Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster

L'imaging dal vivo dei processi biologici è fondamentale per ottenere prove sperimentali dirette. La combinazione di microscopia confocale avanzata e l'ottimizzazione delle metodologie consente l'esplorazione di molteplici eventi biologici con elevata precisione. L'ottimizzazione delle fasi di protocolli come la manipolazione e la dissezione dei tessuti, la preparazione e la conservazione dei campioni e le impostazioni di acquisizione al microscopio è fondamentale per massimizzare l'affidabilità e la robustezza dei risultati ottenuti. Qui, presentiamo un protocollo per monitorare i campioni per l'imaging esteso, che è particolarmente focalizzato sulle ovaie di Drosophila melanogaster. L'ovaio di Drosophila melanogaster è un eccellente sistema modello per l'analisi di un'ampia gamma di processi di sviluppo. Tra i tanti, questo organo riproduttivo del moscerino della frutta Drosophila melanogaster contiene una nicchia di cellule staminali adulte molto ben definita. Questa nicchia GSC sostiene lo sviluppo dei gameti femminili durante l'età adulta. Le ovaie di Drosophila sono composte da circa 18 ovarioli, dove si sviluppano le camere delle uova nel germario. Nella punta di ogni germario, 2-4 GSC sono mantenute in una nicchia cellulare somatica formata principalmente da un filamento terminale di 8-10 cellule, una rosetta di 5-8 cellule di tappo e 2-3 cellule di scorta anteriori (Figura 1A). Questa nicchia somatica fornisce alle GSC segnali essenziali e supporto fisico per mantenere la loro staminalità, controllare la proliferazione e prevenire la differenziazione^1,2,3,4,5.

Le GSC normalmente si dividono in modo asimmetrico per generare una nuova cellula staminale che mantiene il contatto con la nicchia somatica e una cellula figlia, il cistoblasto (CB), che perde il contatto diretto con le cellule somatiche e si differenzia. Le GSC e i CB contengono un organello citoplasmatico altamente dinamico, lo spettrosoma, la cui funzione principale è il corretto orientamento del fuso mitotico durante la mitosi⁶. Il CB si divide 4 volte con citocinesi incompleta per sviluppare cisti a 16 cellule, dove una delle cellule germinali si specifica nell'ovocita e le altre 15 cellule diventano cellule nutrici. Lo spettrosoma CB cresce in una struttura ramificata chiamata fusoma che collega le cellule germinali interconnesse a 16 cellule. Lo spettrosoma è arricchito in piccole vescicole e proteine scheletriche come la serina-treonina chinasi Par-1 e il componente di membrana Hu-li tai shao (Hts)⁷. Durante il ciclo cellulare GSC, lo spettrosoma cresce con l'aggiunta di nuovo materiale e cambia la sua forma, consentendo l'identificazione delle fasi G1, S, G2 e M (Figura 1B)^8,9.

Abbiamo recentemente implementato un metodo di coltura ex vivo del germarium di Drosophila che consente l'imaging di GSC vive per un massimo di 16 ore. Poiché queste cellule si dividono in media una volta ogni 15,5 ore⁸, questo metodo consente di filmare grandi porzioni del ciclo cellulare GSC. Pertanto, in combinazione con altri strumenti, il nostro metodo di coltura ha permesso la descrizione della morfologia dello spettrosoma durante il ciclo cellulare GSC e l'analisi della durata delle diverse fasi del ciclo cellulare in vivo⁸ (Figura 1C). Qui, forniamo un protocollo dettagliato di questo metodo di imaging dal vivo esteso supportato da un video guidato passo dopo passo che descrive la metodologia (Figura 2).

NOTA: Il passaggio 1.4 deve essere fatto con almeno 2 giorni di anticipo. I passaggi 2.1 e 2.2 possono essere eseguiti con 1 giorno di anticipo.

1. Configurazione pre-sperimentale I

1. Preparare 100 μL di aliquote di miscela di antibiotici streptomicina/penicillina (10.000 U/mL di penicilina e 10 mg/mL di streptomicina) e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
2. Preparare 15 mL delle seguenti soluzioni utilizzando acqua pura sterilizzata in autoclave, conservarle a 4 °C e utilizzarle entro un mese: Bicarbonato di sodio (NaHCO₃) 0,1 M pH 8,0 e 0,1% Tween 20.
3. Preparare il seguente terreno di coltura e la soluzione in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Utilizzare puntali e tubi filtranti sterilizzati.
   1. Preparare 2 mL di aliquote di siero fetale bovino (FBS) non diluito e conservare a -20 °C fino all'uso in condizioni asettiche.
   2. Preparare il terreno Drosophila di Schneider integrato con il 15% di FBS e lo 0,6% di mix di antibiotici streptomicina/penicillina. Preparare 7 mL di aliquote e conservare a 4 °C. Un'aliquota è sufficiente per due piastre MatTek (vedere paragrafo 2).
      1. Preparare la soluzione di Ringer (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 35,5 mM Saccarosio, 5 mM Hepes in acqua pura autoclavata; pH 6,9). Preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
4. Raccogliere mosche di 1-2 giorni che esprimono costitutivamente e ubiquitariamente la proteina Par-1 fusa a GFP (linea poli-Ubiquitina-mGFP6::p ar-1) in un nuovo tubo con cibo per mosche integrato con lievito in polvere. Coltivarli per 2 giorni a 25 °C in un'incubatrice prima della dissezione.
   NOTA: Questo passaggio può essere eseguito con qualsiasi reporter di interesse con tag fluorescenti.

2. Rivestimento e preparazione della lastra di fondo in vetro

1. Posizionare una goccia da 3 μL di uno specifico adesivo Cell-Tak (d'ora in poi denominato adesivo per cellule e tessuti) al centro del vetrino coprioggetti di una lastra rivestita di poli-D-lisina da 35 mm (piatto con fondo in vetro, vedere Tabella dei materiali) senza stendere manualmente. Utilizzare puntali sterili.
   NOTA: L'adesivo per cellule e tessuti deve essere conservato a 4 °C. Nel caso di esperimenti con due condizioni genetiche (tipicamente, condizioni di controllo e condizioni mutanti), posizionare due gocce individuali e ben separate di adesivo nella stessa lastra di fondo di vetro. Ciò garantirà che entrambi i background genetici siano ripresi nelle stesse condizioni.
2. Subito dopo, aggiungere con cautela un volume uguale (3 μl in questa configurazione del protocollo) di 0,1 M NaHCO₃ pH 8,0 nella goccia adesiva da 3 μl come raccomandato dal produttore e miscelare mediante pipettaggio.
3. Per una completa evaporazione, incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti e poi conservare a 4 °C per una notte per essere utilizzata il giorno successivo. In alternativa, incubare la piastra preparata a 37 °C per 25 minuti fino alla completa evaporazione e procedere direttamente alla fase successiva. In entrambi i casi, mantenere la piastra con il suo coperchio. Utilizzare punte sterili.
4. Lasciare che il piatto con fondo in vetro preparato raggiunga RT posizionandolo sul banco per 15-20 minuti prima dell'uso.
5. Lavare accuratamente 3 volte il piatto preparato. Evitare di toccare e disturbare gli strati adesivi. Ad ogni lavaggio, aggiungere 6 μL di acqua pura autoclavata e quindi rimuovere l'acqua utilizzando una punta pulita per ciascuno dei tre lavaggi per eliminare i residui della soluzione di NaHCO₃.
6. Consentire la completa evaporazione dell'acqua posizionando la piastra pulita e preparata a RT mentre seziona per 5-10 minuti con il coperchio per evitare particelle di polvere.

3. Dissezione ovarica di Drosophila e isolamento e montaggio dell'ovaio

NOTA: La dissezione ovarica viene eseguita nella soluzione di Ringer (invece del terreno di Schneider) senza FBS per prevenire la presenza di proteine che potrebbero interferire con l'adesione del tessuto del campione all'adesivo.

1. Prima di iniziare, pulire una capsula di dissezione a tre pozzetti, una pinza e gli aghi di dissezione con etanolo al 70%.
2. Aggiungere un volume sufficiente (~200 μL) della soluzione di Ringer in ciascuno dei tre pozzetti.
3. Sezionare le ovaie di 5 femmine alimentate con lievito in 200 μL di soluzione di Ringer nel primo pozzetto con l'aiuto di due paia di pinze seguendo le procedure standard^10,11. Afferra la femmina di Drosophila all'intersezione tra il torace e l'addome con una delle pinze. Quindi, strappare delicatamente la cuticola nella parte posteriore dell'addome e tirare la cuticola dell'addome fino a quando le due ovaie non sono esposte.
4. Trasferire le ovaie sezionate nel secondo pozzetto per ridurre la contaminazione con resti di altri tessuti o detriti derivanti dalla dissezione.
5. Rimuovere la guaina muscolare di 15-20 ovarioli con l'aiuto di uno stereomicroscopio (zoom 8X-13,5X) con illuminazione a diodi emettitori di luce (LED) e pinze a punta fine. Usa un paio di pinze per ancorare l'intero corpo dell'ovaio e usa il secondo per afferrare dolcemente una camera dell'uovo in fase avanzata e allungare delicatamente fino a quando il muscolo non si rompe e rimane indietro.
   NOTA: È essenziale evitare danni alla germaria semplicemente riducendo il contatto con questa parte delle ovaie. Rimuovere le camere delle uova più vecchie degli stadi 8-9.
6. Trasferire uno ad uno i 15-20 ovarioli privi di guaina muscolare utilizzando la pinza al terzo pozzetto contenente 200 μL di terreno di Ringer.
7. Pre-inumidire un puntale da 20-200 μl con lo 0,1% di Tween 20 mediante pipettaggio. In questo modo si evita l'adesione degli ovarioli alle pareti plastiche della punta.
8. Trasferire 6 μl di soluzione di Ringer contenente gli ovarioli privi di guaina muscolare utilizzando una punta pre-bagnata sulla piastra adesiva preparata (mantenuta a RT).
   NOTA: Evitare ogni contatto tra la punta e lo strato adesivo per evitare il distacco della germaria dopo la deposizione dell'ovariolo (passaggio successivo). Circa il 30% dei germari non aderisce come previsto.
9. Per garantire che gli ovarioli trasferiti aderiscano alla superficie adesiva, premerli con cautela fino al fondo della goccia di Ringer fino a quando non entrano in contatto con la superficie adesiva utilizzando un ago da dissezione o una pinza.
   NOTA: Non cercare di riorganizzare gli ovarioli una volta che si sono depositati.
10. Riempire accuratamente la piastra MatTek con 3 mL di terreno di Schneider integrato con il 15% di FBS e lo 0,6% di miscela antibiotica streptomicina/penicillina (fase 1.3). Per evitare il distacco degli ovarioli, aggiungere lentamente 1 mL alla volta attorno al bordo esterno della piastra.
11. Trasportare la piastra contenente gli ovarioli privi di guaina muscolare su una superficie piana fino alla stazione del microscopio.

4. Imaging dal vivo con un microscopio confocale

1. Posizionare la piastra sull'obiettivo 63x di un microscopio a disco rotante o di un microscopio confocale (è possibile utilizzare un'attrezzatura simile) e mettere a fuoco il campione. Seleziona il piano z centrale per ogni germario.
2. Configura i seguenti parametri sperimentali: tipo di acquisizione: time-lapse 3D, regola la potenza del laser di 70/100, lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm, intervallo dello z-stack: 30 μm e distanza tra gli Z-stack: 1,2 μm, durata: 17 h, intervallo tra i punti temporali: ogni 10 minuti.
3. Se disponibile, utilizzando un'opzione multiposizione, ridefinire le coordinate XY dei campioni e selezionare un piano Z al centro di ciascun germario, poiché le pile Z saranno centrate in questa posizione. Inizia l'acquisizione.
   NOTA: Poiché la larghezza normale di un germarium è di 30 μm, ogni Z-stack sarà composto da ~25-27 sezioni. A seconda della confocale, è possibile visualizzare almeno 25 germarie entro intervalli di 10 minuti. Normalmente, vengono utilizzati obiettivi 40x/1,30 NA o 63x/1,40 NA a immersione in olio, corretti per planapo.
4. Analizza le immagini nel tempo e sull'asse Z per visualizzare cambiamenti specifici nella morfologia dello spettrosoma utilizzando il software Imaris o ImageJ (Fiji) ^12,13. Vengono visualizzati i tempi specifici della loro osservazione (Figura 1B'). Per montare i filmati, selezionare manualmente il miglior piano Z in ogni momento.

Con questo esteso protocollo di imaging dal vivo, possiamo registrare la mitosi asimmetrica delle femmine di GSC all'interno della loro nicchia senza apparenti disturbi biologici. Per fare ciò, utilizziamo germaria che esprime ubiquitariamente la proteina GFP::P ar-1, che discrimina tra cinque distinte morfologie spettrosomiche attraverso il ciclo cellulare GSC: Round, Plug, Bar, Fusing e Exclamation point (Figure 1B,C). In una descrizione più dettagliata, abbiamo osservato che il forte segnale GFP:Par1 dello spettrosoma Round-G2 (Figura 1C, pannello a) è drasticamente ridotto durante le fasi G2-M-G1. È importante sottolineare che l'uso di questa linea transgenica consente anche la visualizzazione dell'ingresso delle GSC nella mitosi poiché la maggior parte della GFP::P ar-1 lascia lo spettrosoma e riempie il citoplasma durante la profase precoce (Figura 1C, pannello b). Inoltre, la GFP::P ar-1 citoplasmatica consente la rilevazione precisa della permeazione dell'involucro nucleare (NEP) step8,14, poiché il segnale GFP entra nel nucleoplasma in questo preciso momento (Figura 1C, pannello b). Dopo la mitosi e la riformazione dell'inviluppo nucleare, il segnale GFP:Par1 viene gradualmente recuperato nello spettrosoma Round-G1 (Figura 1C, pannello c). L'aggiunta de novo del materiale GFP:Par1 allo spettrosoma Round-G1 promuove la formazione delle morfologie degli spettrosomi Plug (Figure 1C, pannello d), Bar (Figure 1C, pannello e) e Fusing (Figura 1C, pannello f). Infine, il marcatore GFP:Par1 permette la visualizzazione dello spettrosoma del punto esclamativo (Figura 1C, pannello e), come conseguenza della formazione del midbody, una struttura proteica ricca di microtubuli formatasi durante la citochinesi in aggiunta all'anello contrattile di actomiosina.

Figura 1: Dinamica del ciclo spettrosomico nelle GSC vive. (A) Diagramma schematico della nicchia delle cellule staminali germinali (GSC) composta da cellule del filamento terminale (TFC, in blu), la cellula di transizione (TC, in rosso), le cellule cap (CpCs, in viola) e le cellule di scorta (EC, in grigio). Le GSC (in giallo) contengono un caratteristico organello chiamato spettrosoma (in verde). Durante il ciclo cellulare delle GSC, lo spettrosoma passa da una forma sferica a una allungata e poi di nuovo a una sfera. La GSC si divide per generare una cellula figlia, il cistoblasto (CB, in arancione), che perde il contatto con la nicchia e che contiene anche uno spettrosoma sferico. Il CB divide quattro tempi consecutivi e sincroni con citocinesi incompleta per produrre cisti a 2, 4, 8 e 16 cellule interconnesse dal fusoma. (B) Diagramma che rappresenta le diverse forme spettrosomiche generate durante il ciclo cellulare. (B') Tempo previsto per l'osservazione delle morfologie spettrosomiche. (C) Immagini temporali di un filmato di 17 ore che mostra il segnale GFP::P ar-1 nella nicchia GSC. Il tempo 0 min (0') corrisponde alla permeabilizzazione dell'involucro nucleare (NEP). Il pannello illustra cinque diverse morfologie dello spettrosoma (punte di freccia bianche e verdi): Rotondo (sia in G2 che in G1; pannello a e c), Tappo (pannello d), Bar (pannello e), Fusione (pannello f) e Punto esclamativo (pannello e, punta di freccia verde). Quest'ultima morfologia spettrosomica appartiene alla seconda GSC (linea tratteggiata verde) mostrata a 70'. Le GSC sono delimitate da linee tratteggiate gialle e verdi. Gli OC risultanti dopo la divisione GSC sono delimitati da linee tratteggiate arancioni. Barra della scala: 10 μm. I pannelli A e B sono stati adattati con il permesso di Villa-Fombuena et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Metodo di montaggio dell'adesivo Cell-Tak per l'imaging dal vivo esteso di Drosophila germaria. (1) Processo passo dopo passo per preparare il piatto con fondo di vetro con l'adesivo. (2) Panoramica della dissezione ovarica di Drosophila nella soluzione di Ringer e nella preparazione individuale di ovariolo privo di muscoli. (3) Trasferire gli ovarioli senza la guaina muscolare nel piatto con fondo di vetro. (4) Riempire la pirofila con il mezzo di Schneider integrato. (5) Immagine della germaria per 10-16 ore utilizzando un microscopio confocale invertito. Questa figura è stata adattata con il permesso di Villa-Fombuena et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.