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Articolo metodologico

Studio della differenziazione delle cellule T CD4 murine utilizzando l'ablazione genica mediata dal complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9

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DOI:

10.3791/67380

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20 giugno 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

In questo articolo

Sommario

Delineiamo un approccio altamente adattabile all'utilizzo dell'ablazione genica mediata dal complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 in cellule T CD4 naive murine per studiare la funzione genica nel differenziamento delle cellule T CD4.

Abstract

L'ampia accessibilità della tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas9 ha reso il targeting genico nelle cellule primarie un metodo di routine per valutare la funzione genica nelle cellule T. Dato il costo e la disponibilità limitata di ceppi di topi knockout (KO), testare ipotesi preliminari che coinvolgono la funzione genica nelle cellule T può essere proibitivo utilizzando modelli animali mirati al gene. Tuttavia, utilizzando le risorse disponibili in commercio, tra cui gli RNA guida (gRNA) pre-progettati, i ricercatori possono generare convenientemente cellule T naive mirate al gene che possono essere utilizzate per studi di attivazione e differenziazione delle cellule T.

Qui delineiamo un protocollo per l'utilizzo di complessi ribonucleoproteici (RNP) CRISPR-Cas9 rilasciati dalla nucleofezione per generare in modo efficiente cellule T CD4 murane naïve al gene KO che possono essere utilizzate per valutare la funzione genica nella differenziazione delle cellule T CD4, in vitro. L'isolamento di cellule T CD4 naive da organi linfoidi secondari di topo, seguito dalla nucleofeczione con complessi Cas9-gRNA, assicura che il gene KO venga avviato prima dell'attivazione delle cellule T a valle, offrendo un vantaggio strategico rispetto alla somministrazione di gRNA mediata da retrovirus, che in genere richiede la preattivazione delle cellule T, impedendo la valutazione degli effetti nelle cellule T naive. Inoltre, questo metodo basato sulla nucleofezione bypassa i potenziali problemi di sviluppo associati agli animali con KO genico.

Dopo la somministrazione di Cas9-gRNA, descriviamo i protocolli per lo studio della differenziazione delle cellule T CD4 in linee Th1, Th2, Th17 e Treg utilizzando la polarizzazione in vitro . Inoltre, questo protocollo è adattabile all'utilizzo di cellule T CD4 o CD8 mirate al gene per numerose applicazioni a valle, inclusi altri studi di attivazione delle cellule T in vitro e studi di trasferimento adottivo in vivo. L'uso dei metodi CRISPR-Cas9 ha semplificato la nostra capacità di valutare la funzione genica nelle cellule T e consente il KO di routine di molti geni di interesse, liberando i ricercatori dalle limitazioni associate allo studio degli animali con KO genico.

Introduzione

L'uso di tecnologie basate su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) ha trasformato la nostra capacità di manipolare sequenze di DNA genomico, migliorando notevolmente la nostra capacità di studiare la funzione genica in innumerevoli sistemi biologici. Per quanto riguarda le cellule T CD4, sono emersi metodi che utilizzano i complessi ribonucleoproteici (RNP) CRISPR-Cas9, facilitando l'efficiente knock-out genico (KO) nelle cellule T native primarie che possono essere utilizzate per studi in vitro e in vivo 1,2,3,4. L'identificazione di nuovi geni putativi che regolano la differenziazione delle cellule T CD4 è spesso guidata da analisi trascrittomiche ed epigenomiche, generando nuovi bersagli per i quali possono esserci poche o difficili risorse da studiare, in particolare se il gene colpisce più tessuti e può richiedere una valutazione utilizzando topi geneticamente bersaglio condizionali. Il targeting genico attraverso la trasduzione retrovirale dei gRNA 5,6 è stato utilizzato per valutare la funzione genica nelle cellule T, ma richiede l'attivazione delle cellule T per l'infezione retrovirale e non può essere utilizzato per colpire i geni nelle cellule T naive. CRISPR-Cas9 somministrato per nucleofezione in cellule T naive offre uno strumento alternativo relativamente economico e veloce per convalidare e interrogare nuovi geni di interesse prima di investire in modelli murini dispendiosi in termini di tempo e denaro.

Nel nostro protocollo qui descritto, l'editing genico mediato da CRISPR-Cas9 viene effettuato utilizzando la proteina ricombinante Cas9 complessata con molecole di RNA guida (gRNA) che vengono consegnate in cellule T CD4 naive tramite nucleofezione. Il gRNA è costituito da due componenti distinti, un RNA CRISPR transattivante (tracrRNA) e un RNA CRISPR (crRNA). Dal punto di vista funzionale, le sequenze derivate da tracrRNA facilitano l'associazione del gRNA con Cas9, mentre le sequenze di crRNA contengono specificità per le regioni target del DNA di interesse. I complessi Cas9-gRNA mediano le rotture mirate del DNA a doppio filamento (dsDNA), con i gRNA che mediano la specificità di sequenza dell'attività dell'endonucleasi Cas9 7,8. La scissione del dsDNA mediata da Cas9 porta all'inattivazione genica, attraverso la generazione di mutazioni indel a seguito di un'estremità non omologa che si unisce in cellule bersaglio9. In questo protocollo, raccomandiamo di utilizzare più gRNA mirati ai geni di interesse per garantire un robusto KO nelle cellule T CD4 naive.

Le cellule T helper CD4 sono attori chiave nel sistema immunitario e guidano le risposte immunitarie attraverso la produzione di una varietà di citochine che modulano la funzione di molti tipi di cellule immunitarie. Dopo la stimolazione attraverso il recettore delle cellule T (TCR) in presenza di citochine specifiche, le cellule T CD4 naive possono differenziarsi in linee distinte di cellule T T helper (Th) CD4, tra cui Th1, Th2, Th17 e cellule T regolatorie (Treg)10,11,12. La definizione di queste distinte linee di cellule T CD4 è l'espressione di specifici fattori di trascrizione (TF) e citochine che definiscono il lignaggio (Figura 1). La differenziazione delle cellule T CD4 può essere modellata utilizzando la polarizzazione in vitro 13,14,15, utilizzando cellule T CD4 naive attivate attraverso il TCR in presenza di citochine che promuovono il lignaggio e anticorpi bloccanti che impediscono l'adozione inappropriata del lignaggio.

La combinazione del targeting genico CRISPR-Cas9 in cellule T CD4 naive con la polarizzazione in vitro delle cellule T CD4 offre un sistema robusto per valutare la funzione genica in queste cellule (Figura 2). Data l'ampia disponibilità di reagenti per valutare la differenziazione dei CD4 mediante citometria a flusso, gli aspetti chiave della differenziazione delle cellule T CD4, tra cui l'espressione del TF e la produzione di citochine, possono essere facilmente interrogati utilizzando i protocolli qui descritti. L'identificazione di nuovi geni che regolano la funzione delle cellule T CD4 migliora la nostra comprensione di queste cellule e i metodi CRISPR-Cas9 abbinati alla polarizzazione in vitro offrono una modalità robusta per valutare la funzione genica prima di impegnarsi in modelli murini KO genici.

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Protocollo

Per tutte le procedure qui descritte, sono stati utilizzati topi wild-type (WT) C57/BL6J. I topi sono stati mantenuti e trattati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) in conformità con le linee guida del NIAID (protocollo LISB-22E) e i comitati per la cura e l'uso degli animali presso il NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. Considerazioni prima di iniziare

  1. Selezione dei reagenti per gRNA
    NOTA: Consultare la Tabella dei materiali per ottenere reagenti gRNA pre-progettati mirati al genoma del topo utilizzato in questo protocollo.
    1. Cerca il gene di interesse (Tabella dei materiali, crRNA desiderati) e seleziona i primi tre crRNA pre-progettati classificati (formato 2 nmol). Inoltre, procurarsi un crRNA di controllo negativo da utilizzare in parallelo (Tabella dei materiali).
      NOTA: La formazione di gRNA funzionali richiede il duplexing del crRNA con il tracrRNA; procurarsi un reagente tracrRNA e seguire i passaggi descritti nel paragrafo 3.
    2. Progetta sequenze di gRNA mirate personalizzate.
      NOTA: La progettazione di sequenze di gRNA mirate personalizzate esula dall'ambito di questo protocollo, ma può essere eseguita utilizzando strumenti disponibili pubblicamente come CRISPick (Table of Materials).
  2. Buffer, supporti e apparecchiature
    NOTA: Se non diversamente specificato, utilizzare tamponi e reagenti freddi (4 °C).
    1. Preparare il tampone MACS, il tampone FACS, il tampone Triton X-100 allo 0,5%, il tampone di permeabilizzazione 1x, i terreni RPMI completi e i terreni IMDM (Table of Materials) completi prima di iniziare la procedura e conservare a 4 °C.
    2. Prima di iniziare questa procedura, procurarsi l'isolamento delle cellule T CD4 naive e i kit di microsfere anti-FITC (Tabella dei materiali).
    3. Prima di iniziare la nucleofezione (sezione 4), preriscaldare (37 °C) 5 mL di terreno IMDM completo e preparare un minimo di 10 mL di IMDM completo integrato con IL-7 a 5 ng/μL riscaldato a 37 °C (Tabella dei materiali). Regolare il volume del terreno preriscaldato secondo necessità per tenere conto dell'aggiunta di 125 μl per campione dopo la nucleofezione. Regolare il volume dell'IMDM completo contenente IL-7 secondo necessità, in base al numero di cellule nucleofettate (sezione 4).
    4. Prima di iniziare l'isolamento delle cellule presentanti l'antigene (APC), preparare il reagente mitomicina C aggiungendo 4 mL di H2O sterile al flaconcino da 2 mg di mitomicina C (0,5 mg/mL di concentrazione madre).
      NOTA: Eseguire tutte le fasi in una cappa di coltura tissutale e utilizzare tecniche asettiche sterili.

2. Isolamento naive delle cellule T CD4

NOTA: Le cellule T CD4 naive possono essere isolate utilizzando l'isolamento magnetico o attraverso la selezione cellulare. La purezza ottenuta dall'isolamento magnetico è in genere del 97% e la vitalità cellulare è molto elevata, mentre la selezione elettronica può migliorare la purezza cellulare a scapito della vitalità cellulare. Il protocollo qui descritto utilizzerà l'isolamento magnetico, ma può essere adattato a entrambi gli scenari. Assicurarsi che le colonne LS siano preparate in modo appropriato (Tabella dei materiali).

  1. Isolare la milza e i linfonodi (inguinale, brachiale, assiale e cervicale) dai topi (topi WT C57BL/6J usati qui).
  2. Posizionare un retino da 70 μm in un piatto da 60 mm con 5 mL di RPMI (Table of Materials) completo per ogni tessuto trattato. Elabora i linfonodi e la milza in piatti diversi per aumentare la resa. Macinare delicatamente i fazzoletti attraverso il filtro utilizzando uno stantuffo da una siringa da 3 ml. Sciacquare il filtro con 1-3 mL di terreno e trasferire le sospensioni a cellula singola in provette coniche da 15 mL.
  3. Ripetere il passaggio 2.2 per ulteriori linfonodi e tessuti splenici, se necessario.
  4. Centrifugare le sospensioni monocellulari a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Prepararsi a contare le celle come segue.
    1. Per i campioni splenici, aspirare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi ACK, incubare per 2-5 minuti a RT, quindi aggiungere 2 mL di RPMI completo, centrifugare, risospendere in 5 mL di RPMI completo e contare le cellule.
    2. Per le cellule linfonodali, aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 5 mL di RPMI completo fresco e contare le cellule.
  6. Per l'inserimento nel kit di isolamento CD4 naive, mescolare gli splenociti con le cellule linfonodali per raggiungere il numero di cellule desiderato per l'isolamento.
    NOTA: Tipicamente, 1 × 108 cellule linfonodali e della milza di topi WT-B6 producono 2-8 × 106 cellule T CD4 naive.
  7. Centrifugare la milza e le cellule linfonodali raggruppate a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel volume appropriato di tampone MACS (Table of Materials) come indicato nel protocollo del produttore (kit di isolamento delle cellule T CD4 naive).
  8. Seguire con precisione il protocollo del produttore per isolare le cellule T CD4 naive mediante selezione negativa (Tabella dei materiali) utilizzando il cocktail di anticorpi di biotina delle cellule T CD4+ Naive, le microsfere anti-biotina e le microsfere CD44; utilizzare colonne LS per questo isolamento e raccogliere le cellule in provette coniche da 15 mL.
  9. Dopo l'isolamento, centrifugare le cellule a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno RPMI completo e contare le cellule.
  10. Conservare le cellule a 4 °C fino al momento di iniziare la nucleofezione.

3. Formazione del complesso Cas9-gRNA

NOTA: Preparare scorte di crRNA di controllo negativo e gene-specifiche. Descriviamo l'utilizzo di un crRNA unico per le condizioni di controllo negativo e tre crRNA unici per le condizioni di targeting genico. L'utilizzo simultaneo di tre crRNA distinti garantisce il KO dei geni di interesse.

  1. Risospendere i crRNA e il tracrRNA a concentrazioni stock di 100 μM utilizzando il tampone duplex (Tabella dei materiali). Ciò equivale a 10 μL di tampone per 1 nmol di RNA.
  2. Combinare singoli crRNA con tracrRNA in un rapporto 1:1 in provette sterili per PCR e miscelare mediante pipettaggio. Riscaldare a 95 °C per 5 minuti in un termociclatore. Quindi, lasciare raffreddare i complessi a RT su un banco di lavoro per almeno 10 minuti.
    NOTA: i duplex crRNA/tracrRNA sono indicati come gRNA da questo punto in poi. I complessi sono stabili per almeno 6 mesi se conservati a -20 °C. In genere produciamo 6 μL di gRNA (3 μL di crRNA + 3 μL di tracrRNA) per corsa, fornendo materiale sufficiente per circa cinque campioni (1 μL/campione).
  3. Per i gRNA mirati ai geni: nelle provette PCR sterili, aggiungere 3 μL di gRNA (1 μL ciascuno dei tre gRNA unici per target), 1 μL di proteina Cas9 e 1 μL di tampone Duplex (5 μL totali per campione). Pipetta delicatamente per mescolare e assicurarsi che tutto il materiale sia sul fondo del tubo. Incubare a RT per 10 min. Sincronizzare la temporizzazione di questo passaggio con la nucleofezione (passaggi 4.1-4.2).
  4. Per il gRNA di controllo negativo: nelle provette PCR sterili, aggiungere 1 μL di gRNA, 1 μL di proteina Cas9 e 3 μL di tampone Duplex (5 μL in totale per campione). Pipetta delicatamente per mescolare e assicurarsi che tutto il materiale sia sul fondo del tubo. Incubare a RT per 10 min. Ancora una volta, sincronizzare i tempi di questo passaggio con la nucleofezione (passaggi 4.1-4.2).
    NOTA: L'utilizzo di 50 pmol di gRNA per il controllo negativo (rispetto a 3 x 50 pmol per il test) è più conveniente e non ha alcun impatto sui risultati.

4. Nucleofeczione - Ablazione genica mediata da Cas9-gRNA

  1. Centrifugare 1-8 × 106 cellule T purificate a 500 × g per 5 min, 4 °C per campione di nucleofezione. Rimuovere con cura quanto più surnatante possibile.
  2. Risospendere le cellule in 20 μL di tampone P3 (16,4 μL di P3 + 3,6 μL di integratore per campione; Kit Nucleofector, Tabella dei Materiali) e trasferire la sospensione in provette PCR contenenti i complessi Cas9-gRNA. Miscelazione e trasferimento in pozzetti indipendenti di una nucleocuvetta a 16 pozzetti (kit nucleolettore, tabella dei materiali). Assicurarsi che non si siano formate bolle durante il trasferimento delle cellule nella cuvetta, in quanto ciò può influire negativamente sull'efficienza della nucleofezione. Battere la cuvetta contro una superficie di lavoro per assicurarsi che tutto il materiale sia sul fondo di ogni pozzetto e privo di bolle.
  3. Eseguire la nucleofezione utilizzando il programma DN100 del nucleolettore di riferimento (Table of Materials). Aggiungere immediatamente 125 μl di terreno IMDM completo preriscaldato ai pozzetti della nucleocuvetta e trasferire le cellule in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Sciacquare ogni pozzetto un'altra volta con 125 μl di terreno preriscaldato per garantire la raccolta di tutte le cellule.
  4. Centrifugare le cellule a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere tutto il terreno e risospendere in 200 μl di terreno IMDM completo riscaldato + 5 ng/mL di IL-7 (Tabella dei materiali).
  5. Trasferire 200 μL di cellule nella piastra di coltura e aggiungere un terreno IMDM completo riscaldato + 5 ng/mL di IL-7 per ottenere il volume finale desiderato in base alle dimensioni della piastra come segue: 1-2 × 106 cellule per pozzetto su una piastra a 48 pozzetti (1 mL di terreno per pozzetto), 2-4 × 106 cellule per pozzetto su un volume di 24 pozzetti (1,5 mL di terreno per pozzetto), 4-6 × 106 celle per pozzetto su una piastra a 12 pozzetti (2 mL di terreno per pozzetto) e 6-10 ×10 6 celle per pozzetto su una piastra a 6 pozzetti (4 mL di terreno per pozzetto). Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 3 giorni.
    NOTA: A seconda del turnover delle proteine e del saggio a valle, ottimizzare questo periodo di coltura. Abbiamo trovato un periodo di riposo ottimale di 3 giorni, ma questo può essere regolato in base al gene bersaglio tra 1 e 7 giorni utilizzando queste condizioni.
  6. Dopo la coltura in terreno IMDM completo + 5 ng/mL di IL-7, risospendere le cellule mediante pipettaggio e raccoglierle in provette coniche da 15 mL. Centrifugare le cellule a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno RPMI completo.
  7. Contare le cellule per determinare il numero di cellule T CD4 naive vive corrispondenti alle cellule nucleofettate di gRNA di interesse.
    NOTA: Nel processo di nucleofezione, aspettatevi di perdere ~ 50% delle cellule di input nel corso di questo protocollo e regolate di conseguenza il numero di cellule T CD4 naive. Inoltre, a questo punto, è possibile testare l'efficienza del gene mirato nelle cellule T CD4 naive utilizzando una varietà di tecniche (citometria a flusso, western blot, qPCR o saggio T7EI).

5. Isolamento delle cellule presentanti l'antigene (APC)

NOTA: Assicurarsi che sia stato preparato il reagente mitomicina, che verrà utilizzato per trattare le APC dopo l'isolamento (Tabella dei materiali). Leggere il protocollo anti-microsfere FITC del produttore prima di iniziare e assicurarsi che le colonne LS siano preparate in modo appropriato (Tabella dei materiali).

  1. Isolare la milza dai topi WT designati per l'isolamento APC.
  2. Effettuare sospensioni unicellulari come descritto sopra (2.2, 2.5.1), lisi eritrociti con tampone di lisi ACK, risospendere il pellet cellulare in 5 mL di RPMI completo (4 °C) e contare le cellule.
    NOTA: Dopo l'isolamento delle APC, aspettatevi di ottenere circa la metà del numero di cellule di input, ad esempio, 1 × 108 splenociti di input produrranno ~40-50 × 106 APC. Preparare il numero desiderato di splenociti per l'isolamento.
  3. Centrifugare le celle a 500 × g per 5 min, 4 °C e risospendere il pellet della cella in 800 μL di tampone MACS (Table of Materials).
  4. Aggiungere 4 μl ciascuno di anticorpi anti-CD4 e anti-CD8 coniugati con FITC (Tabella dei materiali) agli splenociti. Mescolare bene e incubare a 4 °C per 15 min.
  5. Centrifugare le celle a 500 × g per 5 min, 4 °C e rimuovere il surnatante. Seguendo le istruzioni del produttore, risospendere le celle nel volume raccomandato di tampone MACS e aggiungere la quantità appropriata di microsfere anti-FITC (Tabella dei materiali).
  6. Incubare le cellule a 4 °C per 15 minuti. Centrifugare le celle a 500 × g per 5 min, 4 °C. Risospendere le cellule in 500 μL di tampone MACS e farle passare attraverso la colonna LS preparata come descritto nel protocollo del produttore, raccogliendo le cellule in una provetta conica da 15 mL.
  7. Centrifugare le cellule a 600 × g per 5 min, 4 °C, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 2,7 mL di PBS sterile.
    NOTA: Gli APC possono pellettare male; Utilizzare una velocità maggiore per la centrifugazione.
  8. Aggiungere 300 μL di soluzione di mitomicina C alle cellule per ottenere una concentrazione finale di 50 μg/mL. Mescolare bene e incubare a 37 °C a bagnomaria per 30 min o per 45 min a 37 °C, 5% CO2 in incubatore.
  9. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 600 × g per 5 min, 4 °C e lavarle con 10 mL di 1x PBS sterile. Utilizzare l'aspirapolvere per rimuovere quanto più surnatante possibile. Ripetere il lavaggio 2 volte.
  10. Centrifugare nuovamente le cellule a 600 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno RPMI completo (4 °C). Conta le celle. Conservare le APC a 4 °C fino al momento di eseguire la differenziazione delle cellule T CD4.

6. Differenziazione delle cellule T CD4

NOTA: Questo protocollo è impostato per la coltura di cellule in un formato di piastra a 48 pozzetti-2 × 105 CD4 naive + 1 × 106 APC per pozzetto-un rapporto 1:5. Le cellule vengono coltivate in terreni IMDM completi. Qui, forniremo le condizioni per il differenziamento delle cellule T Th1, Th2, Th17 e Treg CD4; Tuttavia, le condizioni di derivazione individuali possono essere scelte a seconda dell'attenzione dell'utente.

  1. Determinare il numero di celle in una piastra a 48 pozzetti da utilizzare e calcolare il numero di celle necessarie per ciascun tipo di cella.
    NOTA: Ad esempio, 10 pozzetti richiederebbero 2 × 106 CD4 naive e 10 × 106 APC per mantenere il rapporto 1:5. Se il numero di celle lo consente, calcolare un numero sufficiente di celle per un pozzetto aggiuntivo per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio durante la piastratura.
  2. Miscelare insieme il numero desiderato di CD4 e APC naive a 1:5, centrifugare le cellule a 600 × g per 5 min, 4 °C, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 μL di terreno IMDM completo per pozzetto (ad esempio, cellule corrispondenti a 10 pozzetti in 5 mL di terreno).
  3. Piastre con incrementi di 500 μl di cellule nei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti, assicurando che ogni pozzetto contenga 2 × 105 CD4 naive + 1 × 106 APC.
  4. Per le condizioni di differenziazione delle cellule T CD4 desiderate, preparare 2 miscele di citochine + anticorpi in IMDM completo come descritto nella Tabella 1. Aggiungere 500 μl della miscela 2x agli incrementi di 500 μl di cellule precedentemente piastrate per ottenere le concentrazioni finali dei reagenti 1x.
    NOTA: Questi esempi si basano sulla preparazione di 2,5 ml di preparazioni 2x, sufficienti per cinque pozzetti per ogni condizione. Anche in questo caso, se le quantità di reagenti lo consentono, effettuare un ulteriore incremento di 2 volte la miscela per tenere conto dell'errore di pipettaggio.
  5. Aggiungere 500 μl di citochine 2x + terreni anticorpali a 500 μl di pozzetti contenenti cellule CD4/APC per ottenere una concentrazione finale di reagenti a 1x.
  6. Posizionare la piastra a 48 pozzetti in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. Coltura delle cellule per 72 ore per consentire il completamento della polarizzazione dei CD4.
    NOTA: Esaminare la piastra dopo il periodo di coltura per garantire una crescita robusta. Il terreno deve essere di colore arancione dopo l'incubazione, con terreni gialli che indicano una potenziale crescita eccessiva delle cellule.

7. Valutazione dell'impatto dell'ablazione genica nel differenziamento delle cellule T CD4

NOTA: Per tutte le fasi di colorazione, preparare una miscela master di anticorpi aggiunti alla diluizione appropriata al tampone di colorazione richiesto. Per campione viene utilizzato un volume di 50 μl del cocktail anticorpo/tampone. Regolare gli anticorpi specifici utilizzati in base all'esperimento. Gli utenti dovrebbero scegliere pannelli di anticorpi pertinenti ai loro esperimenti specifici; Qui forniamo un modello con cui affrontare questo nel contesto dei geni presi di mira qui.

  1. Dopo la differenziazione dei CD4, rimuovere con cura 600 μl di surnatante, quindi risospendere le cellule in ciascun pozzetto mediante pipettaggio.
  2. Rimuovere 200 μl di cellule da ciascun pozzetto e aggiungerle a una piastra a 96 pozzetti etichettata per la colorazione del fattore di trascrizione. Pellettare i campioni centrifugando a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e procedere alla colorazione superficiale (passaggio 7.5).
  3. Per l'analisi delle citochine, ristimolare i restanti 200 μL di cellule con PMA (50 ng/mL), ionomicina (500 ng/mL) e Golgi Stop (1/2.000 diluizione) in IMDM completo. Aggiungere 200 μl della miscela di restimolazione 2x a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 4 ore.
    NOTA: Dovrebbero esserci 200 μl rimanenti nella piastra a 48 pozzetti; quindi, l'aggiunta di 200 μL della miscela 2x di PMA (2x, 100 ng/mL), ionomicina (2x, 1 μg/mL) e Golgi Stop (2x, 1/1.000) creerà una concentrazione finale di 1x (Tabella dei materiali).
  4. Nel frattempo, iniziare la colorazione del fattore di trascrizione. Eseguire la colorazione dell'antigene di superficie risospendendo le cellule in 50 μL di tampone FACS contenente gli anticorpi coniugati al fluorocromo desiderati per campione (Tabella 2). Incubare al buio a 4 °C per 30 min.
  5. Aggiungere 150 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto per lavare via il tampone di colorazione. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Togliete il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi.
  6. Fissare le cellule con 100 μL di soluzione di fissazione Foxp3 (Tabella dei materiali) al buio a RT per 25 minuti.
  7. Dopo 25 minuti, aggiungere 100 μL di tampone FACS a ciascun pozzetto per lavare via il fissativo. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi.
  8. Eseguire la colorazione intracellulare risospendendo le cellule in 50 μL di tampone di permeabilizzazione 1x Foxp3 contenente anticorpi specifici per il fattore di trascrizione direttamente coniugati per campione (Tabella 2) per un minimo di 1 ora a 4 °C al buio.
  9. Al termine della colorazione intracellulare, aggiungere 100 μL di tampone FACS a ciascun pozzetto. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi. Risospendere le cellule in un volume finale di 200 mL per la citometria a flusso.
  10. Dopo l'interruzione della restimolazione di PMA/ionomicina/Golgi, risospendere le cellule mediante pipettaggio e trasferire 400 μL di ciascun campione di citochine in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Pellettare i campioni a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Risospendere i campioni cellulari in 100 μl di tampone FACS e trasferirli in una piastra a 96 pozzetti per la colorazione superficiale. Pellettare nuovamente i campioni centrifugando a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, quindi rimuovere il surnatante.
  11. Preparare un cocktail di colorazione superficiale con tampone FACS contenente anticorpi fluorescenti diretti contro gli antigeni di superficie (Tabella 2). Risospendere le cellule in 50 μl di tampone di colorazione per campione e incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
  12. Aggiungere 150 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto per lavare via il tampone di colorazione. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Togliete il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi.
  13. Fissare le celle in 100 μL di PFA (Table of Materials) al buio a RT per 25 minuti.
  14. Aggiungere 100 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto per lavare via il fissativo. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Togliete il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi.
  15. Eseguire la colorazione intracellulare delle citochine risospendendo le cellule in 50 μL di anticorpo anti-citochine contenente lo 0,5% di tampone di colorazione Triton X-100 per campione (Tabella 2) per un minimo di 1 ora a 4 °C al buio.
  16. Al termine della colorazione intracellulare, aggiungere 100 μL di tampone FACS a ciascun pozzetto. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi. Risospendere le cellule in un volume finale di 200 mL per la citometria a flusso.
  17. Analizzare il fattore di trascrizione e i campioni colorati con citochine mediante citometria a flusso.
    NOTA: I profili di citometria a flusso attesi dai pannelli di colorazione delineati saranno mostrati nella sezione dei risultati rappresentativi.

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Risultati

Per convalidare che una popolazione pura di cellule T CD4 naive è stata ottenuta utilizzando il nostro protocollo (Sezione 2), abbiamo utilizzato la citometria a flusso per identificare queste cellule prima e dopo l'isolamento magnetico. Utilizzando il nostro approccio, abbiamo ottenuto una popolazione altamente pura di cellule T CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ naive CD4 dopo l'isolamento (Figura 3A). Inoltre, per confermare c...

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Discussione

L'integrazione di protocolli per la somministrazione di complessi CRISPR-Cas9 in cellule T CD4 naive con metodi per lo studio della differenziazione delle cellule T CD4 fornisce uno strumento robusto per esplorare nuovi geni che regolano la biologia delle cellule T CD4. Qui, forniamo una guida completa per l'utilizzo di reagenti Cas9 e gRNA disponibili in commercio con cui è facile lavorare. La somministrazione mediata dalla nucleofezione di complessi Cas9-gRNA in cellule T CD4 naive for...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIAID, NIH.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTA, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
16% Paraformaldeide, PFAMicroscopia elettronicaScienze 15710Diluire con PBS per ottenere una soluzione fissativa PFA al 4%
1x tampone eBioscience (1x tampone di permeabilizzazione)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Utilizzare il tampone di permeabilizzazione dal kit per preparare 1x soluzione
1x PBS, pH = 7,4Qualità Biologico114-058-101
2-mercaptoetanolo (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 mmpiatto Falcon353002
70 &; m filtro a rete di nylonFisherbrand22363548
ACK Lysing BufferGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032Questo kit include: Soluzione di cellule primarie P3, Supplemento 1 e strisce di nucleocuvetta a 16 pozzetti Microsfere
anti-FITCMiltenyi Biotec130-048-701Segui il protocollo delle microsfere Miltenyi Anti-FITC
anti-topo CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1vedere la Tabella 1 per la concentrazione di riserva
anti-topo CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1vedere la Tabella 1 per la concentrazione di stock
anti-topo IFNγ (XMG1.2)bioXcellBE0055vedere la Tabella 1 per la concentrazione madre
anti-topo IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051vedere la Tabella 1 per la concentrazione madre
anti-topo IL-4 (11B11)bioXcellBE0045vedere la Tabella 1 per la concentrazione madre
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
Bovine Serum Albumin, BSASigma Life ScienceA3059
Cas9 enzimaIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nucleasi V3 (10mg/mL) - contiene una sequenza di localizzazione nucleare
Terreni IMDM + IL-7Completi IMDM con 5 ng/mL IL-7
Completi IMDM MediaIMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-Glutammina, 1% Pen/Strep, 0,1% BME
Complete RPMI MediaRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-glutammina, 1% penna/streptococco, 0,1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
crRNA desiderati IDTUsato preprogettato dal sito web IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Set di tamponi per colorazione con fattore di trascrizioneThermo Fisher Scientific00-5523-00Il kit contiene tre reagenti: Concentrato di fissazione/permeabilizzazione (4x), Diluente di fissazione/permeabilizzazione e Tampone di permeabilizzazione (10x)Tampone
FACS1x PBS, 1% FBS, 1 mM EDTA
Siero fetale bovino (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Inattivare il calore prima dell'uso (riscaldare a 56 gradi) C per 45 minuti)
FITC anti-topo CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 diluizione (0,5 mg/mL di concentrazione madre)
FITC anti-topo CD8&alfa; (53-6,7)Biolegend100706diluizione 1/200 (0,5 mg/mL di concentrazione madre)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 diluizione
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Ionomicina sale di calcio da Streptomyces conglobatus (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634Concentrazione finale raccomandata di 500 ng/mL
L-Glutammina 200 mM (100x)Colonne Gibco25030-081
LSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Tampone1x PBS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, filtro sterilizzato
Mitomicina C (0,5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG 
Topo Naï ve Kit di isolamento delle cellule T CD4Miltenyi Biotec130-104-453Segui Miltenyi Naï ve Protocollo di isolamento delle cellule T CD4. Questo kit include Naï ve CD4+ T Cell Biotina Antibody Cocktail, Microsfere Anti-Biotina e Microsfere CD44
Controllo negativo crRNAIDT1072544alternativa alla progettazione del proprio controllo negativo
Tampone duplex senza nucleasi IDT1072570
strisce di provette PCRUSA Scientific1402-2700
Penicillina StreptomicinaGibco15140-023
Phorbol 12-miristato 13-acetato, PMA (100 µ g/mL)Sigma AldrichP8139Concentrazione finale consigliata di 50 ng/mL
ProSeries ProPro High Performance 15mLCentrifuge Tubes Alkali ScientificPS560015 mL provette coniche
ricombinanti umane (h) IL-2Peprotech200-02vedere la Tabella 1 per la concentrazione stock
ricombinante umano TGF-b1 (derivato da HEK293)Peprotech100-21vedere la Tabella 1 per le scorte concentrazione
murina ricombinante IL-12p70Peprotech210-12vedere la Tabella 1 per la concentrazione madre
ricombinante murina IL-4Peprotech214-14vedere la Tabella 1 per la concentrazione madre
ricombinante murina IL-6Peprotech216-16vedere la Tabella 1 per la concentrazione madre
ricombinante murina IL-7Peprotech217-17Preparare a 100 ng/mL
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
TermociclatoreApplied Biosystems4375786Usiamo questo modello di termociclatore, tuttavia qualsiasi apparecchiatura simile funzionerà bene in questo protocollo
tracrRNA Atto550 etichettato IDT1075928Consente il rilevamento di complessi Cas9-gRNA dopo la nuceloefeczione utilizzando la fluorescenza Atto550 come lettura. Raccomandiamo questo reagente se possibile.
Triton-X1x PBS, 0,5% TritonX-100, 0,1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
tracrRNA non marcato IDT1072534Un'opzione di tracrRNA più conveniente, ma non consente la valutazione dell'efficienza di nucelofeczione dei complessi Cas9-gRNA
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305Utilizziamo questo modello di termociclatore, tuttavia qualsiasi apparecchiatura simile funzionerà bene in questo protocollo
Tampone

Riferimenti

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