Il laboratorio galleggiante: procedura operativa standard per la raccolta e il filtraggio di campioni di acqua di mare dai traghetti operativi per l'analisi del DNA ambientale

Sommario

Qui, presentiamo un nuovo protocollo per recuperare l'eDNA marino attraverso la raccolta e la filtrazione di campioni di acqua di mare da traghetti operativi e altre navi commerciali.

Abstract

Gli strumenti genetici per recuperare informazioni dalle tracce di DNA ambientale sono ben consolidati sia per la caratterizzazione mirata che per quella tassonomicamente ampia della biodiversità. Tuttavia, nel contesto marino, la raccolta di campioni di eDNA da aree scarsamente accessibili, come in acque abissali o offshore, può ancora essere una limitazione. L'utilizzo di traghetti di linea o navi commerciali che attraversano grandi distese di mare aperto può costituire preziose piattaforme opportunistiche per la raccolta di campioni ambientali. I vantaggi sono innumerevoli, dalla possibilità di raccogliere dati in qualsiasi condizione meteo e in qualsiasi momento della giornata alla ripetibilità nel tempo, essendo i percorsi costanti, e con una totale riduzione dei costi e delle emissioni di carburante. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'approccio è possibile e di successo. Tuttavia, il processo di acquisizione di campioni dal ventre di queste grandi navi marine potrebbe non essere immediato. Questo lavoro illustra in ogni dettaglio come la raccolta, l'organizzazione e il filtraggio dell'acqua di mare dalle grandi navi possono essere preparati, organizzati ed eseguiti.

Introduzione

Negli ultimi decenni, l'analisi del DNA ambientale (eDNA), ovvero l'individuazione del materiale genetico lasciato dagli organismi nell'ambiente, è cresciuta rapidamente come strumento di monitoraggio promettente per le comunità animali d'acqua dolce e marina. Questa tecnica molecolare offre la possibilità di identificare contemporaneamente più taxa all'interno di un singolo campione (approccio metabarcoding), consentendo la rilevazione delle comunità biologiche che abitano o attraversano l'area campionata 1,2,3,4,5.

Attualmente, la vera sfida è raggiungere i punti di campionamento, poiché spesso è economicamente e/o logisticamente impraticabile raccogliere campioni su larga scala geografica, con il risultato che le aree pelagiche sono solitamente sottocampionate rispetto alle aree costiere più accessibili⁶. L'utilizzo di traghetti o altre navi commerciali consente di effettuare transetti di campionamento altamente replicabili, in quanto seguono rotte marittime specifiche che sono tipicamente costanti durante la stagione e coprono vaste aree ^7,8. Inoltre, l'utilizzo delle rotte dei traghetti come mezzo di campionamento consente la raccolta dei campioni in qualsiasi momento della giornata e in ogni stagione, indipendentemente dalle condizioni meteo-marine, oltre a presentare numerosi altri vantaggi (Figura supplementare 1). Studi preliminari ne hanno dimostrato sia la fattibilità che l'accuratezza per la valutazione degli indici di biodiversità ^9,10. I campioni d'acqua possono essere raccolti dalla sala macchine del traghetto tramite un tubo di derivazione che intercetta l'acqua di raffreddamento marina a monte dei motori. LIFE-CONCEPTU MARIS (CONservation of CEtaceans and Pelagic sea TUrtles in Med: Managing Actions for their Recovery In Sustainability) è il primo progetto in cui questo proof of concept è stato messo in pratica su larga scala: mira alla raccolta di 500 campioni (nell'arco di due anni), e prevede l'impegno non di una ma di diverse compagnie di traghetti e di diversi vettori, permettendo di evidenziare eventuali criticità e affinare le strategie di campionamento per meglio adattarsi ai più diversi contesti che si possono incontrare a bordo. Descriviamo di seguito le caratteristiche del progetto per la sua componente relativa alla raccolta su larga scala di campioni di DNA ambientale marino (per la descrizione del progetto, visita https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

La decisione di intraprendere una campagna di campionamento utilizzando un traghetto di linea implica alcune azioni che devono essere intraprese prima del campionamento vero e proprio, che è l'aspetto direttamente affrontato in questo lavoro. Qui, menzioniamo brevemente le azioni che devono precedere il campionamento a bordo da qualsiasi nave commerciale.

Questo è un aspetto da non trascurare e che determina il successo della campagna di raccolta. Le compagnie di navigazione sono enti commerciali e non di ricerca e, pertanto, non sono, e non sono tenute ad essere, a conoscenza delle finalità e degli obiettivi della ricerca scientifica che si intende svolgere a bordo. Ciò implica un'importante e delicata fase iniziale in cui gli obiettivi del progetto scientifico proposto, che può essere multidisciplinare, devono essere trasmessi e motivati dai vertici della compagnia di navigazione stessa. Nel caso specifico del progetto CONCEPTU MARIS, ciò è stato reso possibile da un rapporto pluridecennale in cui le compagnie di navigazione erano già state coinvolte in progetti di monitoraggio visivo (es. Fixed Line Transects [FLT]⁷), che ha determinato un rapporto di reciproca stima necessario per poter ottenere il via libera per l'accesso alle sale macchine indispensabile per l'approccio di campionamento oggetto di questo lavoro.

Il tipo di regime di campionamento adottato nel progetto CONCEPTU MARIS è duplice: i campioni vengono prelevati sia in stazioni di campionamento fisse (FSS, vedi sotto) sia in occasione degli avvistamenti di cetacei "rari". Queste rappresentano le specie che sono meno avvistate durante i transetti FTL¹¹, vale a dire: delfino comune (Delphinus delphis), zifio di Cuvier (Ziphius cavirostris), globicefalo (Globicephala melas), delfino di Risso (Grampus griseus), capodoglio (Physeter macrocephalus) e balenottera comune (Balaenoptera physalus). Un ulteriore campione d'acqua viene raccolto solo quando l'avvistamento delle specie rare segnalate dal team di censimento visivo (team FLT) avviene più di mezz'ora prima o dopo uno degli FSS. I campionamenti effettuati in concomitanza con gli avvistamenti saranno necessariamente tutti diurni.

Le stazioni di campionamento fisse (FSS), la cui geolocalizzazione rimane invariata durante le crociere, vengono individuate in anticipo e concordate con l'intero team di lavoro. Le posizioni geografiche degli FSS sono selezionate in base a: 1) la presenza di un sito di interesse biologico sulla base di precedenti dati osservativi/di letteratura; 2) priorità data ai punti che indicano cambiamenti di habitat su mappe batimetriche (es. bordo della piattaforma continentale); 3) copertura omogenea delle rotte di navigazione designate, selezionando quindi siti di campionamento approssimativamente equidistanti (circa 35-45 miglia nautiche l'uno dall'altro), al fine sia di coprire l'intera rotta sia di prevedere la raccolta di campioni anche notturni.

Al fine di garantire che i campioni adiacenti siano prelevati in momenti diversi della giornata e che vi sia tempo sufficiente tra due campioni consecutivi per completare l'elaborazione dei campioni, si consiglia di prelevare campioni da FSS adiacenti, uno all'andata e uno al ritorno. Ciò significa che se gli FSS sono numerati in base all'ordine cronologico in cui vengono campionati, non appariranno in ordine consecutivo sulla mappa. Ad esempio, se vengono selezionati 6 FSS, 3 verranno campionati all'andata e 3 al ritorno. "Il loro ordine lungo il percorso sulla mappa sarà PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, con le tre stazioni di campionamento in corsivo (FSS4, FSS5 e FSS6) rilevate nel viaggio di ritorno (vedi Figura 1).

Ogni singolo FSS ha un numero di identificazione univoco (ovvero, nessuno degli FSS identificati su rotte diverse condivide lo stesso numero di identificazione). La numerazione viene assegnata la prima volta che viene campionato un FSS e seguirà la numerazione progressiva. Pertanto, al termine del progetto, gli FSS a basso numero saranno quelli che sono stati testati per diversi anni o per i quali sono disponibili i dati più vecchi.

Ogni campione è costituito da circa 13 litri di acqua di mare raccolti in ogni stazione di campionamento. L'acqua di mare viene travasata direttamente dal tubo di derivazione del traghetto in contenitori "Bag-in-the-Box" (BiB), ovvero sacchetti di plastica laminati con foglio sterile, fino all'elaborazione del campione (vedi sotto). Le caratteristiche e i vantaggi del sistema di campionamento Bag-in-Box (BiBSS) sono illustrati in dettaglio da Valsecchi et al. (2021)⁹ e sono riportati anche qui in Figura 2 per comodità.

Protocollo

1. Prepararsi in laboratorio

1. Lista di controllo dell'attrezzatura
   1. Consulta la lista di controllo per gli elementi da prendere in considerazione sia per la raccolta che per la filtrazione dei campioni. È mostrato nel file supplementare 1. Ogni articolo e il suo utilizzo saranno spiegati nelle sezioni seguenti.
   2. Stampare una copia del Fascicolo Supplementare 1 e compilarlo prima della partenza per la campagna di campionamento.
2. Preparazione del sistema di campionamento Bag-in-Box
   1. Preparare i Bag-in-Box in laboratorio, possibilmente sotto la cappa aspirante, prima dell'imbarco. Sigillare le tre aperture (quella sul sacchetto, parte del tappo che chiude il sacchetto e l'uscita dal rubinetto) con pellicola sigillante (Figura 3, Tabella dei materiali).
   2. Arrotolare ermeticamente i sacchetti, con il tappo staccato e sigillato all'interno, e chiuderli con un nastro adesivo per evitare che si riaprano durante il trasporto (Figura 3).
   3. Eseguire questa operazione facendo attenzione a non far entrare aria nel sacchetto durante la suddetta manovra di chiusura, sia (i) per evitare possibili contaminazioni trasportate dall'aria che entra nel sacchetto sia (ii) per evitare che il sacchetto piegato diventi più ingombrante (se contiene aria).

2. Prepararsi a bordo

1. Coordinamento con i membri dell'equipaggio
   1. Appena a bordo, condividi i punti di campionamento selezionati con il comandante e il suo equipaggio in modo che vengano indicati gli orari in cui il traghetto sarà più vicino a ciascun punto selezionato come "Stazione di Campionamento Fissa" (FSS).
   2. Annotare il tempo di campionamento per ogni FSS e la velocità di crociera attuale (o media, se disponibile) del traghetto per quella tratta: questo permette di stimare l'estensione (km) del tratto di mare campionato.
   3. Poiché il traghetto non passa mai esattamente nello stesso punto, correggi le coordinate di ogni raccolta di campioni di acqua di mare dopo il campionamento effettivo.
      NOTA: L'intervallo esatto di campionamento è il dato più importante per una fedele identificazione dell'area marina effettivamente campionata; pertanto, è utile stampare una mappa dei punti approssimativi in cui riportare le coordinate di campionamento effettive (ad esempio, nel File Supplementare 2).
   4. Se la compagnia concede l'accesso alla sala macchine, chiedi di essere accompagnato in camera.
   5. Indossare i dispositivi di protezione individuale (DPI) prima di entrare in sala macchine. Qui l'ambiente è inospitale (rumore assordante e temperature elevate) e ricco di punti potenzialmente insidiosi (scale ripide, grandi fessure nei pavimenti). Una volta ottenuto il permesso di entrare nella sala macchine, munirsi di tutte le attrezzature di sicurezza essenziali, come scarpe antinfortunistiche, casco e cuffie di protezione dell'udito.
   6. Se la superficie filtrante è fornita dalla compagnia di spedizioni (di solito è consigliabile avere un proprio tavolo pieghevole), verificare che questa zona possa essere sanificata tra un campione e l'altro utilizzando una soluzione di candeggina al 10%.
2. Sistemarsi in sala macchine
   1. Poiché sulle navi sono presenti varie prese d'acqua di mare, è necessario rivolgersi al responsabile della sala macchine, che consente un percorso minimo per l'acqua aspirata attraverso i tubi della nave per ridurre al minimo la contaminazione del campione d'acqua con sostanze e organismi che possono essere trovati nei tubi.
   2. Una volta individuato il punto/bocca di porto più idonea per la raccolta dell'acqua di mare in ingresso, chiedere al personale se il rubinetto di raccolta del campione può essere tenuto leggermente aperto per tutta la durata della crociera in modo da risciacquare continuamente la tubazione utilizzata per la raccolta del campione con acqua "locale". Smaltire l'acqua di mare che scorre incessantemente dal rubinetto in sentina.

3. Raccolta del campione d'acqua (in sala macchine)

NOTA: La Figura 4 mostra le fasi della raccolta dei campioni di acqua di mare.

1. Preparazione per la raccolta dell'acqua
   1. Portare tutta l'attrezzatura necessaria (prima parte Lista di controllo del file supplementare 1 ) in sala macchine. Raggiungi la sala macchine almeno 15 minuti prima dell'orario di campionamento previsto per sterilizzare l'area in cui vengono maneggiati i BiB utilizzando una soluzione di candeggina al 10%.
   2. Se il rubinetto dedicato non è stato lasciato aperto per tutta la durata della crociera, aprirlo per la raccolta dei campioni di acqua di mare e lasciare scorrere l'acqua per almeno 5 minuti (l'acqua viene smaltita in sentina) prima del prelievo effettivo (Figura 4A).
   3. Preparare la stazione di filtraggio.
      NOTA: Ci sono diversi accorgimenti nell'allestimento della stazione di filtraggio che possono migliorare significativamente l'efficienza della filtrazione (vedi passaggio 4.3): 1) utilizzare palloni sottovuoto ad alta capacità (pallone da 2 L, 4 L o 5 L, a seconda del volume da prelevare). Questo, oltre a far risparmiare il tempo necessario per svuotare il pallone tra 1 L e il successivo, riduce al minimo la movimentazione del cilindro di filtrazione e, quindi, l'eventuale contaminazione; 2) si possono utilizzare più palloni filtranti disposti in serie, misura che permette la filtrazione simultanea di più campioni (sacchi). Questa misura è consigliata in regimi di campionamento ristretti, dove altrimenti c'è il rischio di non avere il tempo necessario per processare i sacchi prima di raggiungere il porto di attracco.
   4. Utilizzare un pennarello indelebile per preparare ed etichettare il BiB scrivendo su di esso: 1) il codice identificativo alfanumerico univoco del campione su entrambi i lati del BiB (importante soprattutto se i BiB non vengono lavorati subito a bordo e vengono filtrati a terra) 2) la data; 3) l'ora esatta di inizio del riempimento del BiB.
2. Raccolta dell'acqua
   1. Rimuovere la pellicola sigillante dall'apertura del BiB e iniziare a riempirla fino a riempirla completamente (circa 13 L) (Figura 4B).
   2. Quando il sacchetto è quasi pieno, rimuovere la pellicola sigillante dal coperchio, ma non dall'apertura del rubinetto: mantenere la pellicola sigillante attorno al rubinetto sicura di sicurezza (linguetta di plastica rossa) fino alla filtrazione (Figura 4C). Sigillare il BiB con il coperchio, premendolo bene fino a completa chiusura.
   3. Prendere nota dell'ora esatta in cui la raccolta del campione è completata: consente di calcolare la durata totale (minuti) della raccolta del campione.
3. Dopo la raccolta dell'acqua
   1. Scrivere con il pennarello indelebile sul BiB l'ora esatta in cui la raccolta del campione è completata e riportare tutti i dati sulla scheda di raccolta/filtrazione del campione (File supplementare 2).
   2. Trasferire il BiB riempito nel locale di stoccaggio o nell'area di filtrazione (uno spazio dedicato nella sala macchine stessa o in una cabina).
   3. Trasferire tutti i dati sul modulo di raccolta/filtrazione del campione (File supplementare 2).
      NOTA: Il File Supplementare 2 riporta la scheda di raccolta/filtrazione del campione da compilare a bordo in tutte le sue parti.
      1. Per la parte relativa alla raccolta del campione (verde), inserire l'orario di inizio e fine del campionamento dell'acqua di mare dalla sala macchine.
      2. In secondo luogo, dopo aver consultato i membri dell'equipaggio o le registrazioni GPS, inserire le coordinate geografiche relative all'inizio e alla fine del campionamento e della velocità di crociera. Ciò consente di calcolare successivamente la lunghezza del segmento di mare campionato.
         NOTA: Per quanto riguarda la parte relativa al filtraggio (blu), verrà indicato se la filtrazione avviene a bordo o successivamente a terra: per ognuno dei 3 filtri saranno indicati i tempi di filtraggio.

4. Filtrazione del campione di acqua di mare

1. Prepararsi per la filtrazione
   NOTA: Da questo momento in poi, il processo di filtrazione può essere gestito secondo diversi protocolli in base agli obiettivi specifici del progetto di ricerca. Il protocollo qui descritto consente una filtrazione efficiente di una grande quantità di acqua di mare (più di 10 litri) direttamente a bordo, evitando i vincoli di volume inerenti ad altri kit o protocolli commerciali comunemente usati. Quando possibile, filtrare i campioni d'acqua a bordo: la filtrazione può avvenire sia nella sala macchine stessa che in una cabina, preferibilmente situata vicino alla sala macchine. È sempre auspicabile filtrare i campioni di acqua di mare subito dopo la raccolta, sia per limitare la degradazione dell'eDNA che per comodità, evitando così lo sbarco con grandi volumi di acqua di mare da trattare. Se non è possibile, i campioni possono essere conservati nei contenitori Bag-in-Box e trasportati per essere successivamente filtrati.
   1. Nell'apposito spazio dedicato alla filtrazione a bordo (in sala macchine o in una cabina dedicata), preparatevi con tutto quanto elencato nella seconda parte della lista di controllo del File Supplementare 1 e montate il sistema di filtraggio come mostrato in Figura 5.
   2. Preparare il cilindro di filtrazione (Tabella dei materiali) come mostrato nella Figura 6 e nella Figura 7. Usa un nuovo cilindro per ogni stazione, un nuovo paio di pinzette monouso o un paio di pinzette sterilizzate.
      NOTA: Un singolo cilindro può essere utilizzato più volte per filtrare i campioni dalla stessa posizione. Tuttavia, deve essere sterilizzato con candeggina al 10%, seguito da risciacquo con acqua dolce, prima di essere lasciato asciugare all'aria in laboratorio e quindi confezionato singolarmente per essere conservato fino alla campagna successiva.
   3. Prima di iniziare la filtrazione, compilare il registro dei dati di raccolta/filtrazione del campione (File supplementare 2). Questo è necessario sia per tenere traccia del numero di litri lavorati sia per misurare il tempo di filtraggio (indicativo della quantità di particolato nel campione). Non appena la pompa del vuoto viene attivata, avviare il timer per misurare il tempo di filtraggio.
2. Filtrazione a bordo
   1. Al fine di ridurre al minimo il rischio di contaminazione (soprattutto quando vengono lavorate più maniche contemporaneamente, vedi sotto), isolare il flusso d'acqua da filtrare dall'ambiente circostante posizionando un manicotto isolante - sacchetto di plastica - tra il rubinetto e il cilindro filtrante (vedi Figura 7).
      NOTA: Questa è una precauzione importante in quanto la sensibilità delle tecnologie utilizzate per l'analisi del DNA ambientale rende l'approccio particolarmente suscettibile alla contaminazione ambientale (da parte dell'operatore o alla contaminazione incrociata tra campioni).
   2. Attivare la pompa del vuoto e filtrare fino a 4 L di acqua per ogni filtro. Mantenere il cilindro sempre pieno durante la filtrazione per evitare che l'aria penetri nel sistema e rallenti il processo di filtrazione.
      NOTA: Per quanto riguarda la scelta della porosità della membrana, questa dipende dallo scopo della ricerca, dai gruppi tassonomici target e dalla quantità di acqua che si intende trattare. Questo problema è stato affrontato in lavori precedenti ^9,12.  in cui sono stati confrontati filtri di diversa porosità. Per lo studio dei vertebrati e la scelta di trattare 4 litri di acqua per filtro, una membrana con una porosità di 0,45 μm si è rivelata la soluzione migliore, permettendo di trattare grandi volumi d'acqua senza causare ingombri del filtro dovuti alla saturazione dei pori.
   3. Quando il livello dell'acqua filtrata all'interno del pallone raggiunge il segno di livello di 4 L, spegnere la pompa del vuoto e arrestare il timer, riportando il valore del tempo di filtrazione sul registro dati.
      NOTA: Da ogni BiB di 12/13 L si otterranno 3 repliche tecniche, di 4 L ciascuna (denominate A, B e C).
   4. A questo punto, utilizzando le pinzette (e, se necessario, uno stuzzicadenti sterile per aiutare a sollevare il bordo del filtro), recuperare il primo filtro (filtro A) dal cilindro, come mostrato in Figura 8, evitando ogni possibile danneggiamento del filtro.
   5. Piegare il filtro a metà (con il lato che tratteneva il materiale biologico ripiegato su se stesso) e avvolgerlo in un foglio di alluminio, scrivendo subito il numero del campione e l'ID del filtro replicato (ad esempio, 15A) sull'involucro. Conservalo nel congelatore di bordo fino allo sbarco.
   6. Montare un nuovo filtro (filtro B) all'interno del cilindro di filtrazione per elaborare un altro campione da 4 L (Figura 9). Svuotare il pallone e ricominciare con il filtraggio della seconda replica fino a quando 4 L non sono completamente filtrati. Recuperare il filtro B come spiegato e ripetere gli stessi passaggi per il filtro C.
3. Buone pratiche
   1. Per accorciare i tempi di filtraggio, utilizzare un pallone sottovuoto capiente in grado di accogliere tutta l'acqua filtrata trattata attraverso un unico filtro (quindi, in questo caso, una capacità di almeno 4 L).
   2. Ridurre notevolmente i tempi di filtrazione filtrando più maniche contemporaneamente disponendo l'apparato filtrante in parallelo (cioè più palloni sottovuoto serviti da un'unica pompa).
      NOTA: Nella campagna CONCEPTU MARIS, sono state adottate entrambe le strategie (Figura 10). Si noti che massimizzare l'efficienza di filtraggio è molto importante in quanto il numero di campioni raccolti lungo un percorso può essere elevato. E' quindi necessario processare i sacchi in tempi brevi al fine di evitare di accumulare campioni con il rischio di dover sbarcare i sacchi se non c'è abbastanza tempo per processarli a bordo.
   3. Al fine di monitorare l'incidenza dei falsi positivi (contaminazione), includere nella procedura di filtraggio, almeno una volta per crociera, un "blank-bag", filtrando in parallelo ai campioni un sacco riempito con acqua potabile prelevata da bottiglie sigillate. Questo campione di controllo non richiede repliche e lo considera come il resto dei campioni e lo include nell'esecuzione NGS.
4. Stoccaggio e trasporto filtri
   1. Dopo la filtrazione, conservare tutti i filtri a una temperatura compresa tra -4 °C e -20 °C fino a un'ulteriore lavorazione in laboratorio.
   2. Raccogliere i campioni dal congelatore di bordo appena prima dello sbarco e prepararli per il trasporto a basse temperature utilizzando refrigeratori trasportabili, come mostrato nella Figura 11.
      NOTA: Se i campioni non vengono filtrati a bordo, le sacche di acqua di mare vengono trasportate in modo più sicuro se tenute in verticale con il tappo tenuto sul lato superiore, sostenute a coppie all'interno di buste della spesa all'interno di casse di plastica per facilitarne il trasporto (Figura 12).

Risultati

Eseguendo il protocollo come descritto, l'operatore raccoglierà un numero di filtri pari al numero di FSS moltiplicato per 3 repliche. Ogni filtro conserva tracce biologiche (DNA ambientale) su uno dei due lati. Le fasi analitiche successive all'estrazione dell'eDNA dipendono fortemente dalla domanda, dal target e dall'obiettivo della ricerca. Ad esempio, nello studio pilota di Valsecchi et ^al.9, il protocollo di raccolta dell'eDNA descritto ha permesso la progettazione di un'indagine replicabile ...

Discussione

Poiché i passaggi del protocollo sono semplici e diretti, ci sono alcune considerazioni rilevanti da considerare quando si lavora su traghetti commerciali. Il tubo di derivazione dell'acqua di raffreddamento si trova solitamente nell'area della sala macchine, il cui accesso può essere limitato o soggetto ad autorizzazione preventiva. Pertanto, assicurarsi di avere tale autorizzazione, insieme agli adeguati dispositivi di protezione individuale, è fondamentale (Figura...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Membrane filtranti diametro 4,7 cm	Biosigma S.p.A.	https://www.biosigma.com/	Membrane filtranti da 0,45 μ m porosità, confezionato singolarmente
Fiasche da 4/5 L	Duran	Fiaschetta in vetro da https://www.duran-bottle-system.com/	5 L con tappo
Tamponi in carta assorbente	Advantec MFS, Inc.	https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1	Tamponi assorbenti in carta da filtro, misura 47 mm.
Bag-in-Box (BiB)	G.M.V. Agricenter S.r.l.	Sacchi in scatola da https://www.gmvagricenter.it/	10 litri con rubinetto
Cilindri filtranti	Sartorius AG	https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#	Biostart 100 Cilindri monitor, con 0,45 μ M membrana inclusa
Pellicola sigillante	Merck	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc& utm_campaign=Tutti+product_ dsa_WW_%28Bing+EbizPFS%29& utm_id=626946489& utm_content= 1166583023365595& msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f& utm_term = %2Fproduct%2F	4 pollici x 125 piedi rotolo di pellicola sigillante da laboratorio
Pompa per vuoto	KNF Group	https://knf.com/en/us	Laboport pompa per vuoto portatile N. 96