Studio dell'esposizione cronica dei topi alle radiazioni ultraviolette B

Le frequenze della radiazione solare che raggiungono la superficie terrestre includono l'ultravioletto (UV), la radiazione UVA (320-400 nm) e la radiazione UVB (280-320 nm). Gli UVB sono un induttore di mutazioni. I raggi UV sono stati riconosciuti come cancerogeni nel 1928¹ e dalla metà del 1900 la riduzione dell'esposizione al sole è stata raccomandata come misura precauzionale per evitare il cancro della pelle². Sebbene gli UVB siano chiaramente un fattore scatenante ambientale per il cancro della pelle, la ricerca nell'ultimo decennio³ con recenti studi del nostro gruppo ^4,5,6 ha dimostrato che gli UVB hanno ampi effetti sui sistemi fisiologici. Uno studio su una coorte di donne seguite per oltre 20 anni ha rivelato che l'aspettativa di vita era più alta di 2 anni nelle donne che non evitavano il sole rispetto alle donne che lo facevano⁷. Ulteriori studi hanno dimostrato che l'esposizione al sole era correlata a una diminuzione delle malattie cardiovascolari e della mortalità complessiva ^8,9,10. Sono state riportate anche correlazioni inverse tra la luce solare e il cancro del colon e il cancro dell'endometrio⁸. L'esposizione ai raggi UVB induce anche il metabolismo epatico¹¹, protegge dalla lipotossicità epatocellulare e dalle malattie metaboliche e ha effetti positivi sulle endorfine e sui comportamenti sessuali ^3,6. Queste linee di prova indicano gli effetti dannosi sulla salute umana dell'evitare l'esposizione al sole. Gli effetti benefici dell'esposizione al sole sono stati principalmente attribuiti all'induzione della produzione di vitamina D, tuttavia, almeno alcuni dei benefici per la salute della luce solare sono indipendenti dai livelli di vitamina D ^4,6,12

La pelle è l'organo più grande del corpo ed è la prima linea di difesa contro i fattori di stress ambientale. Gli strati epidermico e dermico della pelle sono separati da uno strato epidermico basale composto da cheratinociti e melanociti indifferenziati e autorinnovanti¹⁰. I cheratinociti a stadi crescenti di differenziazione terminale si trovano nello strato epidermico superiore. Il derma comprende fibroblasti e vasi sanguigni e l'ipoderma è costituito principalmente da adipociti. La pelle è un organo dermato-endocrino poiché più recettori degli ormoni, come il recettore degli androgeni e il recettore dell'ormone di rilascio della corticotropina, sono espressi nella pelle, suggerendo che gli ormoni influenzano i processi nella pelle per vie paracrine e autocrine 13,14,15. La pelle è anche produttrice di ormoni. Con poche eccezioni, tuttavia, la produzione di ormoni nella pelle e il rilascio nel sangue non sono stati documentati, né sono noti i fattori scatenanti dell'espressione (revisione in¹⁶).

È stato dimostrato che gli UVB hanno un potenziale terapeutico nelle malattie della pelle. La fototerapia, che comprende la terapia con psoralene-UVA e UVB a banda stretta, è la principale modalità di trattamento per la vitiligine generalizzata¹⁷. La risposta alla fototerapia si è verificata nel 74% dei pazienti a 6 mesi e nel 75% dei pazienti a 12 mesi dall'inizio del trattamento¹⁸. Il meccanismo d'azione della fototerapia nella vitiligine non è ben compreso. La sua azione terapeutica comporta una combinazione di effetti sulla cinetica del ciclo cellulare, alterazioni dell'espressione delle citochine, effetti sui melanociti e immunomodulazione. Numerosi studi hanno esaminato gli effetti della fototerapia sull'immunità cutanea 19,20,21; Tuttavia, gli effetti sistemici sono poco compresi, soprattutto nel contesto della vitiligine. A differenza della psoriasi, dove uno studio ha mostrato una diminuzione delle citochine proinfiammatorie e un aumento delle cellule T regolatorie dopo il trattamento con fototerapia, nella vitiligine, il numero di cellule T regolatorie è diminuito con la fototerapia UV²¹.

Sebbene gli UVB abbiano effetti sul cervello^14,15, sulle ghiandole surrenali²², sulle ovaie ^5,6, sui testicoli 6, sul fegato¹¹ e sui linfonodi²³, i meccanismi con cui gli UVB modulano i sistemi sistemici sono per lo più sconosciuti. Questo protocollo di ricerca descrive un modello murino per lo studio degli effetti sistemici e locali (della pelle) dell'esposizione ai raggi UVB che faciliterà lo studio degli effetti completi dell'esposizione ai raggi UVB. Il modello murino UVB è di ampio interesse per la fisiologia della pelle, la dermatologia e il cancro della pelle, in particolare il melanoma. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo semplice ma robusto ed efficace per sviluppare il modello murino UVB per domande di ricerca scientifica relative alla pelle. Il protocollo descrive come superare le sfide dell'eritema cutaneo associate alla depilazione e all'esposizione ai raggi UVB in condizioni fisiologiche ed è efficace nello studio degli effetti locali e sistemici dei raggi UVB sulla pelle.

Tutte le procedure sperimentali descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Tel Aviv (permesso IACUC: 01-20-043).

1. Assuefazione dei topi per l'esperimento

1. Ottieni topi C57BL/6J di 7-8 settimane acquistandoli da un fornitore commerciale o allevandoli internamente, a seconda del protocollo IACUC dello sperimentatore. Questo protocollo testa i topi di 15 settimane in background C57BL/6J, ma il protocollo deve essere calibrato su altri ceppi di topi e per età più giovani (< 7 settimane).
   NOTA: Il protocollo per l'utilizzo dei diversi topi di età deve essere approvato dall'IACUC dell'istituto in cui si svolgerà l'esperimento. Vengono forniti dettagli sullo stato di salute degli animali (Tabella supplementare 1).
2. Abituare i topi per almeno 7 giorni prima dell'inizio dell'esperimento. L'assuefazione è fondamentale per i topi dopo il trasporto e la logistica.

2. Alloggiare i topi

1. Alloggiare gli animali in gabbie domestiche con lettiera standard ad libitum e accesso al cibo e all'acqua standard in un ciclo standard di buio/luce di 12:00 h (ore di luce: 07:00 - 19:00 h e ore di buio: 19:00-07:00 h) a temperatura standard 22 ± 1°C e 32%-35% di umidità.
   NOTA: Abbiamo testato questo protocollo sull'accesso dietetico limitato e funziona bene anche in quelle condizioni sperimentali.
2. Assicurarsi che il numero di topi per gabbia sia conforme al loro peso corporeo, alle dimensioni della cucciolata e all'ipotesi sperimentale.

3. Rasatura e depilazione

1. Prima della rasatura, posizionare i topi nella camera di isoflurano collegata a un vaporizzatore per anestesia impostato su isoflurano al 5% e 1 L/min di ossigeno.
   NOTA: Le sperimentatrici devono essere caute durante l'uso dell'isoflurano, poiché l'esposizione potrebbe causare seri rischi per la salute e le donne incinte devono evitarlo in qualsiasi forma.
2. Assicurati che i topi siano immobili e respirino costantemente. Usa un unguento oculare per prevenire la secchezza.
3. Accendere il rasoio (dimensioni lama LxPxA: 204 x 50 x 41 mm) e tenerlo parallelo alla pelle del mouse. Muovere delicatamente la macchina del rasoio nella macchina del rasoio nella direzione in avanti. Non spingere la macchina nella pelle del mouse; Un paio di cicli di rasatura dovrebbero radere sufficientemente i topi dal lato dorsale. Radere i topi dorsalmente in modo che il 50%-60% della regione dorsale sia rasato (Figura 1) prima dell'inizio dell'esposizione alle radiazioni. Radere nuovamente i topi ogni volta che ci sono chiazze di ricrescita del pelo, che in genere è di circa 0,5 cm.
   NOTA: Utilizzare con attenzione il rasoio per non ferire o strappare la pelle degli animali; Lo sperimentatore deve mantenere il rasoio il più parallelo possibile alla pelle. La frequenza della rasatura dei peli dipende dalla tensione e dal tipo di trattamento sperimentale somministrato ai topi.
4. Anestetizzare i topi da una gabbia alla volta e poi raderli. Dopo la rasatura, applicare la crema depilatoria (quanto basta a coprire l'applicatore del batuffolo di cotone) sulla zona rasata utilizzando dischetti di cotone. Fare attenzione a non esporre la crema depilatoria più vicino agli occhi degli animali. In caso contrario, possono verificarsi gravi complicazioni e prurito.
5. Dopo 1-2 minuti, lavare delicatamente l'area con fazzoletti imbevuti di soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) per rimuovere le tracce della crema depilatoria dal corpo del topo per rimuovere le tracce dei peli bloccati.
   NOTA: Prolungare il tempo (> 5 minuti) con la crema depilatoria potrebbe danneggiare la pelle dei topi e dovrebbe essere evitato. Assicurarsi che la temperatura del PBS sia a temperatura ambiente e non troppo fredda.
6. Asciugare l'area rasata con i tessuti molli, quindi posizionare i topi nella gabbia di recupero pulita e asciutta con lettiera della gabbia. Osserva attentamente i topi finché non riprendono conoscenza.
   NOTA: La lampada a luce infrarossa può garantire che la temperatura corporea dei topi non scenda drasticamente dopo le fasi di lavaggio.
7. Lascia riposare i topi nella loro gabbia domestica con cibo ab libitum e acqua e riprenditi dalla procedura di rasatura per almeno 10 giorni prima della prima esposizione ai raggi UVB.
   NOTA: Se i topi sono esposti ai raggi UVB prima di 10 giorni dopo la rasatura, potrebbe portare a eritema cutaneo.

4. Impostazione dell'esposizione ai raggi UVB

1. Indossa una maglietta a maniche lunghe, pantaloni, un camice da laboratorio, scarpe chiuse, doppi guanti e una visiera. Eseguire l'irradiazione all'interno di una cappa biologica con la copertura in plexiglass da 10 mm rivolta verso il basso per prevenire l'esposizione ai raggi UVB dello sperimentatore.
2. Posizionare l'UVB lamp sulla camera in plexiglass trasparente senza accenderla, come mostrato nella Figura 2.
3. Accendere la lampada UVB e lasciarla funzionare fino a quando l'intensità non è costante. Posizionare il radiometro UVX accendendolo come monitorato utilizzando un radiometro UVX dotato di una testa di misurazione UVB. Assicurarsi di accendere il radiometro UVX a 20 mW/cm² e leggere le impostazioni sul radiometro. Lasciare che la lampada UVB si riscaldi e si stabilizzi per almeno 2 minuti. Quando la lampada è pronta per l'uso, estrarre il radiometro UVX.
4. Utilizzare una gabbia pulita diversa da quella domestica per l'irradiazione e posizionarla nella cappa biologica sotto la lampada UV. Trasferire i topi nella gabbia di irradiazione prima del trattamento con la lampada UV accesa o spenta per le rispettive esposizioni UV o simulate. Tratta solo 2 topi alla volta per fornire spazio sufficiente.
   NOTA: La camera aveva una superficie di 500 cm2 e un'altezza interna di 14 cm per consentire ai topi di muoversi liberamente senza arrampicarsi l'uno sull'altro durante l'irradiazione. Il motivo per l'utilizzo della camera di esposizione è evitare che i topi si sovrappongano l'uno all'altro durante l'esposizione e per garantire che tutti i topi ricevano la stessa quantità di esposizione ai raggi UVB. L'introduzione di più di due topi nella camera porterà a uno scenario in cui i topi si arrampicano l'uno sull'altro, il che creerà incoerenza nella dose di UVB somministrata a ciascun topo.
5. Calcola la quantità di tempo necessaria per esporre i topi all'intensità UVB desiderata utilizzando la calcolatrice. Ad esempio, se il radiometro UVX mostra 2 mW/cm² sullo schermo e l'esposizione desiderata è 50 mJ/cm² da dare ai topi, esporre i topi per 25 s nella camera di irradiazione UV mentre la lampada UV è accesa.
   NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di indossare l'equipaggiamento protettivo appropriato come indicato al punto 4.1. La durata dell'esposizione durante il trattamento variava tra 20 e 120 secondi. Tuttavia, la durata potrebbe variare in base all'intensità della radiazione della lampada UVB e quindi dovrebbe essere calcolata per ogni trattamento. Non ci si aspetta che i topi vengano rimossi dallo studio poiché con questo protocollo non si osservano normalmente segni di perdita di peso, segnali di dolore, tra cui gravi ustioni cutanee, sanguinamento, eritema, apatia o difficoltà respiratorie.
6. Esporre i topi maschi e femmine separatamente e pulire la camera con disinfettante tra ciascun sesso per evitare la contaminazione incrociata degli odori per gli studi comportamentali. In caso di esposizione di diversi gruppi di topi che sono stati trattati con un trattamento aggiuntivo o animali geneticamente transgenici o di controllo, pulire la camera tra l'esposizione di ciascun gruppo per evitare la contaminazione incrociata di fattori sconosciuti che sono diversi tra i due gruppi.

5. Esposizione ai raggi UVB

1. Accendi la lampada UVB e configurala dal passaggio 4.1. a 4.5.
2. Trasferisci i mouse dalla gabbia di casa alla camera di esposizione per il tempo desiderato. Esporre i topi ai raggi UVB una volta al giorno per i giorni sperimentali desiderati (qui, abbiamo fatto 5 giorni a settimana) per 8 settimane con un supporto XX-15 dotato di lampadine UVB da 15 W, 302 nm.
   NOTA: La durata dell'esposizione è soggettiva e dipende dalla questione scientifica. Gli animali non dovrebbero sviluppare eritema cutaneo. In caso di eritema, interrompere immediatamente l'esposizione e riferire al veterinario. Abbiamo utilizzato 5 giorni a settimana di esposizione, esclusi i fine settimana. La frequenza della dose di UVB può essere ridotta in condizioni simili a questo protocollo, ma un'esposizione aggiuntiva richiederà una calibrazione da parte dello sperimentatore.
3. Esporre i topi a una dose di UVB di 50 mJ/cm², una dose sub-eritematica nel ceppo di topo C57BL/6J.
   NOTA: Una dose UVB di 50 mJ/cm² è una dose sub-eritematica e abbiamo utilizzato questa dose per 8 settimane nei topi sperimentali. In altri esperimenti, abbiamo utilizzato una singola esposizione UVB di 200 mJ/cm² per studiare il danno al DNA⁴.
4. Posizionare i topi rasati fintamente irradiati (non esposti ai raggi UVB) nella camera di radiazione per un periodo di tempo uguale senza accendere la lampada UVB e usarli come controllo per l'esposizione ai raggi UVB.
   NOTA: Poiché i topi sono neofobici, gli esperimenti che coinvolgono i topi dovrebbero sempre avere il gruppo di controllo, che subisce lo stesso pseudo-trattamento di quello sperimentale.

6. Analisi dell'esposizione ai raggi UVB

NOTA: I topi sono stati soppressi utilizzando l'asfissia da CO₂ secondo le linee guida AVMA.

1. Per convalidare l'efficienza delle radiazioni, misurare la pigmentazione dell'orecchio e della coda (Figura 2) utilizzando uno spettrofotometro dermico o uno strumento simile o mediante biopsie cutanee immunocoloranti seguite da colorazione di Fontana Masson, come descritto in precedenza⁴.
2. Convalida mediante spettrofotometro dermico: calibrare lo spettrofotometro dermico per impostare la linea di base utilizzando carta bianca semplice e pulita. Una volta terminata la calibrazione, posizionare il sensore di misurazione sull'orecchio o sulla coda del mouse e annotare le letture dell'intensità della melanina. I livelli di melanina sui topi finti irradiati con UVB e irradiati con UVB sono mostrati nella Figura 3.
3. Validazione attraverso l'immunofluorescenza: Fissare biopsie cutanee di topo (2 cm x 2 cm) in paraformaldeide al 4% e incorporarle in blocchi di paraffina. Colorare fette di tessuto di 10 μm di spessore con anticorpo anti-CPD (utilizzato a una concentrazione di 1:100)²⁴ per una notte a 4 °C, seguiti da anticorpi secondari marcati con fluorescenza (anticorpo secondario coniugato Alexa-594 di capra anti-coniglio a una concentrazione di 1:1000)²⁴ per 1 ora a temperatura ambiente. Controcolorare i tessuti con DAPI e ottenere immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza.
4. Validazione attraverso la colorazione Fontana Masson: Fissare le biopsie cutanee di topo in paraformaldeide al 4% e incorporarle in blocchi di paraffina. Colorare fette di tessuto da 10 μm per la melanina utilizzando il protocollo di colorazione Fontana Masson⁴ con nitrato d'argento e soluzione di cloruro d'oro. Controcolorare le biopsie tissutali con la soluzione nucleare Fast Red e montarle utilizzando un supporto tissutale, seguito dall'acquisizione di immagini in campo chiaro al microscopio.

7. Cura degli animali

1. Eseguire esperimenti sugli animali in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.
2. Pesare i topi settimanalmente per valutare il loro stato di salute di base. Rimuovere gli animali con > diminuzione del peso del 15% tra le misurazioni dell'esperimento. Rimuovere gli animali che mostrano segnali di dolore, tra cui gravi ustioni cutanee, sanguinamento, eritema, apatia o difficoltà respiratorie a causa dell'esposizione ai raggi UVB, e sacrificare secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

Questo documento di metodo menziona la procedura dettagliata passo dopo passo per generare il modello murino di esposizione ai raggi UVB. La Figura 1 mostra chiaramente l'area rasata del topo rappresentativo C57BL/6J sul lato dorsale prima dell'esposizione ai raggi UVB, dimostrando che il 50%-60% dell'area dorsale era rasata. Il protocollo di rasatura non mostra alcun segno di eritema cutaneo, che è della massima importanza per gli studi dermatologici. La Figura 2 mostra la configurazione dell'esposizione UVB per i topi utilizzando le lampade UVB nella camera di esposizione UVB separata posta nella camera di plexiglass. Questa configurazione è qualcosa che abbiamo sviluppato internamente, che è economica, efficiente, facile da sperimentare e richiede poca manutenzione. La Figura 3 mostra i risultati rappresentativi dell'efficacia dell'esposizione ai raggi UVB attraverso un aumento graduale della pigmentazione cutanea dopo l'esposizione ai raggi UVB nel corso di 4 settimane. La pigmentazione cutanea nei topi è stata misurata utilizzando lo spettrofotometro dermico. Questi risultati rappresentativi sono proof-of-concept e sono in linea con precedenti studi sull'esposizione ai raggi UVB 4,25 che confermano l'efficacia del protocollo di esposizione ai raggi UVB attraverso l'immunofluorescenza e la colorazione di Fontana Masson.

Figura 1: Topo rasato dorsalmente prima dell'esposizione ai raggi UV a basse dosi. (A) Fotografia di un topo rappresentativo che dimostra che i peli sono stati rimossi dal 50%-60% della regione dorsale seguendo il protocollo di rasatura prima dell'esposizione ai raggi UVB. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Impostazione dell'esposizione ai raggi UVB per i topi. (A) Topi finti irradiati con UVB o (B) topi irradiati con UVB sono stati collocati nelle camere di esposizione separate alloggiate nella camera in plexiglass con una lampada UVB sulla parte superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Convalida dell'esposizione ai raggi UVB sui topi misurando i livelli di melanina nell'orecchio. Fotografie rappresentative delle orecchie di (A) maschi o (B) femmine di topi irradiati con raggi UVB (pannello superiore) o UVB (pannello inferiore) collocate nelle camere di esposizione separate alloggiate nella camera in plexiglass con lampada UVB sulla parte superiore. Intensità media della melanina sulle orecchie di (C) maschi e (D) femmine di topi irradiati da Mock-UVB (grigio) o irradiati da UVB (blu; n = 7 topi per gruppo. Questa cifra è stata modificata da4. Tutti i dati sono presentati come media ± SEM; Per le analisi statistiche sono stati eseguiti valori p del test t non accoppiato a due code. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse.