'analisi fitochimica ha dimostrato che Lycoris aurea (L'Her.) L'erba contiene galantamina e altri alcaloidi, che possono aumentare la sensibilità all'acetilcolina e hanno il potenziale per trattare il morbo di Alzheimer come inibitori della colinesterasi2.

Nelle piante superiori, l'analisi del cariotipo è fondamentale per l'integrazione di mappe genetiche e fisiche, con significative implicazioni pratiche per la biologia vegetale. Questa analisi consente la caratterizzazione del genoma a livello cromosomico, il chiarimento delle relazioni tassonomiche cellulari tra le popolazioni, l'identificazione delle aberrazioni genetiche e la comprensione delle tendenze dell'evoluzione cromosomica 3,4,5. Tipicamente, la descrizione di un cariotipo include il numero di cromosomi, le lunghezze cromosomiche assolute e relative, le posizioni di costrizione primaria e secondaria, la distribuzione dei frammenti eterocromatici, il numero e le posizioni dei siti di rDNA e altre caratteristiche della sequenza di DNA, nonché l'asimmetria del cariotipo 6,7,8. Tra i parametri del cariotipo, l'asimmetria è determinata dalle variazioni della lunghezza cromosomica (asimmetria intercromosomica) e della posizione del centromero (asimmetria intracromosomica). L'asimmetria del cariotipo è una caratteristica significativa che riflette la morfologia cromosomica ed è ampiamente utilizzata nella tassonomia delle cellule vegetali 9,10,11,12.

Spesso, l'assenza di marcatori cromosomici limita l'analisi del cariotipo e impedisce l'identificazione dei singoli cromosomi. Negli ultimi anni, la colorazione di Giemsa, il banding di fluorescenza e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) sono diventati popolari nell'analisi cromosomica delle piante. I doppi metodi di colorazione fluorescente, come la colorazione CMA (cromomicina A3) / DAPI (4, 6-diammino-2-fenilindo) e la colorazione PI (ioduro di propile) / DAPI (nota come colorazione CPD), rivelano regioni eterocromatiche ricche di GC e AT sui cromosomi 4,13. Durante la metafase o il pachitene della mitosi vegetale, sequenze ripetute di DNA o lunghi segmenti di DNA possono generare segnali specifici nelle popolazioni vegetali attraverso l'ibridazione FISH 14,15,16.

Le bande fluorescenti e i segnali FISH forniscono marcatori utili per l'identificazione dei cromosomi. Misurando la lunghezza dei cromosomi, analizzando le caratteristiche delle bande di fluorescenza e confrontando le differenze del segnale FISH, è possibile costruire cariotipi citogenetici molecolari dettagliati di diversi germoplasmi o popolazioni vegetali. Questi cariotipi mostrano efficacemente la morfologia cromosomica in vari germoplasmi o popolazioni, consentendo confronti tra la distribuzione dell'eterocromatina e la localizzazione della sequenza del DNA e incoraggiando ulteriori ricerche 4,8,17. I confronti del cariotipo citogenetico molecolare possono offrire preziose informazioni sulle relazioni filogenetiche e sull'evoluzione cromosomica delle popolazioni correlate 8,14,18,19.

Il genere Lycoris , un gruppo diversificato e intrigante all'interno della famiglia Amaryllis, è noto per i suoi bulbi perenni. Composto da circa 20 specie, 15 delle quali endemiche della Cina, presenta una ricca biodiversità. Questo genere si trova esclusivamente nelle regioni temperate calde e subtropicali dell'Asia orientale, tra cui la Cina sud-occidentale, la Corea meridionale e il Giappone, con alcune popolazioni che si estendono fino all'India settentrionale e al Nepal20. I primi studi citogenetici hanno riguardato principalmente il conteggio dei cromosomi per stabilire il numero cromosomico di base del genere e per descrivere la morfologia cromosomica in popolazioni specifiche, concentrandosi in gran parte su Lycoris radiata21. Il numero totale di cromosomi osservato in questo genere varia da 12 a 33 o 44, rappresentando rispettivamente i livelli di diploidi, diploidi anormali, triploidi, tetraploidi e aneuploidi. I numeri cromosomici di base, x, sono 6, 7, 8 e 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) L'erba, una specie notevole all'interno del genere Lycoris , è ampiamente distribuita in tutta la Cina22. Prospera in ambienti rilassati e umidi e si riproduce attraverso piccoli bulbi. Questi bulbi, contenenti licurina e galantamina, due composti medicinali chiave, sono stati utilizzati per secoli nella medicina tradizionale cinese. La Lycoris aurea affascina anche gli orticoltori con i suoi sorprendenti fiori rossi in autunno e le foglie sempreverdi in inverno. Tuttavia, la somiglianza morfologica tra tutti gli studi di Lycoris aurea (L'Hér.) Le popolazioni di erbe aromatiche rappresentano una sfida significativa per l'identificazione cromosomica con i metodi citologici convenzionali.

Il clonaggio di FISH, fosmide o BAC (cromosomi artificiali batterici) con sequenze ripetitive di DNA e sonde oligonucleotidiche su cromosomi metafasici o pachidermici è stato utilizzato per l'analisi del cariotipo23,24,25, l'analisi citogenetica comparativa26,27, la costruzione di mappe citogenetiche28,29 e i saggi cromosomici specifici30. Recentemente, la tecnica FISH è stata applicata all'analisi cromosomica delle popolazioni di Lycoris 31. Sebbene il numero cromosomico e il cariotipo varino nelle popolazioni di Lycoris, il numero totale di cromosomi rimane costante, con tre tipi fondamentali osservati: il cromosoma centromero centrale (M-), il cromosoma centromero distale (T-) e il cromosoma centromero prossimale (A-). Inoltre, nelle popolazioni naturali si osservano diverse forme e dimensioni dei cromosomi32.

L'ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA (FISH) è utile per rilevare i cambiamenti cromosomici, come la fusione del centromero, l'inversione, l'amplificazione genica e la delezione di frammenti. La tecnologia RNA-FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) consente l'analisi visiva ad alta risoluzione dei cromosomi per rilevare e identificare molteplici cambiamenti complessi, tra cui la fusione delle regioni centrali dei cromosomi, la formazione di nuove strutture cromosomiche, l'inversione delle regioni cromosomiche, l'amplificazione di geni o frammenti genici e la perdita di sequenze geniche su specifiche regioni cromosomiche33. Cinque dei 500 cloni hanno mostrato forti segnali FISH sulla regione del centromero del cromosoma centrale (M-) ma non sul cromosoma distale del centromero (T-)34. L'esclusivo modello di distribuzione del segnale FISH su ciascun cromosoma ha permesso l'identificazione dei singoli cromosomi, che in precedenza era stata difficile nelle popolazioni di Lycoris utilizzando i metodi di colorazione tradizionali31. Attualmente, ci sono pochi studi sulla citogenetica molecolare di Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, sottolineando l'urgente necessità di ulteriori ricerche in questo campo.

In questo studio, otto cromosomi in metafase ben differenziati di Lycoris aurea (L'Hér.) Le popolazioni di erbe sono state preparate utilizzando metodi di immersione enzimatica ed essiccazione alla fiamma (EMF). Per l'identificazione dei FISH sono stati utilizzati la colorazione CPD e le sonde di rDNA 45S e 5S. I cariotipi citogenetici molecolari dettagliati di queste popolazioni sono stati costruiti utilizzando dati combinati provenienti da misurazioni cromosomiche, bande fluorescenti e segnali FISH di rDNA 45S e 5S. Per ciascuna popolazione sono stati calcolati sei diversi indici di asimmetria cariotipica per identificare le relazioni cariotipiche tra di loro. La valutazione dei dati del cariotipo citogenetico molecolare ha fornito informazioni significative sulla differenziazione genomica e sulle relazioni evolutive delle otto popolazioni, rimodellando potenzialmente la comprensione dei cromosomi di Lycoris .

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella dei materiali, mentre le sonde impiegate sono fornite nel File supplementare 1.

1. Preparazione dei cromosomi apicali

  1. Attecchisci per idroponica. Dopo aver rimosso la parte fuori terra del bulbo, mettilo in una bottiglia affusolata piena d'acqua, sostituendo l'acqua ogni 3 giorni, seguendo il metodo descritto da Song et al.35.
  2. Asportare le punte delle radici in crescita attiva quando raggiungono circa 1,0-2,0 cm di lunghezza e trattarle in α-bromonoftalene saturo a 28 °C per 1,0 ore.
  3. Tagliare le punte delle radici a circa 1 cm e metterle in una miscela appena preparata di metanolo e acido acetico glaciale in un rapporto di 3:1 in volume a temperatura ambiente (circa 20-25 °C) per 2-3 ore. Quindi, conservali in frigorifero a 4 °C, come descritto da She et al.36.
  4. Lavare accuratamente le punte delle radici fisse (2-3 mm) in acqua bidistillata.
  5. Preparare una miscela di cellulasi e pectina idrolasi in tampone acido citrico-sodio citrato 0,01 mM a pH 4,5, con cellulasi e pectina idrolasi ciascuna all'1%. Immergere le punte delle radici pretrattate nella miscela e digerire a 28 °C per 1,0-1,5 h.
  6. Lavare le punte delle radici digerite con acqua distillata a doppia distillazione, trasferirle su un vetrino e schiacciarle accuratamente con il fissativo utilizzando una pinza a punta fine.
  7. Asciugare i vetrini sulla fiamma di una lampada ad alcool fino a quando la nebbia d'acqua non scompare. Al microscopio a contrasto di fase, selezionare i vetrini con più di cinque fasi divise e senza cromosomi sovrapposti. Conservare i vetrini a -20 °C per un uso futuro.

2. Colorazione CPD

  1. Preparare una soluzione CPD aggiungendo PI e DAPI a un attenuatore antifluorescenza al 30% (v/v), dove la concentrazione di PI è 0,6 μg·mL-1 e la concentrazione di DAPI è 3 μg·mL-1.
  2. Asciugare il vetrino cromosomico a 65 °C per 30 minuti.
  3. Aggiungere 100 μL di diluente RNasi A (la soluzione di conservazione della RNasi A diluita 100 volte con 2x SSC (citrato di sodio salino), ottenendo una concentrazione finale di 100 μg/mL) per vetrino cromosomico. Coprire il vetrino e scaldarlo in una camera umida a 37 °C per 30-60 minuti.
  4. Lavare il vetrino cromosomico con 2x SSC a temperatura ambiente per tre intervalli di 5 minuti ciascuno.
  5. Lavare il vetrino cromosomico a temperatura ambiente per 1-2 minuti.
  6. Aggiungere 200 μl di diluente per pepsina (la soluzione di conservazione della pepsina diluita 100 volte con 0,01 N HCl per ottenere una concentrazione finale di 5 μg/mL) per vetrino cromosomico. Coprire il vetrino e incubarlo in camera umida a 37 °C per 5-20 minuti.
  7. Lavare le sezioni cromosomiche con acqua ultrapura a temperatura ambiente per 2 minuti, quindi lavare con 2 xSSC a temperatura ambiente per due intervalli di 5 minuti ciascuno.
  8. Fissare i vetrini con metanolo: soluzione di acido acetico glaciale (3:1) per 10 min.
  9. Lavare con 2x SSC a temperatura ambiente per tre intervalli di 5 minuti ciascuno.
  10. Trattare con etanolo al 70%, 95% e 100% a -20 °C per 5 minuti ciascuno, quindi asciugare a temperatura ambiente.
  11. Prelevare i vetrini cromosomici trattati e asciugati, aggiungere 30 μl di soluzione colorante CPD a ciascun vetrino, coprire con un vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm e colorare al buio per più di 30 minuti. Il materiale cromosomico esteso deve essere colorato durante la notte.
  12. Osservare i vetrini cromosomici al microscopio a fluorescenza, utilizzando un filtro di eccitazione verde (WG) per la colorazione PI e un filtro ultravioletto (UV) per la colorazione DAPI. Cattura immagini con il software compatibile.
    1. Regola il tempo di esposizione attraverso i due filtri per ottenere intensità di fluorescenza del rosso e del blu simili durante l'acquisizione dell'immagine. L'immagine CPD è ottenuta dalle immagini in scala di grigi colorate con PI e DAPI. Le misurazioni cromosomiche e l'elaborazione delle immagini sono state eseguite utilizzando il software Adobe Photoshop.

3. Ibridazione in situ a fluorescenza

  1. Preparare la soluzione ibrida: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) e 50% glucano solfato (4 μL). Dopo la preparazione, centrifugare la soluzione ibrida (2500 x g, 5-10 min, a temperatura ambiente) e metterla sul ghiaccio.
  2. Mettere i vetrini scansionati in forno a 65 °C per 30-60 min.
  3. Rimuovere i vetrini cotti, aggiungere 100 μL di soluzione di denaturazione FAD al 70%, coprire con un vetro di copertura e denaturare in un forno di ibridazione molecolare a 85 °C per 2,5 minuti.
  4. Rimuovere il vetro di copertura e immergere immediatamente i vetrini in etanolo freddo al 70%, 90% e 100%, disidratandoli successivamente per 5 minuti ciascuno.
  5. Rimuovere i vetrini e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per più di 30 minuti.
  6. Aggiungere 20 μL di soluzione ibrida al vetrino, posizionare delicatamente il vetro di copertura sopra fino a quando il liquido non è completamente diffuso e lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per inumidire l'area coperta del vetrino.
  7. Collocare i vetrini in una capsula ibrida imbevuta di 2× SSC (la capsula ibrida dovrebbe essere una grande capsula di Petri con un coperchio avvolto in carta stagnola per facilitare l'operazione al riparo dalla luce) e incubare a 37 °C per una notte (per almeno 6 ore).
  8. Controcolorare i cromosomi montandoli con 3 μg·mL-1 DAPI in una soluzione al 30% (v/v) di Vectashield H-100. Cattura l'immagine utilizzando un software compatibile, rispettivamente con la fluorescenza blu di DAPI eccitata dalla luce viola del filtro e la fluorescenza rossa di PI eccitata dalla luce verde.
    NOTA: L'ibridazione FISH è stata eseguita utilizzando sonde di rDNA 45S e 5S su vetrini precedentemente colorati con CPD, seguendo il metodo descritto da She et al.36.

4. Analisi del cariotipo

  1. Selezionare cinque cellule mitotiche di metafase per ogni popolazione in cui i cromosomi sono ben dispersi (senza sovrapposizioni) e moderatamente condensati (i cromosomi non devono essere aggregati al massimo, ma le estremità non devono essere raggruppate insieme), seguendo la metodologia descritta da She et al.4.
  2. Determina la lunghezza assoluta di ciascun cromosoma selezionando cinque cromosomi con la più alta concentrazione durante la divisione cellulare.
  3. Misura meticolosamente e con precisione la lunghezza del braccio lungo (L) e del braccio corto (S) di ciascun cromosoma, nonché la dimensione di ciascuna banda di pigmento fluorescente sul cromosoma.
  4. Calcolare i seguenti parametri: (1) lunghezza relativa dei cromosomi (RL, percentuale aploide); (2) rapporto tra le braccia (AR = L/S, braccio lungo/braccio corto); (3) lunghezza totale del cromosoma aploide (TCL; lunghezza del cariotipo); (4) lunghezza media dei cromosomi (C); (5) dimensione della banda di fluorescenza (la percentuale della banda di fluorescenza rispetto alla lunghezza del cromosoma); (6) distanza dal centromero al sito di rDNA; (7) indice medio del centromero (CI, calcolato come la lunghezza del braccio corto di ciascun cromosoma divisa per la lunghezza totale di quel cromosoma, quindi media di questi valori); (8) quattro diversi indicatori di asimmetria del cariotipo, tra cui l'indice del centromero (CVCI), il coefficiente di variazione (CV), il coefficiente di variazione della lunghezza del cromosoma (CVCL), il coefficiente medio di asimmetria del centromero (MCA) e la categoria di asimmetria di Stebbins.
    NOTA: Fare riferimento ai metodi di Paszko10 e Peruzzi et al.11 per calcolare l'indice di asimmetria. Classificare i cromosomi con diversi rapporti tra le braccia in base ai cinque metodi di classificazione di Levan. Disporre i cromosomi di Lycoris aurea (L'Hér.) Erba in ordine decrescente di lunghezza come descritto nel protocollo Han et al.37.
  5. Garantire la precisione e l'accuratezza della metodologia disegnando modelli di cariotipo cromosomico basati sui dati di misurazione dei cromosomi combinati con le informazioni sulla banda di fluorescenza e la posizione e le dimensioni dell'rDNA-FISH.
  6. Visualizzare le relazioni asimmetriche del cariotipo delle otto popolazioni è un passo chiave che fornisce intuizioni chiare. Ciò si ottiene attraverso grafici a dispersione bidimensionali, che vengono utilizzati per ottenere il loro MCA e CVCL.
  7. Eseguire l'analisi delle coordinate principali (PCoA) utilizzando il coefficiente di somiglianza di Gower, un componente cruciale, seguendo i metodi di She et al.38.
  8. Calcolare sei parametri quantitativi (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) per determinare i cariotipi citogenetici delle otto popolazioni.
  9. Conduci analisi statistiche utilizzando un programma di analisi e visualizzazione dei dati per generare il dendrogramma basato su UPGMA e il grafico a dispersione PCoA.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizzando il meticoloso metodo dell'immersione enzimatica e dell'essiccazione alla fiamma (EMF), i cromosomi in metafase sparsi e ben differenziati di Lycoris aurea (L'Hér.) Sono state ottenute erbe aromatiche ed è stato costruito il cariotipo cromosomico citogenetico di Lycoris aurea (Figura 1). I cromosomi in metafase con il più alto grado di condensazione non sono adatti per l'analisi del cariotipo a causa delle ridotte differenze morfologiche. Tuttavia, poiché la lunghezza totale dei cromosomi aploidi (TCL) è comparabile tra le popolazioni, è possibile distinguere i cariotipi delle diverse popolazioni di Lycoris aurea confrontando le differenze nei valori di TCL. Le caratteristiche del cariotipo e il contenuto di DNA nucleare di otto popolazioni di Lycoris aurea sono mostrati nella Tabella 1. La distribuzione delle bande di fluorescenza e le posizioni dei siti di rDNA 45S e 5S sono presentate nella Tabella 2. La Figura 2 mostra le misurazioni dei cromosomi insieme alle caratteristiche delle bande di fluorescenza e la posizione e le dimensioni dei segnali FISH di rDNA 45S e 5S.

I numeri dei cromosomi diploidi sono i seguenti: 2n = 16 = 8m + 8t per GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t per HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t per GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t per HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t per HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t per HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t per HBWF e 2n + 1 = 15 = 7m + 8t per SCLS (Tabella 1). Come descritto nel protocollo da She et al.4, i cromosomi in metafase delle otto popolazioni di L. aurea sono piccoli, con lunghezze cromosomiche medie che vanno da 1,01 μm (HNZX) a 2,08 μm (GZDS) e un TCL che va da 16,14 μm (HNZX) a 29,13 μm (GZDS). I TCL delle otto popolazioni sono correlati con i contenuti di DNA nucleare riportati (Tabella 1). Il più piccolo intervallo di lunghezza relativa (RRL) è osservato in HNXN (1,52-3,81), mentre il più grande è visto in GZDS (2,73-5,86). Le popolazioni HNXN e GZDS hanno mostrato rispettivamente la variazione più piccola e più grande nella lunghezza dei cromosomi. L'indice medio del centromero (CI) del genoma variava tra 61,02 ± 5,63 (popolazione HBFC) e 70,70 ± 4,63 (popolazione HBWF). L'HBFC della popolazione ha mostrato la variazione minore nell'indice del centromero, mentre l'HBWF della popolazione ha mostrato le variazioni più estese.

I cariotipi sono composti da cromosomi metacentrici (m) e telocentrici (t) (Tabella 1; Figura 2), che rappresentano le forme cromosomiche più comuni tra le otto popolazioni studiate. Gli otto diversi indici di asimmetria del cariotipo sono riportati nella Tabella 1. Tra questi indici, il coefficiente di variazione dell'indice del centromero (CVCI) e l'asimmetria media del centromero (MCA) caratterizzano l'asimmetria intracromosomica, mentre il coefficiente di variazione della lunghezza del cromosoma (CVCL) misura l'asimmetria intercromosomica. Gli intervalli per CVCI e MCA sono i seguenti: CVCI = da 10,97 (HBBD) a 18,25 (HBWF) e MCA = da 28,85 (HNZX) a 39,30 (HBWF). Questi valori indicano costantemente che l'HBBD ha l'asimmetria intracromosomica più bassa e l'HBWF ha la più alta. L'intervallo per CVCL è compreso tra 14,98 (GZDS) e 23,32 (HBWF), suggerendo che GZDS mostra il cariotipo meno asimmetrico, mentre HBWF mostra il cariotipo più asimmetrico tra le otto popolazioni. Secondo i principi di classificazione di Stebbins9, questi cariotipi appartengono alla classe 1B, indicando che tutte le popolazioni studiate hanno cariotipi relativamente simmetrici.

Le relazioni di asimmetria del cariotipo tra gli otto Lycoris aurea (L'Hérit.) Le popolazioni di erbe aromatiche sono illustrate utilizzando grafici a dispersione bidimensionali di CVCI rispetto a CVCL e MCA rispetto a CVCL (Figura 3). La struttura cariotipica di queste popolazioni, come rivelato dalle tre coppie di parametri - CVCI, CVCL e MCA - ha implicazioni significative. Questi parametri dimostrano asimmetrie simili al cariotipo. I risultati dei grafici a dispersione evidenziano il potenziale impatto della ricerca, mostrando che la popolazione HNXN ha il cariotipo più simmetrico, mentre le popolazioni HBFC e HBWF mostrano rispettivamente le maggiori asimmetrie intracromosomiche e intercromosomiche (Figura 3).

Questo studio ha meticolosamente classificato le otto popolazioni di Lycoris aurea in tre gruppi principali in base al diagramma ad albero UPGMA con cinque parametri del cariotipo (Figura 4). Il primo cluster, rappresentato da SCLS di popolazione, forma un clade indipendente. Il secondo gruppo è costituito da HNXN e HBWF. Il terzo cluster è diviso in due sottogruppi: uno contiene solo la popolazione HBFC, mentre l'altro include le popolazioni HBWF, GZDS e GXTL, con la popolazione HBBD e GZDS raggruppate in un ramo più piccolo. Le relazioni cariologiche tra le popolazioni studiate, come rivelato dall'analisi delle coordinate principali (PCoA), sono illustrate nella Figura 5. Il grafico a dispersione PCoA indica che le otto popolazioni possono essere divise in due gruppi con un livello di confidenza del 68,36%. Il primo gruppo comprende HBWF, HBBD e GXTL, con le prime tre popolazioni strettamente raggruppate insieme. Il secondo gruppo è costituito da HBFC, HNXN, HNZX e SCLS, dove HBFC occupa la posizione centrale tra i due gruppi e SCLS è posizionato più isolato (Figura 5).

La colorazione inversa CPD (combinazione di ioduro di propidio e DAPI) e DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo) sono tecniche standard utilizzate per osservare la struttura nucleare e la distribuzione della cromatina. I risultati di questo studio hanno rivelato evidenti fenomeni di eterocromatina tra otto popolazioni di Lycoris aurea (L'Hérit.) Erba (Figura 1 e Figura 2; Tabella 2). I risultati dell'ibridazione FISH per ciascuna popolazione hanno indicato che tutte le regioni cromosomiche corrispondono ai loci 45S e 5S dell'rDNA. Le caratteristiche delle bande CPD sono illustrate nella Figura 1A, C, E, G, I, K, M, O.

Nelle popolazioni HBFC e HBBD, le bande CPD sono state osservate nelle regioni centromerica e pericentromerica (Figura 1G,K; Figura 2D, F). Tuttavia, alcuni cromosomi non mostravano bande CPD: il 3° e l'8° cromosoma in SCLS, il 1° cromosoma in HNXN, il 1° cromosoma in HNZX, il 1° cromosoma in HBWF, il 2° cromosoma in GZDS e il 2° cromosoma in GXTL (Figura 1A,C,E,I,J,M,O; Figura 2A-C,E,G,H). In particolare, le bande CPD sono state trovate anche sui terminali dei bracci corti delle coppie di cromosomi 5, 6 e 7 in SCLS e HNXN, sulle coppie 4, 5, 6, 7 e 8 in HNZX e sulle coppie 5, 6 e 7 in HBFC. Inoltre, le bande CPD erano presenti sulle estremità del braccio corto dei cromosomi 4, 5, 6, 7 e 8 in HBWF, sulle estremità del braccio corto dei cromosomi 5, 6 e 7 in HBBD e sulle estremità del braccio corto dei cromosomi 5, 6, 7 e 8 in GXTL (Figura 1A e Figura 2A).

Dopo l'ibridazione FISH, la colorazione inversa DAPI ha formato bande fluorescenti luminose attorno alle particelle centriche dei cromosomi 5, 6 e 7 in GZDS. Queste bande, denominate bande DAPI+ post-FISH, indicano che queste regioni eterocromatiniche contengono un numero elevato di coppie di basi A-T (Figura 2G). L'intervallo delle bande CPD (peri)centromeriche osservate nelle otto popolazioni era compreso tra il 25,00% e il 57,14% (Tabella 2), mentre la quantità totale di bande CPD terminali variava dal 40,00% al 71,43% (Tabella 2). Nella popolazione GZDS, le bande DAPI+ post-FISH erano correlate con la lunghezza del cariotipo, rappresentando il 42,86% del totale. Le dimensioni delle bande CPD di rDNA, delle bande CPD non rDNA e delle bande DAPI+ dopo FISH differivano significativamente tra le varie coppie di cromosomi di Lycoris aurea (L'Hérit.) Erba (Figura 2; Tabella 2).

La tecnica FISH è stata utilizzata per inserire sonde di rDNA 45S e 5S nei cromosomi colorati con CPD, come illustrato nella Figura 1. Il riassunto del numero e della posizione dei siti di rDNA 45S e 5S nelle otto popolazioni di Lycoris aurea (L'Hérit.) L'erba è presentata nella Tabella 2 e raffigurata nella Figura 2. In particolare, differenze significative nel numero, nelle dimensioni e nella posizione dei loci dell'rDNA tra le otto popolazioni evidenziano l'importanza di questi risultati. In totale, c'erano 30 loci di rDNA 45S nelle otto popolazioni. Di questi, 4 loci (13,33%) erano situati nella regione del centromero centrale, 9 (30,00%) nella regione del centromero quasi centrale e 17 (56,67%) nelle regioni terminali dei rispettivi bracci cromosomici (Figura 2; Tabella 2).

Nella popolazione GXTL, un segnale del locus rDNA 45S è stato trovato nella regione del centromero del braccio corto del cromosoma 4, mentre quattro segnali aggiuntivi sono stati localizzati nella regione del centromero dei bracci lunghi dei cromosomi 5, 6, 7 e 8 (Figura 1P; Figura 2G). Nella popolazione HBFC, un locus di rDNA 45S è stato posizionato nella regione del centromero sul braccio corto del cromosoma 4, con tre loci trovati nelle regioni dell'eterocromatina pericentromerica sui bracci corti dei cromosomi 5, 6 e 8 (Figura 1H; Figura 2D). Nella popolazione GZDS, un locus 45S era localizzato nella regione del centromero del braccio corto del cromosoma metacentrico 4 (Figura 1N; Figura 2G). Nello studio HNZX, sono stati osservati cinque loci di rDNA 45S nelle aree terminali dei bracci corti delle coppie di cromosomi 4, 5, 6, 7 e 8 (Figura 1H; Figura 2D). La distribuzione dei siti 45S in HBBD (Figura 1J; Figura 2E) e HNXN (Figura 1L; Figura 2F) era simile, con un locus nella regione del centromero del braccio corto del cromosoma 4 e tre loci nella regione del centromero dei bracci corti dei cromosomi 5, 6 e 7.

Nell'HBWF, cinque segnali di loci di rDNA 45S sono apparsi nelle regioni del centromero a braccio corto delle coppie di cromosomi 4, 5, 6, 7 e 8 (Figura 1N; Figura 2G). Nella SCLS, un segnale del locus dell'rDNA 45S è stato trovato nelle regioni centromeriche del braccio corto delle coppie di cromosomi 1 e 2, così come nelle regioni pericentromeriche dei bracci corti delle coppie di cromosomi 5 e 6 (Figura 1P; Figura 2H). Per i loci 5S dell'rDNA, sono stati identificati un totale di nove negli otto taxa, di cui 3 (33,33%) localizzati nelle regioni prossimali, 3 (33,33%) nelle regioni pericentromeriche e 3 (33,33%) nelle regioni terminali dei rispettivi bracci cromosomici (Figura 2; Tabella 2). In GXTL, un segnale del locus 5S rDNA è apparso vicino all'estremità terminale del braccio lungo della coppia di cromosomi 6 (Figura 1P; Figura 2G). La distribuzione dei siti 5S era simile nelle HBFC (Figura 1H; Figura 2D) e GZDS (Figura 1N; Figura 2G), entrambi contenenti un locus 5S rDNA nella regione prossimale del braccio corto del cromosoma 7. In HNZX, un locus di rDNA 5S è stato trovato vicino all'estremità terminale del braccio lungo del cromosoma 8 (Figura 1H; Figura 2D), mentre nell'HBBD è stato identificato un locus 5S di rDNA nel cromosoma 7 (Figura 1J; Figura 2E). Nell'HBWF, due loci di rDNA 5S sono apparsi vicino all'estremità terminale dei bracci lunghi dei cromosomi 4 e 8, altri due nel braccio lungo del cromosoma 7, uno nella regione del centromero e uno vicino all'estremità (Figura 1N; Figura 2G).

La combinazione dei segnali FISH dell'rDNA 45S e 5S, insieme alle caratteristiche del segmento CPD terminale, ha distinto efficacemente tutti i cromosomi mitotici provenienti da diverse popolazioni di Lycoris aurea (L'Hérit.) Erba. Nelle popolazioni SCLS, HBFC, HBBD, GZDS e GXTL, il cromosoma 1 ha mostrato forti segnali CPD nella regione centromerica. Il cromosoma 2 ha mostrato forti segnali CPD nella regione centromerica, con l'eccezione di GZDS e GXTL. Il cromosoma 3 ha mostrato un forte segnale CPD nella regione centromerica, ad eccezione della SCLS. Il cromosoma 4 ha costantemente mostrato forti segnali CPD nella regione centromerica. Per i cromosomi 5, 6 e 7, sono stati osservati forti segnali CPD alle estremità dei bracci corti. Il cromosoma 4 ha anche mostrato forti segnali di rDNA 45S alla fine del braccio corto, mentre i cromosomi 5 e 6 avevano forti segnali 45S nelle loro regioni terminali, tranne che in GZDS. In particolare, un forte segnale DAPI era presente nella popolazione GZDS. Inoltre, un debole segnale di rDNA 5S è apparso nella regione prossimale del cromosoma 7 nelle popolazioni HBFC, HBWF, HBBD e GZDS.

figure-results-1
Figura 1: Cromosomi mitotici di otto Lycoris aurea (L' Hér.) Popolazioni di erbe. Esame dei cromosomi in metafase mitotica di otto diversi Lycoris aurea (L' Herit.) Sono mostrate le popolazioni di erbe, tra cui la popolazione SCLS (A,B), la popolazione HNXN (C,D), la popolazione HNZX (E,F), la popolazione HFC (G,H), la popolazione HBWF (I,J) e la popolazione HBBD (K,L). L'ibridazione di GZDS (M,N) e GXTL (O,P) è stata eseguita utilizzando FISH con sonde di rDNA 45S marcate con biotina e 5S marcate con digossina dopo la colorazione CPD. Le immagini risultanti dei cromosomi dopo la colorazione CPD mostrano segnali di rDNA 45S (verde) e 5S (rosso). Il DNA totale è stato tinto al contrario con colorante DAPI, ottenendo un colore blu. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Diagrammi del cariotipo cromosomico di otto Lycoris aurea (L' Hér.) Popolazioni di erbe. Il diagramma del modello cromosomico per otto popolazioni di Lycoris aurea (L' Herit.) Herb rivela le caratteristiche della banda di fluorescenza, insieme alla posizione e alle dimensioni dei segnali FISH di rDNA 45S e 5S. Le popolazioni SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL sono rappresentate rispettivamente da (A-H). La scala ordinata indica la lunghezza relativa del cromosoma (la percentuale di quel cromosoma nel genoma aploide) e il numero in alto indica il numero di serie del cromosoma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Grafici a dispersione per otto Lycoris aurea (L' Hér.) Popolazioni di erbe in base a tre parametri del cariotipo. (A) L'indice CVCI viene confrontato con l'indice CVCL. (B) L'indice MCA è confrontato con l'indice CVCL. Sono indicate le popolazioni SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Il dendrogramma UPGMA di otto Lycoris aurea (L' Hér.) Popolazioni di erbe. Il dendrogramma UPGMA si basa sui parametri x, 2n, TCL, MCA, CVCL e CVCI per gli otto Lycoris aurea (L'Hér.) Popolazioni di erbe: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: PCoA degli otto Lycoris aurea (L' Hér.) Varietà di erbe aromatiche basate su sei parametri del cariotipo. Il PCoA si basa sui parametri x, 2n, TCL, MCA, CVCL e CVCI, che rappresentano SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Nomi di otto Lycoris aurea (L' Hér.) Popolazioni di erbe. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Distribuzione delle bande fluorocromiche e dei siti di rDNA negli otto Lycoris aurea (L' Hér.) Popolazioni di erbe. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Le sonde impiegate in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La preparazione di Lycoris aurea (L'Hér.) I cromosomi delle radici delle erbe comprendono diversi passaggi critici: (1) coltivare le radici tramite idroponica, (2) trattare le punte delle radici con α-bromonaftalene saturo, (3) fissare le radici utilizzando una soluzione di acido acetico alcolico, (4) eseguire l'idrolisi enzimatica sulle punte delle radici con una soluzione enzimatica e (5) schiacciare accuratamente le radici digerite e asciugare i vetrini sulla fiamma di una lampada ad alcool.

Una misurazione accurata dei cromosomi è essenziale per l'analisi del cariotipo negli studi citogenetici. I cromosomi dovrebbero presentare una notevole condensazione e confini chiaramente definiti; In caso contrario, il calcolo accurato dei parametri cromosomici diventa difficile5. Precedenti ricerche citogenetiche hanno dimostrato che la differenziazione morfologica dei cromosomi mitotici dipende dal grado di condensazione 4,36. Quando la condensazione è insufficiente, le estremità dei bracci cromosomici possono ancora essere desagglutinate, portando a confini cromosomici poco chiari. Tuttavia, quando i cromosomi raggiungono la massima condensazione, le differenze morfologiche tra i cromosomi diminuiscono. Pertanto, la selezione di cromosomi con condensazione moderata è fondamentale per l'identificazione e la misurazione dei cromosomi, specialmente nelle popolazioni con meno cromosomi.

La marcatura della sonda è fondamentale per il successo dell'ibridazione in situ dei FISH, in particolare per la soluzione di sonda 5S rDNA. A causa della breve sequenza di rDNA 5S, la concentrazione di sequenze bersaglio marcate mediante PCR è tipicamente bassa, portando a deboli segnali di ibridazione. La sintesi diretta di sonde marcate con fluoresceina, tuttavia, produce segnali di ibridazione più forti e semplifica il processo. Per la soluzione della sonda di rDNA 45S, le sequenze parziali delle regioni codificanti l'rRNA 5.8S, 18S e 25S di Arabidopsis thaliana sono state marcate alle estremità 5' e 3' con 6-carbossil-tetrametil rodamina (TAMRA) e poi miscelate. La soluzione della sonda di fluoresceina 5S rDNA è stata ottenuta utilizzando sequenze di nucleotidi 1-59 e 60-118 dalla regione codificante il gene dell'rRNA 5S di Arabidopsis , con ciascuna sequenza marcata all'estremità 5' con 6-carbossil-fluoresceina (6-FAM), quindi miscelata.

In questo studio, abbiamo sfruttato le differenze tra i coloranti DAPI e PI nel legame del DNA e li abbiamo combinati per ottenere bande fluorescenti chiare. I coloranti PI (ioduro di propidio) possono penetrare nelle membrane cellulari e legarsi alle molecole di DNA all'interno delle cellule. Al contrario, DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) si lega preferenzialmente alle regioni di DNA ricche di AT, fornendo una colorazione chiara e ad alto contrasto. A causa di queste proprietà complementari, DAPI e PI sono spesso utilizzati insieme, noti come colorazione CPD, per raccogliere informazioni sia sul nucleo che sul citoplasma contemporaneamente. Le differenze nella presenza, nella posizione e nelle dimensioni delle bande CPD e DAPI+ hanno rivelato una significativa differenziazione dell'eterocromatina nelle otto popolazioni di Lycoris aurea. La colorazione CPD ha mostrato regioni eterocromatiniche ricche di contenuto di GC sia nelle regioni centromeriche che pericentromeriche e all'interno dei cromosomi telocentrici.

Lo studio dell'asimmetria del cariotipo è un approccio tassonomico citogenetico popolare, economico e ampiamente utilizzato che incorpora una serie di parametri e indicatori, tra cui misure qualitative e quantitative, parametri di classificazione di Stebbins e vari indici quantitativi (ad esempio, Paszko10; Peruzzi et al.11). Tra questi, il rapporto R e il CVCL sono utilizzati per misurare l'asimmetria cromosomica, mentre CVCI e MCA rappresentano indicatori chiave dell'asimmetria cromosomica. In particolare, il CVCL è considerato un robusto parametro statistico per stimare l'asimmetria intercromosomica10 e la metrica per l'asimmetria cromosomica (MCA) è riconosciuta come una misura efficace per valutare l'asimmetria intracromosomica11. Per rappresentare al meglio le asimmetrie del cariotipo tra le popolazioni, si raccomanda un grafico a dispersione bidimensionale, con due stimatori di asimmetria posizionati rispettivamente sugli assi x e y, dove ogni campione è rappresentato come un punto11,12. I risultati hanno mostrato che i grafici a dispersione bidimensionali di CVCL vs. CVCI, così come MCA vs. CVCL, illustrano efficacemente le relazioni di asimmetria del cariotipo tra le otto distinte popolazioni di Lycoris aurea (L'Herit.) Herb, supportando l'affidabilità di questi indici nella valutazione dell'asimmetria cromosomica.

Per confrontare i cariotipi e ricostruire le relazioni cariologiche tra le otto popolazioni, questo studio ha applicato la metodologia proposta da Peruzzi et al.11, utilizzando i parametri x, 2n, TCL, MCA, CVCL e CVCI. I risultati hanno rivelato che le popolazioni di HBWF, GZDS, HBBD e GXTL erano strettamente correlate, con HBFC posizionato tra questi gruppi. Di conseguenza, la PCoA basata su questi sei parametri si è dimostrata un metodo molto efficace per differenziare le relazioni tra le otto popolazioni. Tuttavia, alcuni modelli complessi sono emersi anche dall'albero evolutivo molecolare costruito. Ad esempio, mentre HNZX sembrava strettamente correlato a HBWF nell'albero filogenetico molecolare, era più lontanamente correlato nel grafico a dispersione PCoA. Questa complessità evidenzia l'importanza di impiegare molteplici approcci quantitativi per prevedere le tendenze nell'evoluzione del cariotipo all'interno di Lycoris, integrando le caratteristiche di classificazione molecolare.

Le piante per questo studio sono state campionate dalla Cina centrale e occidentale, tra cui la contea di Tianlin, la provincia di Guangxi (GXTL), la contea di Fang, la provincia di Hubei (HBFC), la contea di Dushan, la provincia di Guizhou (GZDS), la contea di Zixing, la provincia di Hunan (HNZX), la contea di Badong, la provincia di Hubei (HBBD), la contea di Xinning, la provincia di Hunan (HNXN), la contea di Wufeng, la provincia di Hubei (HBWF) e la contea di Lushan, provincia del Sichuan (SCLS). Un esemplare buono è stato conservato presso l'Erbario dell'Università di Huaihua. Questo studio ha rilevato che la combinazione dei segnali FISH dell'rDNA 45S e 5S e le caratteristiche del segmento CPD terminale distinguono efficacemente tutti i cromosomi mitotici di diverse popolazioni di Lycoris aurea (L'Herit.) Erba. Il protocollo qui presentato mira a studiare la distribuzione dell'eterocromatina tra diverse popolazioni di Lycoris aurea (L'Herit.) Erba. La colorazione inversa CPD (una combinazione di PI e DAPI) e DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilidolo) sono tecniche consolidate per osservare la struttura nucleare e la distribuzione della cromatina. La marcatura fluorescente diretta delle regioni geniche dell'rRNA 18S-5.8-26S (regioni dell'rDNA 45S) e del DNA ribosomiale 5S per l'ibridazione del cromosoma FISH è semplice e fornisce robusti segnali di ibridazione. Questa distinzione qualitativa sarà sempre più preziosa nell'analisi delle varie popolazioni.

Questo metodo è più adatto per le specie vegetali in grado di coltivare rapidamente l'apice delle radici, poiché la coltura dell'apice delle radici è necessaria durante la mitosi attiva. A causa della breve sequenza 5S, lo studio ha utilizzato la sequenza nucleotidica 1-118bp della regione codificante il gene 5S rRNA di Arabidopsis thaliana come sonda 5S rDNA. A causa della sua breve sequenza e del segnale debole, questo metodo è efficace solo per identificare specie con basi relativamente conservate nella regione 1-118bp del gene 5S rRNA. La selezione di cromosomi in metafase con condensazione moderata è fondamentale per il successo del metodo. La condensazione cromosomica è strettamente correlata ai tempi di raccolta delle radici, alla durata del pretrattamento e alla cottura alla fiamma. Pertanto, la tecnica richiede un controllo preciso su ogni fase per garantire il successo sperimentale.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation of China (32070367).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AlcolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%,  90%,  100%)
1&volte; Fornitore verificato - TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081&volte;, 10&volte;
2&volte; Fornitore verificato - SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092 volte, 20 volte
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA viene aggiunto ad entrambe le estremità (5 'e 3' estremità)
4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5' end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naftaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718
Agente anti-burnout di saturazioneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Incubatore biochimicoShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Acido citricoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
di formamide deionizzata (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000,7
destrano solfatoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Strumento di ibridazione in situ a fluorescenzaUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Microscopio a fluorescenzaOlympus  Cina  Co.ltdBX60
Acido acetico glacialeSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
Macchina per il ghiaccioDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.Microscopio biologico ST-70
LeicaGermania Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Alcool metilicoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
software MetMorphMolecular DevicesVersione 7.35
FornoThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
di PepsinaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Ioduro di propidio(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Sperma di salmone DNA (ssDNA)Reagente Aladino Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
Citrato di sodioAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica per Windows 10.0 per analisi statistiche

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

45S rDNA Sites5S rDNA SitesChromosome NumberKaryotype VariationGenome DifferentiationKaryotype Asymmetry
Video in arrivo

Articoli correlati