Articolo metodologico

Contenzione per indurre stress in topi e ratti

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DOI:

10.3791/67387

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6 dicembre 2024

1Department of Psychological and Brain Sciences, Fairfield University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo copre le procedure per indurre risposte allo stress utilizzando lo stress di contenzione fisica nei topi e nei ratti. Vengono discusse ulteriori considerazioni che dovrebbero essere osservate quando si seleziona e si utilizza lo stress di ritenuta nei modelli di roditori.

Abstract

In tutte le specie animali, l'esposizione a condizioni di stress induce risposte allo stress. Un metodo per studiare gli effetti dello stress utilizzando modelli di roditori è la procedura di stress di contenzione. Lo stress da contenzione è stato utilizzato per decenni per studiare i cambiamenti nella fisiologia, nella genetica, nella neurobiologia, nell'immunologia e in altri sistemi influenzati dallo stress. A causa della facilità di esecuzione della procedura, del basso costo e delle numerose modifiche alla scala per l'intensità e la durata dell'esposizione allo stress, una vasta letteratura di studi ha utilizzato lo stress di contenzione nei topi e nei ratti. Ad esempio, questo studio presenta dati precedentemente pubblicati che mostrano l'impatto dello stress da contenzione nei topi transgenici sui livelli plasmatici di corticosterone e sul rilascio di noradrenalina indotta optogeneticamente. Lo stress da contenzione acuta ha aumentato i livelli plasmatici di corticosterone, ma questo effetto è stato attenuato nei topi a seguito di stress da contenzione ripetuta. Tuttavia, il rilascio stimolato di noradrenalina nel nucleo del letto della stria terminale è stato aumentato solo nel gruppo con stress da contenzione ripetuta. Questi dati evidenziano importanti considerazioni sui parametri di restrizione sulle misure dipendenti. Per il confronto sono incluse anche ulteriori descrizioni dello stress di contenzione nei ratti. Infine, vengono discussi l'influenza dei parametri della contenzione (ad esempio, acuto vs. cronico) e le caratteristiche dei soggetti animali (ceppo, sesso, età).

Introduzione

A causa dell'esperienza universale dello stress, le indagini sui meccanismi delle risposte alterate a seguito dell'esposizione allo stress sono state un'area di ricerca costante per diversi decenni1. Queste indagini hanno iniziato ad analizzare gli aspetti dello stress che possono essere utili per aumentare l'adattabilità e la reattività ai fattori di stress acuti derivanti da esperienze di stress che inducono alterazioni disadattive delle funzioni fisiologiche e comportamentali, spesso derivanti da un'esposizione prolungata a fattori di stress ripetuti e/o imprevedibili. Molte di queste risposte ai fattori di stress hanno un impatto sulla funzione cerebrale, sull'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA), sui rami simpatico e parasimpatico del sistema nervoso autonomo e sul sistema immunitario. L'esposizione a fattori di stress avvia l'aumento del rilascio del fattore di rilascio della corticotropina (CRF) per aumentare l'ormone adrenocorticotropo (ACTH) e gli ormoni glucocorticoidi, come il cortisolo nei primati e in molti altri mammiferi e il corticosterone nei roditori2. Inoltre, l'epinefrina e la noradrenalina vengono rilasciate in tutta la periferia e nel cervello come parte della risposta del sistema nervoso simpatico3. Questi segnali chimici interagiscono quindi con una serie di sistemi fisiologici, come la funzione immunitaria, il metabolismo, la riproduzione e la reattività neuronale4.

Le esperienze stressanti sono associate a una miriade di condizioni, tra cui aumenti di ansia e depressione, alterazioni dell'apprendimento e della memoria, menomazioni nel processo decisionale e nella funzione esecutiva e suscettibilità al disturbo da uso di sostanze, tra le altre. Ciascuno di questi effetti dipende sia dai parametri del fattore di stress che dalle caratteristiche dell'individuo che vive lo stress4. La natura del fattore di stress, come acuto o cronico e come controllabile o imprevedibile, altera sostanzialmente i risultati osservati. Questi aspetti dello stress sembrano coerenti tra le esperienze umane e i modelli animali. Pertanto, per modellare lo stress negli studi sugli animali, è necessario prestare attenzione a selezionare i parametri di esposizione allo stress che siano appropriati per la specie, il sesso e la condizione.

Sebbene siano disponibili un certo numero di fattori di stress per gli studi con i roditori (inclusi fattori di stress psicosociali come lo stress da isolamento sociale o la sconfitta sociale, fattori di stress farmacologici come la somministrazione di cortisolo o yohimbina, fattori di stress fisici come lo shock del piede e la contenzione e fattori di stress multimodali che combinano o alternano tra le condizioni), l'obiettivo di questo manoscritto sarà l'uso dello stress di contenzione nei topi e nei ratti. Lo stress da contenzione potrebbe essere scelto rispetto ad altri fattori di stress perché è facile da eseguire, poco costoso, adattabile a roditori di varie dimensioni, scalabile sia per periodi acuti che a lungo termine e raramente provoca danni negativi al soggetto5. Sebbene questo manoscritto si concentri sui cambiamenti duraturi indotti dall'esposizione allo stress da contenzione, alcuni studi utilizzano la contenzione nei roditori per esaminare i meccanismi e i comportamenti che si verificano durante la contenzione, compresi i comportamenti di coping attivi coinvolti nella fuga dal fattore di stress 6,7,8,9. L'obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire considerazioni metodologiche per valutare l'impatto dello stress da contenzione su soggetti di topi o ratti.

Protocollo

Gli esperimenti e i protocolli sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (topi) e la Fairfield University (ratti) e seguono le linee guida del NIH10.

1. Stress da contenimento nei topi

NOTA: I topi offrono una serie di vantaggi quando studiano gli effetti dello stress sulla fisiologia e sui sistemi neuronali. Con la prevalenza di linee di topo transgeniche, le indagini meccanicistiche sulle interazioni tra geni ed esposizioni allo stress sono facilmente fattibili. Sia che si utilizzino topi transgenici o wild-type, si raccomanda di considerare il ceppo di fondo. Inoltre, a causa delle loro dimensioni e dell'alloggio sociale, i topi offrono un vantaggio nell'utilizzo dello spazio rispetto ad altre specie.

  1. Esposizione allo stress di contenzione
    1. Assegna in modo casuale i topi ai gruppi di controllo della gabbia, stress da contenzione acuta o stress da contenzione cronica.
    2. Determinare la durata dell'esposizione allo stress. Per i fattori di stress acuti, utilizzare una singola sessione della durata di 5 minuti fino a 12 ore confinata nell'apparecchio di contenzione. Per i fattori di stress cronici, assicurati che la sessione corrisponda alla durata del fattore di stress acuto, ma venga ripetuta quotidianamente per un minimo di 3 giorni e un massimo di 21 giorni.
      NOTA: Poiché i topi non avranno accesso a cibo e acqua durante le condizioni di contenzione, considera se anche gli animali di controllo in gabbia domestica dovrebbero non avere accesso a cibo e acqua.
    3. Modificare le provette coniche da 50 ml per aggiungere fori di ventilazione.
      1. Utilizzare un trapano elettrico con una punta da 1/8" per distanziare uniformemente i fori attorno a ciascun tubo conico per garantire il flusso d'aria in tutte le aree del tubo.
      2. Posizionare questi fori per consentire al mouse di accedere all'aria indipendentemente dalla direzione in cui è rivolto il mouse nel tubo. Assicurarsi che non rimangano spigoli vivi dopo la modifica.
        NOTA: Questi tubi conici modificati dovrebbero essere efficaci per la maggior parte dei topi adulti (~20-40 g) ma potrebbero non trattenere topi piccoli/giovani o ceppi più grandi.
    4. In una sala prove, separata dalla stabulazione degli animali e dai test comportamentali, posizionare l'animale assegnato alla contenzione nel tubo conico modificato con il tappo attaccato per confinare il topo nel tubo per la lunghezza designata della contenzione.
      NOTA: Le specifiche del design della sala prove possono variare in base allo spazio disponibile nella struttura; La sala potrebbe includere cappe chimiche e altre attrezzature di laboratorio e/o tavoli/banchi da laboratorio o essere una sala per procedure vuota. Tuttavia, indipendentemente dalla configurazione della stanza, l'ambiente della stanza di contenzione dovrebbe rimanere coerente in caso di esposizioni ripetute alla contenzione per evitare alterazioni indotte dal contesto nelle risposte allo stress11.
    5. Posizionare il tubo di ritenuta orizzontalmente su una superficie piana. Se necessario, fissare la provetta con del nastro adesivo da laboratorio o una bacinella per pipette/serbatoio del reagente in modo che non rotoli con il mouse all'interno.
      NOTA: In condizioni di stress, i topi producono vocalizzazioni ultrasoniche. Considerare se il disegno dello studio richiede l'isolamento acustico da altri soggetti soggetti trattenuti12. Il corticosterone e altri marcatori delle risposte allo stress seguono i ritmi circadiani. Pertanto, è necessario fare considerazioni sulle condizioni di illuminazione e sul tempo del fattore di stress. In tutti i gruppi di stress, la contenzione dovrebbe verificarsi in un momento costante della giornata, preferibilmente all'inizio del ciclo di luce 13,14,15. Per lo studio qui presentato, i topi sono stati trattenuti per circa 3 ore dopo l'accensione delle luci.
    6. Monitorare ogni animale durante lo stress da ritenuta almeno ogni 20 minuti. Determinare visivamente se l'animale sta mostrando risposte insolite (respirazione lenta, mancanza di movimento). Se osservato, rimuovere il topo dal tubo di contenzione, contattare un veterinario ed escludere il topo dallo studio.
    7. Rimetti il topo nella gabbia di casa e fornisci l'accesso a cibo e acqua.

2. Stress da contenimento nei ratti

NOTA: Essendo roditori più grandi, i ratti hanno vantaggi da considerare quando studiano gli effetti dello stress. Come i topi, i ratti hanno vari ceppi con risposte differenziali all'esposizione allo stress16,17. Inoltre, l'aumento delle dimensioni dei ratti rende i ratti più facili da usare con determinate misure comportamentali, ad esempio l'autosomministrazione di farmaci.

  1. Esposizione allo stress di contenzione
    1. Assegna in modo casuale il ratto ai gruppi di controllo della gabbia, stress da contenzione acuta o stress da contenzione cronica.
    2. Determinare la durata dell'esposizione allo stress. Per i fattori di stress acuti, utilizzare una singola sessione della durata di 5 minuti fino a 12 ore confinata nell'apparecchio di contenzione. Per i fattori di stress cronici, assicurati che la sessione corrisponda alla durata del fattore di stress acuto, ma venga ripetuta quotidianamente per un minimo di 3 giorni e un massimo di 21 giorni.
      NOTA: Poiché i ratti non avranno accesso a cibo e acqua durante la condizione di contenzione, considerare se anche gli animali di controllo in gabbia dovrebbero non avere accesso a cibo e acqua.
    3. Per un tubo di ritenuta disponibile in commercio, seguire i passaggi descritti di seguito.
      NOTA: Sono disponibili in commercio tubi di ritenuta per ratti. Questi dispositivi hanno una varietà di design, tra cui filo metallico, contenitori e tubi in plastica/plexiglass con opzioni arrotondate e a fondo piatto. Ogni opzione è semplice da usare.
      1. Inserisci il ratto nel dispositivo, quindi aggiungi una spina regolata in base alle dimensioni del soggetto e bloccala in posizione. Quando viene posizionato nel tubo di ritenuta, assicurarsi che il ratto sia ben confinato per evitare giri dalla testa alla coda, ma possa respirare facilmente.
        NOTA: Questi dispositivi sono progettati per trattenere i ratti e non necessitano di modifiche per la respirazione. Questo studio utilizza il sistema di ritenuta della vena posteriore (Tabella dei materiali), che include ventose su una piattaforma sotto il tubo per fissare il dispositivo. Un ulteriore vantaggio di questo dispositivo è che la coda è accessibile all'esterno del dispositivo per il controllo del soggetto durante l'inserimento e la rimozione dal tubo o il prelievo di sangue dalla vena caudale durante la contenzione.
    4. In una sala prove separata dalla stabulazione degli animali e dai test comportamentali, posizionare gli animali assegnati alla contenzione nel tubo di ritenuta per la lunghezza designata della contenzione. Posizionare il tubo di ritenuta orizzontalmente su una superficie piana.
      NOTA: In condizioni di stress, i ratti producono anche vocalizzazioni ultrasoniche. Considerare se il disegno dello studio richiede l'isolamento acustico da altri soggetti soggetti limitati.
    5. Monitorare ogni animale durante lo stress da ritenuta almeno ogni 20 minuti. Determinare visivamente se l'animale sta mostrando risposte insolite (respirazione lenta, mancanza di movimento). Se osservato, rimuovere il ratto dal tubo di ritenuta, contattare un veterinario ed escludere il ratto dallo studio.
    6. Riporta il topo nella gabbia di casa e fornisci l'accesso a cibo e acqua.

3. Valutazioni dello stress

  1. Misurazione dell'attivazione dell'HPA
    1. Se appropriato, dopo l'esposizione allo stress di contenzione o la rimozione dalla gabbia domestica, decapitare rapidamente i soggetti per raccogliere il sangue del tronco in tubi eparinizzati.
    2. Isolare il plasma mediante centrifugazione e conservare i campioni di plasma a -80 °C. Analizzare il corticosterone nel sangue utilizzando un kit di test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
      NOTA: Sebbene il corticosterone sia spesso usato come lettura della gravità dell'esposizione allo stress, in particolare allo stress acuto, i livelli di corticosterone non sempre sono correlati ai cambiamenti comportamentali indotti dallo stress6. Inoltre, la risposta dell'asse HPA che regola il rilascio di corticosterone si abitua con l'esposizione ripetuta allo stesso fattore di stress18. In alternativa, l'ormone adrenocorticotropo (ACTH) può essere una misura più affidabile dell'intensità di un fattore di stress acuto4. Rimane elevato per circa un'ora dopo la cessazione dell'esposizione al fattore di stress, ma uno stress grave e prolungato (circa > 2 ore) può affaticare la sua produzione.
  2. Effetti comportamentali
    1. Se appropriato, dopo l'esposizione allo stress di contenzione o la rimozione dalla gabbia domestica, valutare le prestazioni comportamentali del roditore con il compito comportamentale appropriato.
      NOTA: Ulteriori informazioni riguardanti gli effetti della contenzione su vari modelli comportamentali sono disponibili nella sezione di discussione.
  3. Neurobiologia
    1. In alternativa o in aggiunta, valutare la funzione neurobiologica a seguito di contenzione, esposizione, stress o controllo. Un'ampia gamma di saggi può studiare gli effetti dello stress di contenimento su circuiti cellulari, sinaptici e circuitali. A seconda del test, impiantare un dispositivo di misurazione in vivo o prelevare il tessuto cerebrale per eseguire l'analisi selezionata.
      NOTA: Gli effetti dello stress sui cambiamenti specifici del tipo cellulare nella sintesi proteica e sulle modifiche epigenetiche sono stati accuratamente esaminati da McEwen e colleghi1. Queste modificazioni genetiche e proteiche inducono plasticità per alterare le connessioni sinaptiche e i circuiti. Per condurre questi studi, prelevare il tessuto cerebrale in seguito all'esposizione allo stress ed eseguire analisi genomiche, proteomiche, fisiologiche ex vivo e di altro tipo. In alternativa, valutare i cambiamenti neurobiologici attraverso misurazioni in vivo come la microdialisi, la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV), la fotometria delle fibre e altre. Questi approcci registrano il rilascio neurochimico e l'attivazione neuronale, sia in seguito all'esposizione allo stress di contenzione 2,19 che ora durante la contenzione 8,9,20. La cassetta degli attrezzi per valutare i meccanismi neurobiologici alla base degli effetti dello stress da contenzione si sta rapidamente espandendo, consentendo nuove intuizioni sulla complessità dello stress.

Risultati

In uno studio precedentemente pubblicato21, le procedure di stress di contenzione descritte in questo manoscritto sono state utilizzate per valutare l'impatto dello stress di contenzione sulla regolazione del cortisolo e della noradrenalina, rientrando nelle ampie possibilità di cambiamenti in neurobiologia indotti dallo stress menzionati nel protocollo 3.3. In questo studio, abbiamo utilizzato il protocollo sopra descritto per la contenzione dei topi. Ulteriori dettagli che esulano dall'ambito della moderazione di questo articolo, ad esempio il razionale della regione cerebrale, i parametri di stimolazione optogenetica o FSCV, possono essere trovati nel manoscritto di riferimento.

Abbiamo utilizzato topi transgenici maschi e femmine (DBH:Cre+/-::Ai32+/-) che esprimono la canalrodopsina selettivamente nei neuroni noradrenergici e abbiamo misurato il rilascio stimolato di noradrenalina nel nucleo del letto della stria terminale (BNST) con FSCV21 ex vivo. I topi sono stati trattenuti come descritto nel protocollo 1 in modo acuto (2 ore) e cronico (2 ore/giorno per 5 giorni) o nel controllo della gabbia domestica. Dopo l'esposizione, il sangue è stato raccolto da alcuni soggetti per l'analisi del corticosterone, come descritto nel protocollo 3.1. Immediatamente dopo lo stress acuto da contenzione, i topi hanno mostrato livelli elevati di corticosterone, ma la risposta è stata attenuata a seguito di stress ripetuti (vedi Figura 1). Altri topi sono stati utilizzati per valutare l'impatto dello stress da contenzione sul rilascio di noradrenalina. 24 ore dopo l'esposizione finale allo stress, il tessuto cerebrale è stato rapidamente raccolto e affettato per registrare il rilascio di noradrenalina nel BNST. È interessante notare che la contenzione acuta non ha avuto un impatto sul rilascio stimolato di noradrenalina, ma l'esposizione ripetuta allo stress ha causato un aumento significativo del rilascio stimolato di noradrenalina attraverso i parametri di stimolazione (vedi Figura 2). Questi risultati convergono con precedenti indagini sull'impatto dello stress di contenzione sul rilascio di noradrenalina nei ratti utilizzando gli approcci descritti nel protocollo 2 17,22.

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Figura 1: Corticosterone nel plasma dei controlli domiciliari in gabbia (naïve) e in seguito a stress di contenzione acuto (singolo) e cronico (ripetuto). Dopo una singola sessione di 2 ore di stress acuto da contenzione, i livelli plasmatici di corticosterone erano elevati rispetto ai soggetti naïve e ripetuti. I risultati sono espressi come media ± SEM. N = 5-6 topi per gruppo. **p < 0,05, ***p < 0,005. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Schmidt et al.21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il rilascio di noradrenalina stimolato optogeneticamente è aumentato in seguito a stress di contenzione cronico (ripetuto). Il giorno successivo all'esposizione finale allo stress, è stata eseguita una voltammetria ciclica a scansione rapida ex vivo per misurare il rilascio di noradrenalina stimolato optogeneticamente nel nucleo del letto della stria terminale dei topi. (A) Variazioni di frequenza (Hz) di 20 impulsi (20 P) le stimolazioni hanno rilasciato più noradrenalina nel gruppo a stress ripetuto. (B, C) Le variazioni nel numero di impulsi (2-20) a una frequenza di stimolazione di 5 Hz (B) o 10 Hz (C) indicavano un maggiore rilascio di noradrenalina nel gruppo a stress ripetuto. Medie ± SEM; n = 5−6 topi/gruppo che forniscono 7−8 fette/gruppo. *p < 0,05, **p < 0,05, ***p < 0,005 e ****p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Schmidt et al.21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Per studiare gli effetti dello stress sulle funzioni fisiologiche, neurobiologiche e comportamentali nei modelli di roditori, devono essere utilizzate le condizioni che producono stress per i roditori. Tra queste considerazioni ci sono le condizioni che producono risposte allo stress nel soggetto. La contenzione è una procedura convalidata per produrre risposte fisiologiche e comportamentali nei roditori che corrispondono agli effetti dello stress nell'uomo. Utilizzando una metodologia simile a questo protocollo, la contenzione è stata utilizzata per valutare una serie di risposte molecolari, cellulari, endocrine e fisiologiche correlate a modelli di disturbi psichiatrici, tra cui ansia, depressione, dolore e disturbo da uso di sostanze 1,19. Qui, i dati di uno studio pubblicato sono presentati come un esempio di contenzione nei roditori, ma gli effetti della contenzione si estendono oltre questo particolare esempio a una vasta gamma di misure dipendenti. La contenzione potrebbe essere selezionata per l'uso come fattore di stress perché è facile da eseguire nei topi e nei ratti, poco costosa da stabilire e adattabile per indurre vari livelli di risposte allo stress a seconda dei parametri utilizzati.

Rispetto ad altri approcci che inducono stress, la contenzione presenta alcune limitazioni da considerare durante il disegno dello studio 4,23. In particolare, lo stress da moderazione non sempre induce cambiamenti comportamentali osservati con altri fattori di stress fisico, come lo shock intermittente24. Queste incongruenze possono essere il risultato del vantaggio della moderazione che può verificarsi in una varietà di ambienti, mentre l'urto del piede è più limitato a una camera di prova dotata di pavimenti a griglia d'urto. I contesti di stress influenzano notevolmente gli effetti risultanti11. Inoltre, il confinamento all'interno di un tubo o dispositivo di ritenuta tradizionale è uno svantaggio perché limita l'accesso al soggetto durante la contenzione. Sono stati sviluppati dispositivi di ritenuta più recenti, ad esempio "REcording Signal TRansients ACCessible IN a Tube (RESTRAINT)", per superare questa limitazione e consentire il tethering per la raccolta di dati neurobiologici durante le sessioni di contenzione 8,9,20. Un altro approccio per affrontare questo ostacolo utilizza lo stress da immobilizzazione come tecnica simile alla contenzione: spesso, immobilizzazione e contenzione sono usati come sinonimi, ma con importanti differenze25. Lo stress da immobilizzazione comporta il fissaggio delle braccia, delle gambe e della testa di un animale a una superficie, mentre la contenzione comporta il posizionamento all'interno di un dispositivo restrittivo. In quanto tale, lo stress da immobilizzazione limita il movimento fornendo al contempo l'accesso al soggetto per la raccolta di sangue, liquido cerebrospinale, risposte pupillari o altri effetti fisiologici che possono essere di interesse per la ricerca sullo stress. Ulteriori fattori di stress che sono stati utilizzati per indurre stress nei roditori includono lo stress da freddo ambientale, la somministrazione di agenti farmacologici come il corticosterone o la yohimbina, esperienze etologicamente rilevanti di sconfitta sociale o esposizione all'odore dei predatori e stress multimodale come lo stress cronico imprevedibile (CUS). Queste modalità di sollecitazione alternative sono selezionate per l'uso a causa dei loro vantaggi nella modellazione di aspetti specifici della sollecitazione. Ad esempio, nonostante la contenzione sia un aspetto dei modelli CUS nei topi e nei ratti26, gli effetti della CUS possono essere distinti da quelli prodotti da un'esposizione equivalente allo stress cronico da contenzione27,28. La prevedibilità della contenzione ripetuta riduce la risposta a futuri episodi di contenzione, il che limita l'efficacia dello stress di contenzione omotipico. In alternativa, il CUS e altri modelli di stress eterotipici ruotano i fattori di stress o i contesti per ridurre al minimo l'assuefazione11,18. Questi modelli di stress imprevedibili possono modellare meglio gli aspetti delle condizioni psichiatriche umane per incapsulare completamente la perdita di controllo e di aspettativa. Un altro svantaggio della contenzione che altre modalità di stress sono in grado di affrontare meglio è il contributo sociale alla suscettibilità allo stress e al tamponamento dello stress 29,30,31. I roditori e gli esseri umani sono animali sociali con relazioni e gerarchie conspecifiche. Sebbene lo stress da contenzione non incorpori la socializzazione, i fattori di stress psicosociale come lo stress da sconfitta sociale forniscono un fattore di stress etologicamente rilevante per i roditori 32,33,34.

Nell'uso dello stress di contenzione, l'intensità e la ripetizione della somministrazione è un parametro che potrebbe essere manipolato5. Per creare una sollecitazione di ritenuta più robusta, il disegno dello studio può richiedere un periodo di tempo più lungo nel dispositivo di ritenuta. Da un minimo di 5 minuti a un massimo di 12 ore sono parametri possibili per sessioni di contenzione acute o prolungate, rispettivamente35,36. Una volta determinata la durata dell'esposizione alla contenzione, la ripetizione del fattore di stress può anche essere un fattore nell'indurre vari livelli di stress35,37. Va notato che lo stress ripetuto da contenzione non significa necessariamente un aumento degli effetti osservati. Spesso lo stress da contenzione ripetuto abitua o riduce in altro modo le risposte allo stress18. Nei dati qui presentati, abbiamo osservato l'assuefazione con la risposta del corticosterone allo stress di contenzione ripetuta, mentre allo stesso tempo, abbiamo misurato le differenze nel rilascio stimolato di noradrenalina solo nel gruppo di esposizione allo stress ripetuto. Pertanto, gli effetti della contenzione ripetuta devono essere attentamente studiati prima di determinare gli effetti dell'assuefazione35.

Inoltre, devono essere considerate le conseguenze delle condizioni di stabulazione utilizzate negli studi che utilizzano lo stress di contenzione. L'interazione con i conspecifici stressati influisce sulle risposte allo stress nei roditori 30,38,39. Pertanto, per mantenere risposte coerenti tra i gruppi sperimentali, i soggetti dovrebbero essere alloggiati individualmente o alloggiati in gruppo con tutti i compagni di gabbia che sperimentano la stessa condizione di stress37. Criticamente, uno svantaggio di questo approccio all'isolamento sociale di tutti i soggetti è che anche l'isolamento sociale è un fattore di stress40,41. Tuttavia, indipendentemente dalle condizioni abitative, l'esposizione allo stress dovrebbe avvenire in isolamento, se possibile, per evitare che il tamponamento sociale dello stress influisca sulle misurazioni dei risultati30. Insieme a queste condizioni di alloggiamento, la tempistica dell'esposizione allo stress in relazione ai cicli di luce ambientale dovrebbe essere considerata14,15. Come alcuni studi notano37, i livelli di corticosteroidi seguono i ritmi circadiani, quindi la somministrazione di fattori di stress in momenti diversi del ciclo di luce può produrre effetti incoerenti. Pertanto, è essenziale stabilire e mantenere un orario di inizio uniforme per la ritenuta. Ad esempio, un articolo che esamina gli effetti dello stress da esercizio sul controllo circadiano del corticosterone mostra che nei topi di controllo il corticosterone raggiunge il picco alla fine del ciclo di luce, ma nei topi stressati, il corticosterone rimane elevato senza un picco stabile13. Alla luce di questi risultati, si raccomanda di stressare i roditori all'inizio del ciclo di luce per produrre gli effetti maggiori.

Al di là dei parametri delle condizioni di contenzione, anche le caratteristiche del soggetto animale sono state importanti da considerare negli studi che utilizzano fattori di stress di contenzione. Ad esempio, numerosi studi hanno riportato differenze di sesso utilizzando lo stress di contenzione 12,35,37,42,43,44. Comprendere i meccanismi alla base di queste differenze merita di essere studiato e potrebbe portare a risultati migliori per trattamenti equi quando le persone sono stressate. Forse le femmine e i maschi sperimentano ed elaborano i fattori di stress in modo diverso, il che porta all'aumento dell'ansia e della depressione nelle donne44. Ad esempio, lo stress da moderazione riduce le prestazioni di apprendimento nei maschi, ma aumenta le prestazioni di apprendimento nelle femmine45. Storicamente, gli studi sullo stress da contenzione nei roditori hanno limitato i loro soggetti ai maschi, ma andando avanti dovremmo progettare esperimenti per includere entrambi i sessi. Un'altra caratteristica del soggetto da considerare quando si progettano esperimenti che utilizzano fattori di stress di contenzione (e altri) in specie di topo o ratto è il ceppo 46,47,48,49,50,51. Gli effetti della deformazione sono stati osservati in una serie di paradigmi, con alcuni ceppi che mostrano risposte esacerbate allo stress di contenzione. Infine, l'età del soggetto dovrebbe essere considerata quando si utilizza lo stress da contenzione. Dall'esposizione prenatale allo stress limitando una madre incinta alla contenzione nelle popolazioni anziane, lo stress da contenzione può essere adattato a qualsiasi punto temporale. Le differenze nella risposta allo stress sono state mostrate nel corso della vita 45,52,53,54,55,56. Oltre a richiedere diversi dispositivi di contenzione per adattarsi ai cambiamenti delle dimensioni corporee con l'avanzare dell'età, le esperienze di stress legate all'età dovrebbero essere prese in considerazione quando si utilizzano fattori di stress di contenzione.

La selezione dell'appropriata misurazione dell'esito, sia che si tratti di un compito comportamentale descritto in 3.2 o di una variabile neurobiologica descritta in 3.3, richiede considerazione. Per prima cosa, è stato dimostrato che l'esposizione acuta e lieve allo stress migliora le prestazioni in alcuni compiti di apprendimento, ma l'esposizione allo stress intenso o cronico compromette le prestazioni nei compiti di apprendimento e memoria57. Si ritiene che questi cambiamenti nelle prestazioni cognitive siano regolati dalla disregolazione del circuito tra la corteccia prefrontale, l'amigdala e l'ippocampo. Tuttavia, gli effetti dello stress da contenzione sulla flessibilità cognitiva sono più contrastanti, con risultati incoerenti che ostacolano un quadro chiaro di come i vari parametri di contenzione alterano l'apprendimento inverso o lo spostamento degli insiemi58. Per quanto riguarda gli effetti comportamentali dei farmaci, è stato dimostrato che lo stress da contenzione, come altri fattori di stress, aumenta i comportamenti correlati al disturbo da uso di sostanze in un certo numero di classi di farmaci59. Tuttavia, questi effetti sono in qualche modo selettivi in quanto lo stress da contenzione non è segnalato per guidare la ricerca di droghe nei modelli di ricaduta di condizionamento operante, ma aumenta l'apprendimento associativo degli effetti delle droghe misurati da compiti di preferenza di luogo condizionati, tra cui il reintegro60. Si ritiene che questa discrepanza si verifichi perché i dispositivi di ritenuta creano un contesto separato rispetto alle camere di condizionamento operative, mentre lo stress da scossa del piede può verificarsi nell'ambiente operativo. Per superare questa limitazione, l'abbinamento dell'esposizione allo stress con i segnali che possono essere presentati durante le sessioni di autosomministrazione operante ha dimostrato aumenti indotti dallo stress nell'assunzione di farmaci e nella ricerca di farmaci61. Gli effetti della contenzione cronica sui comportamenti correlati ai farmaci sono meno ben caratterizzati. Considerando modelli di disturbi affettivi come l'ansia e la depressione, sia nell'uomo che nei modelli animali, l'esposizione allo stress aumenta le misure di ansia. Nei roditori, le valutazioni dell'ansia da stress da contenzione includono le risposte alla tigmotassi nell'apparato in campo aperto misurate tracciando la risposta locomotoria dell'animale lungo le pareti dell'arena rispetto al centro. Gli animali che mostrano comportamenti ansiosi dopo la contenzione trascorreranno più tempo vicino ai lati e avranno meno incroci centrali. Un altro approccio per misurare l'ansia è il labirinto plus elevato. Questo compito utilizza un apparato a forma di croce sollevato a circa 3 piedi dal pavimento. Due bracci dell'apparato includono barriere murarie; Due braccia hanno i lati aperti. Gli animali che mostrano comportamenti ansiosi trascorreranno più tempo nelle braccia chiuse rispetto alle braccia aperte62,63. I comportamenti simili alla depressione vengono valutati attraverso il compito di nuoto forzato in cui i roditori vengono posti in un cilindro d'acqua e misurati per le risposte di lotta rispetto alle risposte galleggianti64. Se la cessazione della lotta per fuggire rappresenti veramente un comportamento simile alla depressione è stato messo in discussione65, ma il compito ha dimostrato utilità come schermo per i farmaci antidepressivi. I comportamenti simili alla depressione possono anche essere valutati attraverso riduzioni indotte dallo stress della preferenza per il saccarosio66. Questi cambiamenti nel consumo di liquidi dolci sono presi come una valutazione degli aspetti anedonici della depressione clinica.

In sintesi, la contenzione nei topi e nei ratti è una procedura convalidata per produrre risposte allo stress e all'ansia negli studi di fisiologia, genetica, immunologia e neuroscienze. Rispetto ad altri approcci che inducono stress, la contenzione è poco costosa, facile da eseguire, utile per modellare aspetti dei disturbi umani tra cui ansia, depressione, disturbo da uso di sostanze e disturbo da stress post-traumatico e può essere adattata con un'ampia gamma di parametri. Per questi motivi, lo stress da contenzione continua ad essere un metodo utile per determinare l'impatto dello stress nei roditori.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi da segnalare.

Ringraziamenti

Apprezzo il feedback editoriale fornito da Holly Rahurahu e Sam Shaffer.

Materiali

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50 mL Tappo a vite per uso generico Tubo conicoGlobe Scientific6288
Pipetta monouso BacinellaFisher Scientific13-681-500
Kit ELISA per saggi CorticosteroneArborK014-H
Tubo di contenimento TailveinerBraintree ScientificRTV

Riferimenti

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