Articolo metodologico

Un modello murino di trasformazione emorragica indotta da iperglicemia acuta combinata con ischemia focale transitoria

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DOI:

10.3791/67371

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15 novembre 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

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Sommario

Questo studio presenta un protocollo per stabilire un modello animale altamente riproducibile di trasformazione emorragica (HT) utilizzando l'occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) in topi C57BL/6 con iperglicemia acuta.

Abstract

La trasformazione emorragica (HT) è una grave complicanza che può verificarsi a seguito della terapia trombolitica a seguito di ictus ischemico (IS) e pone limitazioni significative all'applicazione clinica dell'attivatore del plasminogeno tissutale ricombinante (rt-PA). Purtroppo, attualmente non sono disponibili interventi efficaci per la HT nella pratica clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di modelli animali sperimentali stabili e affidabili per chiarire la patogenesi dell'HT e sviluppare strategie di intervento efficaci. Questo studio ha presentato un protocollo per stabilire un modello murino di HT indotta da iperglicemia acuta combinata con ischemia focale transitoria (tMCAO). Ai topi maschi C57BL/6J è stato iniettato il 30% di glucosio per indurre iperglicemia e poi sottoposti a 60 minuti di tMCAO con riperfusione. Il volume dell'infarto, l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) e il grado di emorragia intracranica sono stati valutati a 24 ore dopo MCAO. I risultati hanno mostrato che l'iniezione di glucosio ha portato a iperglicemia transitoria (14,3-20,3 mmol/L), che ha aumentato significativamente sia il volume dell'infarto che l'incidenza di HT. La colorazione con ematossilina-eosina (H&E) ha indicato lesioni emorragiche significative all'interno della zona di infarto nei topi iperglicemici. Inoltre, i topi iperglicemici hanno mostrato un'alterazione aggravata della BBB, come dimostrato da una perdita più grave di blu di Evans (EB) e FITC-destrano. In conclusione, l'iperglicemia acuta ha provocato in modo affidabile e costante HT macroscopico in un modello murino di tMCAO. Questo modello riproducibile offre uno strumento prezioso per studiare i meccanismi patologici della HT e sviluppare i corrispondenti interventi terapeutici.

Introduzione

L'infarto cerebrale è la principale causa di disabilità e la seconda causa di morte negli adulti in tutto il mondo1. La fase acuta svolge un ruolo cruciale nella progressione dell'infarto cerebrale, fungendo da punto cruciale per il trattamento della malattia. Il ripristino precoce e tempestivo del flusso sanguigno nell'area della penombra è essenziale per prevenire un'ulteriore morte delle cellule cerebrali, con la trombolisi e la terapia interventistica che rappresentano i pilastri per il trattamento dell'infarto cerebrale acuto (ACI). Tuttavia, la trasformazione emorragica (HT) rappresenta una complicanza significativa dopo la trombolisi e la terapia interventistica, che si verifica nel 15%-30% dei pazienti con ictus ischemico, limitandone così l'applicazione in una certa misura 2,3. L'insorgenza di HT aumenta significativamente il rischio di mortalità e disabilità, influenzando la prognosi dell'ACI. Pertanto, è di grande importanza clinica indagare i meccanismi patologici della HT e identificare bersagli terapeutici efficaci.

Attualmente, l'occlusione dell'arteria cerebrale media indotta da embolia filiforme (MCAO) è frequentemente utilizzata come modello di HT nei roditori4. L'ostruzione prolungata può provocare un massiccio infarto cerebrale che coinvolge la corteccia e lo striato, portando potenzialmente a HT secondaria. Thread MCAO non richiede craniotomia, è altamente riproducibile e produce un danno cerebrale focale e HT simile a un ictus umano. Tuttavia, questo modello meccanico presenta alcuni svantaggi distinti, tra cui alti tassi di mortalità precoce e bassi tassi di sopravvivenza a lungo termine5. Un altro modello di HT frequentemente utilizzato è il modello di trombolisi, in cui la formazione di coaguli di sangue viene indotta prima nel vaso bersaglio, seguita dall'uso di farmaci trombolitici (ad es. rt-PA, warfarin) per sciogliere il coagulo, imitando il processo clinico di HT nell'ictus ischemico 6,7. Nonostante replichino in larga misura il processo patologico della terapia trombolitica clinica, i modelli animali di HT indotti da rt-PA o warfarin sono complessi da implementare e associati a un'elevata mortalità animale, nonché a un'incidenza e una localizzazione variabili del sanguinamento. Al fine di far progredire la ricerca traslazionale di base e clinica sulla HT dopo infarto cerebrale, è essenziale stabilire un modello animale riproducibile di HT che sia facile da utilizzare e offra un'elevata stabilità.

L'iperglicemia è un fattore significativo per la HT in seguito a ischemia/riperfusione cerebrale (I/R)8. Diversi studi retrospettivi hanno analizzato i dati clinici dei pazienti sottoposti a trombectomia meccanica, rivelando che livelli elevati di glucosio nel sangue al momento del ricovero sono legati a una maggiore incidenza di HT3 spontanea. Nei pazienti con ictus diabetico, l'iperglicemia aumenta significativamente il rischio di HT e porta a deficit neurologici più gravi 9,10. I ricercatori hanno sviluppato modelli HT inducendo I/R cerebrale in modelli animali diabetici attraverso MCAO. Tuttavia, il modello diabete-MCAO ha una lunga durata sperimentale, una procedura complessa e costi elevati 11,12. Un modello affidabile di HT può essere stabilito inducendo iperglicemia acuta attraverso l'iniezione intraperitoneale di glucosio e integrandolo con un modello I/R cerebrale generato dalla tecnica di sutura. Questo metodo è facilmente eseguibile con una posizione di sanguinamento costante e imita efficacemente le caratteristiche cliniche dell'iperglicemia post-ictus. Tuttavia, ci sono differenze significative in condizioni cruciali come il tempo ischemico e la concentrazione di glucosio; inoltre, la stabilità del modello e l'incidenza di HT sono incoerenti in diverse letterature.

Il nostro gruppo di ricerca ha ampiamente utilizzato il metodo dell'iperglicemia acuta-MCAO per stabilire un modello HT. Inoltre, abbiamo condotto una serie completa di esperimenti per esplorare la relazione tra tempo ischemico, concentrazione di glucosio nel sangue, tasso di incidenza di HT e mortalità animale. Questi esperimenti hanno infine portato all'identificazione delle condizioni ottimali per la creazione di un modello HT post-infarto cerebrale. Questo studio presenta un protocollo dettagliato per stabilire un modello HT indotto da iperglicemia acuta utilizzando l'iniezione intraperitoneale di glucosio al 30% combinata con MCAO embolico.

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Jianghan (JHDXLL2024-080) e condotto in conformità con le Linee Guida Etiche per gli Animali Sperimentali emesse dal Centro per il Controllo delle Malattie della Cina. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J del peso di 21-26 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raggruppamento animale e iperglicemia acuta

  1. Ospita i topi nel centro per animali da laboratorio dell'Università di Jianghan in un ambiente controllato con ciclo luce/buio di 12 ore (20-22 °C, 50%-55% di umidità) con cibo e acqua ad libitum.
  2. Dividi casualmente i topi in quattro gruppi: Sham + soluzione salina (n = 12), Sham + glucosio (n = 12), MCAO + soluzione salina (n = 12) e MCAO + glucosio (n = 20).

2. Preparazione preoperatoria

NOTA: Tutti i topi sperimentali hanno digiunato per 12 ore prima dell'intervento chirurgico.

  1. Somministrare analgesia sistemica (meloxicam, 5 mg/kg per via sottocutanea) e anestesia locale al sito di incisione (bupivacaina, 2 mg/kg per via sottocutanea) durante l'intervento perioperatorio.
  2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, i cotton fioc e le suture chirurgiche in autoclave a condizioni di 121 °C e 15 psi per 30 minuti.
  3. Pulire la piattaforma chirurgica e l'area di lavoro circostante con etanolo al 75% e accendere l'interruttore del riscaldamento con la temperatura impostata a 37 °C.
  4. Anestetizzare il topo con una miscela di ossigeno gassoso al 3% di isoflurano e 20% nella camera di induzione dell'anestesia. Quindi, valuta il riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi per testare la profondità dell'anestesia.
  5. Spostare il mouse sulla piattaforma chirurgica in posizione prona e inserire rapidamente il naso del mouse nel cono. Aprire il flusso di gas al cono del naso, chiudendo il flusso alla camera di induzione dell'anestesia. Regolare la proporzione di isoflurano al 2% e impostare il flusso della miscela di gas a 0,4 ml/min per il mantenimento dell'anestesia.
  6. Applicare il gel per gli occhi sugli occhi del topo per mantenere l'umidità durante l'intervento chirurgico.
  7. Radere i peli della regione del collo usando il tagliacapelli. Pulire e disinfettare la pelle alternando l'applicazione con iodio ed etanolo al 70% utilizzando un bastoncino di cotone disinfettante.
  8. Coprire una garza sterile sul collo e tagliare un'apertura per esporre la regione operativa.

3. Misurazione del flusso sanguigno cerebrale di base

  1. Radere i peli della regione del cuoio capelluto usando il tagliacapelli. Pulire e disinfettare il cuoio capelluto alternando l'applicazione con iodio ed etanolo al 70% utilizzando un bastoncino di cotone disinfettante.
  2. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 1,0 cm nella pelle sopra la regione frontale per esporre la fontanella cranica. Mantieni il cranio umido con soluzione fisiologica.
  3. Preparare lo strumento di flussimetria laser Doppler (LDF) e tenere la punta della sonda LDF perpendicolare alla superficie del cranio parietale sinistro (1 mm posteriormente e 5 mm lateralmente alla bregma); una volta che il FLUX è stabile e registrare il valore di base.
    NOTA: L'unità di misura per FLUX è l'unità di perfusione (PU), con un intervallo di misurazione compreso tra 0 e 1000 PU. I CBF di base ideali su una flussimetria laser Doppler sono >600 PU. Un periodo continuo di 5 secondi con un intervallo di fluttuazione inferiore al 10% è considerato una lettura FLUX valida.
  4. Sutura il muscolo e la pelle separatamente utilizzando la sutura assorbibile 5.0 PGA. Applicare il gel di diclofenac sodico e l'unguento alla mupirocina sulla ferita.

4. Procedura chirurgica MCAO

NOTA: La MCAO viene eseguita utilizzando un metodo di occlusione del filo modificato, come precedentemente descritto da Chiang et al.13.

  1. Girare delicatamente il mouse in posizione supina e somministrare per via intraperitoneale il 30% di glucosio (7,2 ml/kg) o soluzione fisiologica ai topi 15 minuti prima della procedura chirurgica.
    NOTA: I topi dei gruppi Sham + glucosio e MCAO + glucosio hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di glucosio. I topi dei gruppi Sham + soluzione salina e MCAO + soluzione salina hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di soluzione fisiologica normale.
  2. Radere i peli della regione del collo usando il tagliacapelli. Pulire e disinfettare la pelle alternando l'applicazione con iodio ed etanolo al 70% utilizzando un bastoncino di cotone disinfettante. Coprire una garza sterile sul collo e tagliare un'apertura per esporre la regione operativa.
    NOTA: Assicurarsi che l'incisione sia mantenuta diritta per ottenere una visualizzazione ottimale dell'arteria carotide.
  3. Praticare un'incisione della linea mediana di 1,5 cm sulla faccia ventrale del collo utilizzando un bisturi. Separare il tessuto sottocutaneo e la fascia superficiale utilizzando una pinzetta chirurgica.
    NOTA: Assicurarsi che l'incisione sia mantenuta diritta per ottenere una visualizzazione ottimale dell'arteria carotide.
  4. Al di sotto della fascia superficiale, si individuano la ghiandola sottomandibolare e un triangolo rovesciato formato da tre muscoli: lo sternoioide, posizionato sulla linea mediana sopra la trachea; il ventre posteriore del muscolo digastrico, riconoscibile per la sua parte tendinea bianca lucida; e infine, il muscolo sternomastoideo.
  5. Eseguire la dissezione smussata all'interno del triangolo invertito per identificare e separare l'arteria carotide comune sinistra (CCA).
  6. Sezionare il nervo vago adiacente al CCA e il tessuto mucoso che circonda i vasi sanguigni utilizzando una pinza oftalmica. Crea una suoneria su CCA usando una sutura assorbibile all'acido poliglicolico (PGA) 5.0, ma mantieni la sutura non tesa.
  7. Separandosi verso l'alto lungo il CCA, si può osservare una biforcazione a "Y" per dividere il CCA nell'arteria carotide esterna (ECA) e nell'arteria carotide interna (ICA).
  8. Separare la biforcazione per esporre completamente l'ECA e l'ICA. Avvolgere e legare saldamente una sutura assorbibile 5.0 PGA attorno all'ECA distalmente dalla biforcazione.
    NOTA: Garantire una distanza sufficiente tra il sito di legatura permanente e la biforcazione vascolare per evitare che il filo si stacchi durante la rotazione dell'ECA.
  9. Bloccare temporaneamente sia il CCA che l'ICA utilizzando due morsetti per arteria arteriosa micro serrafine leggera da 8 mm x 2 mm per bloccare il flusso sanguigno dal CCA all'ICA.
  10. Allungare la fascetta di sutura sull'ECA distale e sul CCA per raddrizzare il segmento ECA.
  11. Usa le microforbici per praticare una piccola incisione tra i due lacci di sutura sull'ECA.
  12. Inserire una sutura monofilamento rivestita di silicone (lunga 30 mm, silicio rivestito di 3-4 mm) nell'ECA. Avvolgere e legare leggermente una seconda sutura assorbibile 5.0 PGA sull'ECA vicino alla biforcazione per evitare che la sutura monofilamento si allontani.
  13. Tagliare completamente l'ECA distale alla legatura permanente e rimuovere il morsetto della pinza arteriosa dall'ICA.
  14. Estrarre la sutura fino alla biforcazione del CCA, quindi ritrarre con cautela e ruotare il moncone ECA. Regolare la direzione di inserimento della sutura e inserirla lentamente, a circa 9,0-10,0 mm dalla biforcazione CCA nell'ICA, per occludere l'MCA.
  15. Stringere la seconda sutura assorbibile PGA attorno all'ECA e rimuovere il morsetto arterioso dal CCA.
  16. Sutura il muscolo e la pelle separatamente utilizzando la sutura assorbibile 5.0 PGA. Applicare il gel di diclofenac sodico e l'unguento alla mupirocina sulla ferita.
  17. Ruotare delicatamente il mouse in posizione prona e ripetere il passaggio 3.4. per registrare il flusso sanguigno dopo l'occlusione MCA.
    NOTA: I topi che presentavano una riduzione del flusso sanguigno inferiore al 40% del valore basale dopo MCAO sono stati esclusi dallo studio14.
  18. Accendere l'interruttore di riscaldamento della gabbia di recupero con la temperatura impostata a 37°C. Posizionare il topo nella gabbia di recupero durante il periodo post-occlusione (60 min).

5. Rimozione e riperfusione del monofilamento

  1. Anestetizzare nuovamente il topo come descritto in precedenza poco prima della fine del periodo di occlusione.
  2. Clamp il CCA utilizzando un morsetto per arteria microclip.
  3. Ritrarre parzialmente il monofilamento dall'ICA fino a quando la punta rivestita di silicone diventa visibile attraverso l'ICA.
  4. Posizionare un altro morsetto per arteria microclip sull'ICA sopra la punta rivestita in silicone.
  5. Estrarre completamente il monofilamento e legare saldamente il moncone ECA.
  6. Rimuovere il morsetto dell'arteria microclip rispettivamente da ICA e CCA.
  7. Sutura il muscolo e la pelle strato per strato utilizzando la sutura assorbibile 5.0 PGA.
  8. Posiziona il mouse nella camera di recupero e monitora tutti i topi fino a quando non sono completamente svegli. Somministrare meloxicam (5 mg/kg, per via sottocutanea) per alleviare il dolore ogni 12 ore per un massimo di 24 ore.

6. Misurazione della glicemia

NOTA: I livelli di glucosio nel sangue sono stati misurati nei seguenti punti temporali: (1) appena prima dell'intervento chirurgico MCAO (basale), (2) immediatamente dopo l'inserimento del monofilamento (15 minuti dopo l'iniezione di glucosio), (3) immediatamente dopo il ritiro del monofilamento immediatamente dopo l'inserimento del monofilamento (75 minuti dopo l'iniezione di glucosio).

  1. Pulisci la coda del topo con un batuffolo di cotone alcolico per rendere la vena della coda completamente iperemica.
  2. Tagliare la punta della coda di 1-2 mm con le forbici chirurgiche.
  3. Stringere delicatamente lungo la radice della coda fino alla punta della coda, facilitando il flusso del sangue fuori dall'incisione.
  4. Posizionare il serbatoio di assorbimento del campione della carta di prova sul bordo della gocciolina di sangue.
    NOTA: Il sangue verrà aspirato nella carta di prova a causa dell'effetto di sifonamento.
  5. Leggi la lettura del glucometro e registra il risultato.
    NOTA: Escludere i topi i cui livelli di glucosio nel sangue non sono saliti oltre i 10 mmol/L dopo 15 minuti di iniezione di glucosio.
  6. Rimuovere il sangue in eccesso usando un batuffolo di cotone e applicare pressione per fermare l'emorragia.

7. Colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)

  1. Sopprimere il topo mediante iniezione intraperitoneale di un sovradosaggio di pentobarbital (300 mg/kg).
  2. Una volta che il topo smette di respirare, immobilizzarlo prontamente in posizione supina.
  3. Apri il torace usando le forbici e taglia il diaframma per esporre il cuore.
  4. Inserire un ago per iniezione da 23 G nel ventricolo sinistro del topo e incidere l'appendice auricolare con le forbici.
  5. Perfondere 15 mL di soluzione fisiologica normale fino a quando il liquido che fuoriesce dall'appendice auricolare appare limpido e trasparente.
  6. Decapita il topo e apri il cuoio capelluto per esporre completamente il teschio usando le forbici. Inserire la punta delle forbici 2 mm leggermente davanti alla sutura coronale del cranio per aprirla.
  7. Usa una pinzetta per rimuovere intatto il tessuto cerebrale del topo.
  8. Posizionare il tessuto cerebrale in una matrice cerebrale di roditore e tagliarlo a fette coronali di 2 mm.
  9. Trasferire le fette in una piastra a 24 pozzetti e incubarle con una soluzione TTC al 2% a 37 °C per 15 minuti.
  10. Avviare il software di scansione e impostare le impostazioni dei parametri su una risoluzione di 1200 dpi e un formato JPG per l'analisi delle immagini.
  11. Estrarre le sezioni di tessuto dalla piastra a 24 pozzetti con una pinza curva e disporre le sezioni sulla piastra di scansione in vetro.
  12. Scansiona le sezioni di tessuto e quindi esporta le immagini per l'analisi delle misurazioni.
  13. Misurare l'area dell'infarto correggendo il gonfiore dei tessuti. Sottrarre l'area non infartuale del lato omolaterale dall'area del lato controlaterale utilizzando il software ImageJ15. Valutare la dimensione dell'infarto come percentuale dell'emisfero controlaterale. Per ulteriori dettagli sull'analisi dell'area dell'infarto, fare riferimento a Friedländer et al.16.

8. Osservazione di Gross

  1. Ripetere i passaggi da 7.1 a 7.8.
  2. Estrarre le sezioni di tessuto dalla matrice cerebrale con una pinza curva e disporre le sezioni sulla piastra di scansione in vetro.
  3. Eseguire la scansione delle sezioni coronali cerebrali come descritto nei passaggi 7.10 e 7.12.

9. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

  1. Ripetere i passaggi da 7.1 a 7.4. Perfondere lentamente 15 mL di soluzione fisiologica normale, seguiti da perfusione di circa 15 mL di paraformaldeide (PFA).
  2. Ripetere i passaggi 7.6–7.7. Fissare il tessuto cerebrale con PFA al 4% per 24 ore a temperatura ambiente.
  3. Posizionare il tessuto cerebrale fissato nell'essiccatore automatico per tessuti per la disidratazione, la vetrificazione e l'immersione in cera.
  4. Incorporare il tessuto nella cera di paraffina e tagliare il tessuto cerebrale in fette coronali spesse 5 μm mediante microtomo.
  5. Decerare la fetta immergendola in xilene tre volte, con ogni immersione della durata di 8 min. Quindi, immergere gradualmente la fetta in soluzioni di etanolo a concentrazioni decrescenti (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), seguite da acqua distillata, con ogni passaggio della durata di 5 minuti.
  6. Colorare la fetta con la soluzione di ematossilina per 3 minuti. Quindi, differenziarlo immergendolo in alcol di acido cloridrico al 5% per 5 s.
  7. Incubare la fetta con una soluzione di eosina per 1 minuto, quindi disidratarla e ialineizzarla con una soluzione di etanolo a gradiente (90%, 95%, 100%) e xilene.
  8. Montare la sezione con resine neutre.
  9. Cattura le immagini di fette di cervello colorate con H&E sotto un campo luminoso utilizzando la microscopia a fluorescenza.

10. Determinazione del lekage Evans Blue (EB)

NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a Wang et al.17.

  1. Iniettare la soluzione di Evans Blue (EB) al 2% (p/v) (2 mL/kg) attraverso la vena caudale 23 ore dopo l'MCAO.
  2. Ripetere i passaggi 7.1-7.7 un'ora dopo l'iniezione di EB e scattare una foto dell'intero cervello.
  3. Metti il cervello in una matrice di cervello di roditore e taglialo coronalmente a fette di 2 mm. Scansiona le sezioni coronali cerebrali come descritto nei passaggi 7.10-7.12 per osservare la perdita di EB.
  4. Dividere le fette in porzioni destra e sinistra e mettere ciascuna in una provetta da centrifuga.
  5. Omogeneizzare ogni fetta di tessuto cerebrale in acido tricloroacetico al 50%, con un rapporto di 100 mg di tessuto cerebrale per 0,4 ml di acido tricloroacetico.
  6. Dopo essere stato incubato a 4 °C per una notte, centrifugare l'omogenato per 30 minuti a 10.000 x g (a 4 °C).
  7. Trasferire il liquido surnatante in un'altra provetta da centrifuga e diluirlo quattro volte con etanolo.
  8. Misurare l'assorbanza del liquido surnatante a 620 nm utilizzando uno spettrofotometro.
  9. Convertire i valori di assorbanza nella concentrazione di EB utilizzando una curva standard di EB nell'etanolo (ad esempio, a 31,25, 62,5, 125 e 250 ug/mL).
    NOTA: Il risultato si presenta come un microgrammo di EB per grammo di tessuto cerebrale.

11. Determinazione della perdita di FITC-destrano

  1. Iniettare FITC-destrano (10 KDa, 6 mg/mL, diluito in 0,01 M di PBS; 4 mL/kg) nella vena caudale 24 ore dopo la MCAO, lasciandolo circolare nel sangue per 10 minuti.
  2. Ripetere i passaggi 7.1-7.7 per eseguire la perfusione e rimuovere il tessuto cerebrale intatto.
  3. Fissare il tessuto cerebrale in PFA al 4% per 24 ore a temperatura ambiente al buio.
  4. Trasferire il tessuto cerebrale fissato nella soluzione di saccarosio con concentrazioni di gradiente del 10%, 20% e 30% (diluito in 0,01 M PBS) per la disidratazione.
  5. Incorporare il tessuto cerebrale utilizzando un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e tagliarlo in sezioni di tessuto cerebrale spesse 30 μm. Trasferire le sezioni su un vetrino da microscopio utilizzando un anello di inoculazione e assicurarsi che aderiscano alla superficie del vetrino.
  6. Montare le sezioni di tessuto cerebrale utilizzando un mezzo di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
  7. Avviare la microscopia confocale laser e il relativo software di controllo.
  8. Fissare il vetrino del microscopio sul tavolino dell'oggetto e individuare l'area dell'infarto sotto l'oculare 200x.
  9. Imposta la risoluzione su 1024 x 1024 e regola il valore di guadagno e il tempo di esposizione per ottenere l'immagine più nitida possibile.
  10. Acquisire le immagini della regione colorata con FITC-destrano dell'infarto cerebrale con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.

Risultati

La procedura sperimentale di questo studio è illustrata nella Figura 1. In breve, i topi sono stati sottoposti a MCAO indotta dall'occlusione del filo per 60 minuti, seguita da riperfusione. Il glucosio (30% in soluzione fisiologica normale, 7,2 ml/kg di peso corporeo) è stato somministrato per via intraperitoneale 15 minuti prima dell'MCAO. I livelli di glucosio nel sangue sono stati misurati al basale (prima dell'iniezione di glucosio), immediatamente dopo l'MCAO e al momento della riperfusione. Dopo 24 ore di riperfusione, i topi sono stati soppressi e i tessuti cerebrali sono stati raccolti per l'analisi del volume dell'infarto, della perdita della barriera emato-encefalica e dell'istopatologia. Come illustrato nella Figura 2, tutti e quattro i gruppi hanno mostrato livelli di glucosio nel sangue al basale simili. Tuttavia, i topi che hanno ricevuto iniezioni di glucosio hanno mostrato livelli di glucosio nel sangue significativamente elevati rispetto a quelli dei gruppi salini.

Come illustrato nella Figura 3A, non è stato osservato alcun infarto visibile su fette di cervello nel gruppo Sham + soluzione salina o Sham + glucosio, mentre un marcato infarto cerebrale è stato chiaramente rivelato dalla colorazione TTC su fette di cervello di entrambi i gruppi MCAO. Inoltre, i topi iniettati con glucosio hanno mostrato un volume di infarto maggiore rispetto a quelli iniettati con soluzione fisiologica normale nei diversi gruppi MCAO. Secondo l'analisi statistica, il volume dell'infarto era del 20,8% ± 0,8% e del 45,1% ± 1,6% rispettivamente nel gruppo MCAO + soluzione salina e nel gruppo MCAO + glucosio (Figura 3B).

Le osservazioni macroscopiche non hanno rivelato emorragie nell'emisfero cerebrale sinistro né del gruppo MCAO + soluzione salina né del gruppo Sham + soluzione fisiologica/glucosio. Al contrario, sono state osservate emorragie multiple puntate nell'emisfero cerebrale ischemico del gruppo MCAO + glucosio (Figura 4A). Le immagini di scansione di sezioni cerebrali coronali consecutive hanno mostrato che le emorragie nel gruppo MCAO + glucosio erano distribuite all'interno delle regioni di infarto della corteccia e dello striato (Figura 4A). Inoltre, l'analisi istologica con colorazione H&E ha dimostrato una significativa infiltrazione di cellule del sangue nelle regioni dell'infarto della corteccia e dello striato nel gruppo MCAO+glucosio (Figura 4B). Al contrario, non è stata osservata alcuna infiltrazione di cellule del sangue né nel gruppo MCAO+soluzione salina né nel gruppo Sham + soluzione fisiologica/glucosio.

Come illustrato nella Figura 5A, non è stata osservata alcuna perdita di EB nelle fette cerebrali del gruppo Sham + glucosio. Tuttavia, entrambi i gruppi MCAO hanno mostrato una distinta colorazione blu a causa della perdita di EB. Inoltre, rispetto ai topi iniettati con soluzione fisiologica, quelli iniettati con glucosio hanno mostrato una maggiore permeabilità all'EB a 24 ore dopo MCAO. Rispetto al gruppo Sham + soluzione fisiologica, il gruppo MCAO + soluzione salina ha dimostrato un aumento significativo del contenuto di EB (4,2 μg/g ± 1,8 μg/g rispetto a 28 μg/g ± 0,7 μg/g, p < 0,01), che è stato ulteriormente elevato nel gruppo MCAO + glucosio (28 μg/g ± 0,7 μg/g rispetto a 65,5 μg/g ± 6,0 μg/g, p < 0,01) (Figura 5B). Come illustrato nella Figura 5C, la perdita di FITC-destrano era più intensa nella corteccia cerebrale ischemica e nello striato del gruppo MCAO + glucosio rispetto al gruppo MCAO + soluzione salina.

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Figura 1: Schema della procedura sperimentale. Ai topi è stato iniettato intraperitonealmente glucosio al 30% o soluzione salina prima dell'intervento chirurgico MCAO, con monitoraggio della glicemia durante la procedura. 24 ore dopo la riperfusione, i topi sono stati soppressi per analisi patologiche e istologiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Variazioni dei livelli di glucosio nel sangue in vari momenti dopo l'iniezione di glucosio al 30%. I dati sono presentati come media ± SD. N = 10-20. p < 0,001 rispetto al gruppo Sham + soluzione salina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: L'iperglicemia ha peggiorato il danno cerebrale ischemico 24 ore dopo la riperfusione. (A) Immagini rappresentative di fette coronali colorate con TTC, con tessuto cerebrale normale che appare rosso-rosato e aree di infarto ischemico che appaiono bianco-grigiastre. Barra della scala = 5 mm. (B) Analisi statistica del volume dell'infarto. I dati sono presentati come media ± SD. N = 3. p < 0,001 rispetto al gruppo Sham + soluzione salina, ##p < 0,01 rispetto al gruppo MCAO + soluzione salina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: L'iperglicemia aumenta il rischio di HT a 24 ore dopo la riperfusione. (A) Immagini rappresentative dell'osservazione macroscopica e delle fette coronali. L'asterisco indicava i focolai emorragici visibili. Barra della scala = 5 mm. (B) Immagini rappresentative del semicervello colorato con H&E (in alto) e immagini ingrandite (in basso). Barra della scala = 200 μm per le immagini del semicervello; Barra di scala = 20 μm per immagini ingrandite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Iperglicemia aggravata dall'interruzione della BBB a 24 ore dopo la riperfusione. (A) Immagini rappresentative della perdita di blu di Evans. Barra graduata = 5 mm. (B) Analisi statistica della perdita di blu di Evans negli emisferi ischemici. I dati sono presentati come media ± SD, N = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001 rispetto al gruppo Sham + soluzione salina, ##p < 0,01 rispetto al gruppo MCAO + soluzione salina. (C) Immagini rappresentative della corteccia cerebrale ischemica e dello striato colorati con FITC-destrano. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'attuale protocollo è progettato per creare un modello animale affidabile di trasformazione emorragica a seguito di ictus ischemico, in grado di replicare gli effetti dannosi della rivascolarizzazione dei vasi in condizioni iperglicemiche. Tra i vari fattori di rischio per l'ictus ischemico, il livello di glucosio nel sangue entro 24 ore dall'insorgenza dell'ictus è correlato positivamente con l'esacerbazione del danno cerebrale e l'aumento della mortalità 3,18. Numerose indagini cliniche hanno anche dimostrato che l'iperglicemia post-ictus è uno dei fattori di rischio più critici per la HT e gli esiti neurologici peggiori19. Nel presente protocollo, 19 topi su 20 sono stati indotti con successo alla HT in iperglicemia acuta, con un conseguente rapporto di modellazione di successo di circa il 95%. Sfortunatamente, quattro topi sono morti per grave ematoma cerebrale entro 24 ore dall'intervento chirurgico MCAO e sono stati quindi esclusi da ulteriori analisi.

I modelli animali di HT indotta da iperglicemia sono stati utilizzati in recenti ricerche precliniche. Won et al. hanno dimostrato che l'iperglicemia promuoveva l'HT in un modello di ratto di trattamento dell'ictus tPA20. Tuttavia, i fattori patogenetici nel modello di HT di Won erano più complessi, poiché il tPA stesso può aumentare il rischio di HT. Al contrario, l'attuale protocollo ha utilizzato l'iperglicemia acuta combinata con MCAO e ha raggiunto un significativo tasso di successo di HT nei topi. In particolare, esiste variabilità tra i modelli di HT indotta da iperglicemia per quanto riguarda la concentrazione di glucosio, la durata dell'ischemia, l'affidabilità del modello e l'occorrenza di HT 21,22,23,24. Alcuni studi hanno utilizzato l'iniezione di glucosio al 50% per indurre livelli di glucosio nel sangue significativamente più elevati (20-28 mmol/L), superando l'intervallo tipico osservato nei pazienti con ictus. Il tasso di HT in questi esperimenti varia dal 70% al 73,3%, con un tasso di mortalità registrato al 37,5% in un modello sperimentale. Al contrario, le attuali procedure sperimentali prevedevano l'utilizzo di un'iniezione di glucosio al 30% per indurre un'iperglicemia acuta mantenuta tra 14,3 mmol/L e 20,3 mmol/L, allineandosi meglio con l'intervallo di valori di glucosio nel sangue riscontrati nei pazienti. Inoltre, queste procedure richiedevano un periodo di digiuno per i topi sperimentali prima dell'intervento chirurgico per regolare i livelli di glucosio nel sangue preoperatori al basale a circa 5 mmol/L; In caso contrario, può verificarsi un livello ematico basale elevato di circa 10 mmol/L, portando successivamente a livelli di glucosio nel sangue eccessivamente elevati e, in ultima analisi, a tassi di mortalità più elevati tra i topi.

In un recente studio, MacDougall et al. hanno scoperto che l'iperglicemia ha portato ad un aumento delle dimensioni dell'infarto, in particolare in un modello di diabete di tipo 125. I risultati attuali indicano che il gruppo a cui è stato somministrato glucosio ha mostrato una dimensione dell'infarto maggiore dopo 60 minuti di ischemia rispetto al gruppo in condizioni saline. Questo risultato è coerente con un precedente esperimento che ha dimostrato l'impatto dannoso di un alto livello di glucosio sulla progressione dell'infarto nell'area della penombra18. In questo protocollo, l'iniezione preoperatoria di glucosio al 30% ha provocato un'emorragia cerebrale puntata dopo 24 ore post-MCAO. Coerentemente con i risultati della gradazione macroscopica, l'analisi istologica utilizzando la colorazione H&E ha rivelato una significativa infiltrazione di cellule del sangue nello striato ischemico e nella corteccia nei topi con iperglicemia acuta. Naturalmente, ci sono altri metodi disponibili per valutare l'HT, come la misurazione dell'emoglobina tramite ELISA o la risonanza magnetica (MRI). Sebbene il meccanismo fisiopatologico alla base della HT rimanga sfuggente, l'interruzione della BBB è considerata la sua causa principale dopo l'ischemia cerebrale26. Pertanto, l'interruzione della BBB può riflettere indirettamente la gravità della HT. Questo protocollo utilizzava la colorazione EB per testare la permeabilità della BBB. Le fette di cervello colorate con EB dimostrano visivamente i cambiamenti nella permeabilità della BBB e consentono la misurazione quantitativa del contenuto di colorante EB che è penetrato nel tessuto cerebrale. Negli ultimi anni, altri traccianti come la fluoresceina-sodica e il FITC-destrano sono stati ampiamente utilizzati per valutare la permeabilità della BBB in modelli animali di malattie neurologiche 27,28. Quindi, abbiamo anche eseguito un esperimento di colorazione con destrano per delineare la posizione e l'entità della lesione endoteliale vascolare in modo più dettagliato osservando il grado di perdita di FITC-destrano.

Il protocollo attuale presenta diverse limitazioni che non possono essere trascurate. In primo luogo, la chirurgia MCAO richiede un alto livello di competenza da parte dell'operatore. È fondamentale garantire la consegna tempestiva del filo embolico nell'MCA e il posizionamento e la profondità accurati dell'occlusione. Soddisfare questi requisiti richiede una formazione approfondita per l'operatore dell'esperimento. In secondo luogo, a causa del potenziale peggioramento del danno cerebrale da parte dell'HT, l'assistenza postoperatoria è essenziale per migliorare i tassi di sopravvivenza degli animali da esperimento. Infine, è importante riconoscere che i pazienti con ictus clinico hanno spesso più fattori di rischio per l'HT, come diabete, ipertensione, fibrillazione atriale e29 anni. Pertanto, l'attuale modello animale non è in grado di replicare completamente i complessi meccanismi coinvolti in questi fattori di rischio.

In conclusione, questo protocollo ha replicato efficacemente l'HT innescata dall'iperglicemia acuta in un modello murino di ischemia-riperfusione cerebrale. Questo modello dimostra una buona ripetibilità, un'elevata stabilità e un alto tasso di sopravvivenza animale, rendendolo adatto per un uso diffuso nella ricerca preclinica sull'HT.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi contrastanti da rivelare.

Ringraziamenti

La Figura 1 è stata creata con il software BioRender (https://www.biorender.com/). Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del progetto guida della Natural Science Foundation della provincia di Hubei (n. 2022CFC057).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,3,5-Trifeniltetrazolio cloruro (TTC)Sigma-Aldrich108380Il colorante per la colorazione TTC Piastra di
coltura a 24 pozzettiCorning IncorporatedCLS3527Il recipiente per la colorazione TTC
Iniezione di glucosio al 30%Kelun PharmaceuticalH42021188Induzione di iperglicemia acuta
4% paraformaldeideWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Fissazione tissutale
5.0 Sutura assorbibile con acido poliglicolicoJinhuan Medical Co., LtdKCR531Attrezzatura per chirurgia
Piastra di coltura a 96 pozzettiCorning IncorporatedCLS3596Macchina per anestesia per misurazione del contenuto EB
Midmark Corporation Midmark CorporationVMRAsta per animale
Mezzo di montaggio antisbiadimento con DAPIBeyotime BiotechP0131Supporto per sezioni di tessuto
Automazione-disidratazione dei tessuti  Macchina
Leica BiosystemsTP1020Disidratare i tessuti
Microscopia confocaleLeica BiosystemsSTELLARIS 5Acquisizione di immagini
Diclofenac gel di sodioMaYinglong PharmaceuticalH10950214Analgesia per animali
di colorazione dell'eosinaServicebio TechnologyG1001Il colorante per H& Colorazione
E Evans BlueAladdinE104208Colorazione EB
Gel per occhiGuangzhou H44023098 farmaceuticaMateriale per la chirurgia
Fitc-destranoSigma-Aldrich60842-46-8Valutazione della permeabilità BBB
Microscopio a fluorescenzaOlympusBX51Acquisizione di immagini
Microtomo congelatoLeica BiosystemsCM1900Utilizzare per sezioni congelate
GlucometroYuWell580Misurazione della glicemia
Ematossilina Soluzione di colorazioneServicebioG1004Il colorante per H& Colorazione E
IodioLircon20020059Materiale per chirurgia
IsofluranoRwd Life ScienceR510-22-10Anestesia per animali
Misuratore di flusso sanguigno Laser dopplerdi MoormoorVMSMonitoraggio del flusso sanguigno
MCAO SutureRwd Life Science907-00023-01Materiale per chirurgia
MeloxicamBoehringer-Ingelheim J20160020Analgesia per animali
Kit di strumenti microchirurgiciRwd Life ScienceSP0003-MAttrezzatura per chirurgia
MicrotomoThermo Fisher ScientificHM325Produzione di sezioni di tessuto
Lama per microtomoLeica Biosystems819Produzione di sezioni di tessuto
Unguento alla mupirocinaGlaxoSmithKlineH10930064Anti-infezione per balsamo neutro animale
Absin Bioscienceabs9177Sigillo per H & E colorazione Centro di
inclusione della paraffinaThermo Fisher ScientificEC 350Produrre blocchi di paraffina
Pentobarbital sodicoSigma-AldrichP3761Eutanasia per soluzione salina tamponata con
fosfatoBeyotime BiotechC0221ARisciacquo per sezione tissutale
ScannerEPSONV330Rasoio
per scansione tissutaleFornitore verificato - Shenzhen Codos Electrical Appliances Co., Ltd.CP-9200Apparecchiature per chirurgia
SpettrofotometroThermo Fisher Scientific1510-02362Misurazione del contenuto di EB
Soluzione di saccarosioShanghai Macklin Biochemical57-50-1Disidratazione per tessuti
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Mezzo di inclusione tissutale
Acido tricloroaceticoSigma-AldrichT6399EB Misurazione del contenuto
Soluzione Strumenti animale

Riferimenti

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Ristampe e permessi

Errata corrige


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

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