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Articolo metodologico

Knockdown genico efficiente nel fegato tramite iniezione intrasplenica di piccolo RNA a forcina veicolato dal virus adeno-associato sierotipo 8 (AAV8)

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⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

1 novembre 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come l'iniezione intrasplenica di small hairpin RNA erogato da AAV8 raggiunga la stessa efficienza di knockdown genico nel fegato dell'iniezione della vena porta, rappresentando una procedura più semplice con mortalità e complicanze perioperatorie e postoperatorie molto più basse.

Abstract

Il fegato è un organo importante che svolge funzioni metaboliche essenziali. Lo sviluppo di un metodo efficiente e sicuro per abbattere l'espressione genica nel fegato fornisce uno strumento importante per determinare la funzione genica nella fisiopatologia epatica. In questo studio, descriviamo un metodo per l'iniezione intrasplenica del sierotipo 8 del virus adeno-associato (AAV8) ingegnerizzato per esprimere un piccolo RNA a forcina (shRNA) contro un gene bersaglio di interesse, la nucleostemina (NS). L'iniezione intrasplenica di AAV8 che esprime un shRNA mirato a NS (AAV8-shNS1) ha raggiunto la stessa efficienza di knockdown di NS nel fegato dell'iniezione nella vena porta, rispetto all'iniezione di AAV8 che esprime una sequenza strapazzata di shRNA (AAV8-shScr). Inoltre, l'iniezione del virus AAV8-shRNA ha innescato reazioni infiammatorie minime nel parenchima epatico. Ancora più importante, questo protocollo di iniezione intrasplenica non era tecnicamente impegnativo e causava un sanguinamento minimo nel sito di iniezione, che è la principale causa di mortalità perioperatoria e postoperatoria durante l'esecuzione dell'iniezione della vena porta. Questo studio riporta un metodo migliorato e relativamente sicuro per ottenere un efficiente knockdown genico nel fegato.

Introduzione

Il fegato è un organo vitale che metabolizza i nutrienti e le sostanze chimiche, ma è anche sotto costante esposizione a insulti citotossici e cancerogeni. Mentre il fegato adulto è in grado di ricrescere dopo una lesione, il suo potere rigenerativo è gravemente ostacolato all'età di1 anno. Ad oggi, l'unica opzione terapeutica per i pazienti con malattie epatiche croniche allo stadio terminale o danno epatico acuto massiccio è il trapianto di fegato, che pone molte sfide di per sé2. Per comprendere meglio la fisiopatologia molecolare del fegato interrogando le funzioni dei geni di interesse, sono state sviluppate manipolazioni genetiche per applicazioni in vivo , tra cui il knockdown mediato da RNAi e la delezione mirata da parte di una ricombinasi Cre in presenza di siti loxP3. La cassetta di cre-espressione e il costrutto di shRNA possono essere veicolati da veicoli virali.

Il sierotipo 8 del virus adeno-associato (AAV8) è un robusto vettore per la consegna genica a tipi di tessuto selettivi (ad es. fegato, muscolo scheletrico, cuore, cervello e pancreas) con elevata efficienza e bassa risposta infiammatoria 4,5. Per colpire gli organi interni del corpo, l'AAV8 viene comunemente introdotto mediante iniezione della vena caudale, in cui le particelle virali viaggiano prima attraverso il polmone prima di raggiungere la circolazione sistemica. Al contrario, l'iniezione della vena porta consente loro di raggiungere il fegato prima di circolare attraverso il polmone, una potenziale fonte di sequestro e diluizione. Tuttavia, l'iniezione della vena porta è tecnicamente impegnativa e spesso complicata da sanguinamento indotto dall'operazione e da un alto tasso di mortalità. Per ottenere un efficiente knockdown genico (KD) nel fegato, evitando il problema dell'elevata mortalità peri/postoperatoria, abbiamo testato un metodo di iniezione intrasplenica di AAV8 contenente un shRNA ingegnerizzato che ha come bersaglio la nucleostemina (NS) (AAV8-shNS1) e abbiamo confrontato la sua efficienza KD con quella di AAV8-shNS1 iniettato nella vena porta.

La NS è una proteina arricchita con cellule staminali/progenitrici scoperta prima nelle cellule staminali neurali e successivamente in diversi altri tipi di cellule staminali e tumori 6,7. L'importanza biologica della NS è dimostrata dal fenotipo letale embrionale precoce dei topi knockout per NS germinale (NSKO) in vivo 3,8 e dalla perturbazione dell'autorinnovamento in vitro 9,10 indotta da NSKD. Negli animali adulti, alti livelli di espressione di NS si trovano nel testicolo e in diversi tessuti sottoposti a rigenerazione, tra cui le cellule epiteliali pigmentate di tritone dedifferenzianti dopo lentectomia e le cellule muscolari dopo l'amputazione dell'arto11, così come i tessuti di mammifero rigeneranti, come i cardiomiociti di topo dopo danno cardiaco12 e gli epatociti dopo danno epatico (ad esempio, CCl 4) o resezione chirurgica (ad esempio, CCl4) o resezione chirurgica (ad esempio, epatectomia parziale)13,14. Inoltre, è stato dimostrato che le NS svolgono un ruolo importante nello sviluppo dei tumori mammari, epatici e orali 15,16,17. Meccanicisticamente, è stato dimostrato che la NS promuove l'auto-rinnovamento proteggendo il genoma replicante dai danni al DNA18,19. Tuttavia, a causa del fenotipo letale embrionale precoce della NSKO germinale, è necessario un metodo sperimentale per introdurre temporaneamente la NSKD dopo il completamento dello sviluppo tissutale per determinare ulteriormente le sue attività biologiche negli organi adulti.

In questo articolo, utilizziamo la NS come esempio calzante per illustrare la creazione e la sperimentazione di un metodo KD del gene epatico in vivo che è efficiente e ha una bassa mortalità indotta dalla procedura.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali completati in questo studio sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Texas A&M University Health Science Center di Houston (numero di approvazione: 2021-0264-IBT) ed eseguiti in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti. Sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J (4-5 mesi, peso corporeo 23-30 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Progettazione e produzione di AAV8- shRNA

NOTA: Si prega di fare riferimento a Sands et al.4 per i dettagli procedurali.

  1. Progettare oligonucleotidi shRNA senso e antisenso che hanno come bersaglio una sequenza lunga 21 nucleotidi all'interno della regione codificante del gene di interesse. In questo caso, sono stati utilizzati NS di topo (shNS1) e una sequenza criptata di 21 nucleotidi come controllo negativo (shScr) (Figura 1A, pannello inferiore).
  2. Includere nella struttura a forcina una sequenza stem-loop di TTCAAGAGA, un'estremità smussata 5', un'estremità coesiva compatibile con XhoI 3' e una sequenza di senso mirata gene-specifica di 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) o una sequenza strapazzata di 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. Fosforilare e ricuocere ogni coppia di oligonucleotidi.
  4. Digestare il vettore di trasferimento genico AAV, AV5-siRNA-GFP (Figura 1A, pannello superiore), con HpaI e XhoI, defosforilare e gel purificare il frammento vettore.
  5. Ligate ha ricotto gli oligonucleotidi nel vettore purificato con gel.
  6. Trasforma i prodotti di DNA legati in batteri DH5α competenti con efficienza di subclonaggio.
  7. Scegliete i singoli cloni in base alla resistenza all'ampicillina e coltivate 100 ml di coltura batterica per il miniprep plasmidico. Confermare il corretto clonaggio mediante sequenziamento e preparare i plasmidi utilizzando il kit privo di endotossine disponibile in commercio (seguendo le istruzioni del produttore).
  8. Impacchettare i virus AAV8 trasfettando il vettore di trasferimento AV5, il sierotipo 8 Rep/Cap e i plasmidi helper AdF6 in cellule 293T utilizzando il reagente di trasfezione iMFectin. Un totale di 40 piastre × 15 cm sono state trasfettate e raccolte/digerite a 3 giorni dopo la trasfezione.
  9. Recuperare l'AAV8 associato alle cellule mediante lisi cellulare e precipitare l'AAV8 secreto dai terreni con il 40% di PEG. Dopo la digestione, combinare i virus AAV8 nel lisato cellulare e nel terreno, purificare su un gradiente discontinuo di iodixanolo e concentrare in unità di centrifugazione con cut-off del peso molecolare (1,00,000 MW).
  10. Quantificare i titoli AAV8 mediante qPCR dell'endpoint assoluto con i primer: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') e WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Iniezione intrasplenica di AAV8 (Figura 1B, 1C) 

  1. Posizionare i topi C57BL6/J in una camera di anestesia riempita con isoflurano al 2% e ossigeno (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Dopo la perdita di coscienza, trasferire i topi nell'area chirurgica asettica in posizione sdraiata laterale destra. Mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% con ossigeno erogato attraverso un cono nasale.
  2. Sterilizzare il sito di incisione con clorexidina al 2% seguita da etanolo all'80%. Usa un paio di forbici mediche da 6,3 pollici per praticare un'incisione di 15 mm sulla parete addominale superiore sinistra, seguita da un'incisione di 10 mm sul peritoneo.
  3. Esporre delicatamente la milza usando una pinza e tenerla in posizione con una garza bagnata posta sotto l'organo.
  4. Mescolare delicatamente e iniettare i virus AAV8 (50 μL) per un periodo di 30 s nella milza utilizzando un ago da 30 G con la punta posizionata a una profondità di 3 mm sotto la superficie (Figura 1B). Coprire il sito di iniezione con un batuffolo di cotone e imprimere per 1 minuto.
  5. Sutura il peritoneo con una sutura intestinale cromica assorbibile 4-0.
  6. Chiudere la parete addominale e la pelle con una sutura di seta 4-0.
  7. Metti i topi in una gabbia pulita sopra un termoforo elettrico e monitorali fino al recupero.

3. Iniezione della vena porta di AAV8

  1. Anestetizzare i topi C57BL6/J mediante inalazione di isoflurano (2%) miscelato con ossigeno (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
  2. Eseguire la laparotomia 4,13 attraverso un'incisione sulla linea mediana (~ 1 pollice) sulla pelle e poi nel peritoneo.
  3. Posiziona una garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica sterile sul lato sinistro del mouse e usa un batuffolo di cotone sterile per estrarre delicatamente l'intestino crasso e tenue. Metti l'intestino sopra una garza bagnata e coprilo con un tampone per evitare che entri in contatto con la pelle o si secchi.
  4. Iniettare il virus AAV nella vena porta con un ago sterile da 32 G in un volume di 50 μL. Inserire l'ago di 3-5 mm nella vena della porta con un angolo inferiore a 5 gradi. Lasciare che il sangue scorra oltre l'ago per 5 secondi per evitare il riflusso.
  5. Posizionare la punta di un batuffolo di cotone sterile sulla parte superiore del sito di iniezione con una leggera pressione fino all'intera chiusura della vena e senza sanguinamento (circa 5 minuti) per evitare sanguinamento.
  6. Rimettere delicatamente gli organi interni nella cavità addominale.
  7. Chiudere la parete addominale e la pelle con sutura di seta 4-0.

4. Analisi qRT-PCR

  1. Estrarre gli RNA da 50-100 mg di tessuto epatico 4,13 utilizzando un reagente di isolamento dell'RNA disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Sintetizzare cDNA a filamento 1da RNA totali con esameri casuali e trascrittasi inversa M-MLV20,21.
  3. Determinare i valori di ΔC(t) tra il gene bersaglio e i geni di riferimento utilizzando il sistema di rilevamento PCR in tempo reale a colore singolo e il reagente verde SYBR supermix seguendo i rapporti precedentemente pubblicati22,23.
  4. Misurare i valori di ΔΔC(t) da quattro repliche biologiche e tre ripetizioni tecniche (n = 12). Impostare Tm a 60 °C per tutte le reazioni. Confermare i risultati utilizzando due geni di riferimento, Rps3 e Rplp0.
  5. Progettare le sequenze di primer come segue: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' e 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' e 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' e 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

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Risultati

Efficienze del gene KD nel fegato mediante intrasplenico vs. iniezione in vena porta di AAV8-shRNA
I ceppi virali di AAV8 sono stati diluiti a una concentrazione di lavoro di 2E+12 copie del genoma (gc) per millilitro (gc/mL). Ai singoli topi è stato iniettato 1E+11 gc di AAV8-shNS1 o AAV8-shScr (50 μL) tramite iniezione intrasplenica o nella vena porta. Due settimane dopo l'iniezione, i tessuti epatici sono stati raccolti per l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA del filamento<...

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Discussione

Il gene KD mediante somministrazione virale di un costrutto che esprime shRNA in un background wildtype24,25 o di un costrutto che esprime la ricombinasi Cre in un background floxato26 è un modo potente per interrogare la funzione genica in vivo in modo inducibile e controllato nel tempo. Un metodo di somministrazione ideale per gli studi in vivo con gene KO/KD dovrebbe raggiungere un'ele...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Individual Investigator Research Award (RP200081) a RYT.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Centrifugatori con filtro AmiconMilliporeSigmaUFC9100Ultrafiltrazione veloce
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972
Plasmide Batteri DH5&alfa; competenti Invitrogen#18265-017Ceppo chimicamente competente per la clonazione 
HpaI New England BiolabsR0105Reagente
trasfezione dell'enzima di restrizione iMFectin GenDepotI7100-101
M-MLV trascrittasi inversa PromegaM1708DNA polimerasi RNA-dipendente 
Sistema di rilevamento PCR in tempo reale monocolore MyiQ Kit Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega senza endotossineBioteckD6915-03Preparazione midi DNA plasmidico
Esameri casuali Invitrogen48190-011
Reagente verde Supermix SYBR Bio-Rad1708882Applicazioni di PCR in tempo reale
T4 DNA LigasiPromegaM1801
Reagente TRIzol Life Technologies15596-018Isolamento di RNA totale di alta qualità
XhoINew England BiolabsR0146Enzima di restrizione
di

Riferimenti

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

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