Quantificazione non invasiva del muscolo scheletrico in piccoli animali mediante microtomografia computerizzata

Summary

Questo protocollo utilizza la micro-tomografia computerizzata per consentire la quantificazione economica della massa magra, compresi il muscolo scheletrico e il tessuto viscerale, il tessuto adiposo e il tessuto scheletrico nei piccoli animali. Distingue tra tessuto magro e adiposo, il che offre vantaggi significativi per la ricerca biomedica, in particolare nella ricerca traslazionale nei piccoli animali.

Abstract

Le dimensioni, la massa e la composizione del muscolo scheletrico sono proprietà fondamentali per lo studio delle malattie metaboliche e muscolari, in quanto hanno un impatto diretto sulla comprensione della progressione della malattia e sui risultati del trattamento. Quantificare la massa magra, adiposa e scheletrica di un animale vivo è importante negli studi metabolici, fisiologici, farmacologici e geroscientifici. Tuttavia, ottenere misurazioni accurate della composizione corporea, in particolare della massa magra, rimane difficile a causa dei limiti intrinseci delle tecniche di valutazione convenzionali. La micro-tomografia computerizzata (micro-CT) è una tecnica radiologica non invasiva che consente la visualizzazione ad alta risoluzione delle strutture interne in piccoli modelli animali. Un metodo micro-CT standardizzato può migliorare significativamente la ricerca traslazionale con risultati più affidabili e di impatto, in particolare durante gli studi sull'invecchiamento o in momenti diversi all'interno dello stesso animale. Nonostante il suo potenziale, la mancanza di standardizzazione nei metodi di acquisizione e analisi delle immagini ostacola in modo significativo la comparabilità dei risultati tra i diversi studi. In questo articolo, presentiamo un protocollo completo e dettagliato a basso costo per l'analisi della massa magra utilizzando la micro-CT per affrontare queste sfide e promuovere la coerenza nella ricerca che coinvolge modelli di piccoli animali.

Introduction

Le dimensioni, la massa e la composizione sono proprietà cruciali del muscolo scheletrico per lo studio dei meccanismi delle malattie muscolari e metaboliche¹. Sarcopenia, cachessia, atrofia e miopatie condividono fenotipi comuni: riduzione della massa, alterazione della composizione e compromissione della funzione muscolare 2,3,4,5. Tuttavia, quantificare la composizione corporea in un animale vivente rimane molto complesso e tecnicamente impegnativo⁶.

Le metodologie principali per l'imaging in vivo e l'analisi della composizione corporea sono l'assorbimetria a raggi X a doppia energia (DXA), la tomografia computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MRI). Questi metodi sono impiegati principalmente per lo screening e il monitoraggio delle malattie che portano alla riduzione della massa magra 7,8,9,10,11. DXA è il gold standard per l'analisi della composizione corporea grazie al suo costo inferiore. Tuttavia, la DXA presenta uno svantaggio significativo rispetto alla risonanza magnetica e alla TC: la sua incapacità di risolvere spazialmente il tessuto muscolare e adiposo¹.

La risonanza magnetica utilizza forti campi magnetici e onde radio per generare immagini dettagliate delle strutture interne del corpo¹². Uno dei suoi principali vantaggi rispetto alla TC è la sua risoluzione di contrasto superiore, che consente un'eccellente differenziazione tra diversi tipi di tessuti molli ^1,13,14. A differenza della TC, la risonanza magnetica non utilizza radiazioni ionizzanti, il che la rende più sicura per l'uso ripetuto^15,16. Tuttavia, la risonanza magnetica è più costosa e meno accessibile, con tempi di scansione più lunghi e costi di manutenzione più elevati^13,17. Pertanto, gli strumenti di risonanza magnetica adattati per l'analisi dei piccoli animali non sono solitamente disponibili.

La micro-CT è simile alla TC convenzionale ma è adattata per piccole strutture e ricerca biomedica¹⁸. La micro-CT è una tecnica di valutazione radiologica avanzata e non invasiva che consente la visualizzazione dettagliata delle strutture interne in modelli di piccoli animali. La micro-CT utilizza i raggi X per creare immagini dettagliate delle strutture interne del corpo, basandosi sull'attenuazione differenziale dei raggi X da parte di vari tipi di tessuto. Durante una scansione micro-CT, il topo giace su un tavolo che si muove lentamente attraverso un portale circolare. All'interno del gantry, un tubo a raggi X ruota attorno al topo, emettendo raggi X da varie angolazioni. I rilevatori sul lato opposto catturano questi raggi X dopo che hanno attraversato il corpo¹⁸.

Il software dello scanner micro-CT elabora i dati da queste molteplici angolazioni per ricostruire immagini bidimensionali in sezione trasversale (fette) del corpo. Attraverso la ricostruzione, queste fette possono essere combinate per rappresentare l'anatomia interna in modo completo¹⁹. Le immagini prodotte dalle scansioni micro-CT si basano sui vari gradi di attenuazione dei raggi X da parte dei diversi tessuti all'interno del corpo. Questa attenuazione è quantificata utilizzando le unità di Hounsfield (HU), una scala che standardizza la radiodensità^20,21. La scala HU è fondamentale per la segmentazione, in quanto ogni struttura ha un valore leggermente diverso.

Nel presente articolo, abbiamo utilizzato i valori HU per distinguere con precisione tra osso, tessuto magro e tessuto adiposo¹. Facendo riferimento agli intervalli HU stabiliti, abbiamo assicurato un'analisi e un confronto precisi della composizione corporea. In questo articolo, dimostriamo come acquisire immagini utilizzando la micro-CT e la sua applicazione nella visualizzazione e nella quantificazione della massa magra, grassa e scheletrica.

Protocol

Tutti i metodi sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Le scansioni sono state eseguite su topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 22 mesi.

1. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 2% in una miscela di ossigeno erogato tramite vaporizzazione. Usa un vaporizzatore di precisione sia per l'induzione che per il mantenimento con una miscela di ossigeno al 100% utilizzando un vaporizzatore di precisione.
2. Posizionare l'animale anestetizzato supino sulla scansione micro-CT utilizzando un letto per mouse. Fissare il mouse con del nastro adesivo per ridurre al minimo il movimento durante la scansione, quindi inserirlo nel gantry.
3. Durante l'esperimento, che dura circa 10 minuti, assicurarsi che l'animale indossi una maschera per tenerlo sotto il piano anestetico mentre riceve la dose di mantenimento secondo necessità.

2. Acquisizione e ricostruzione delle immagini

1. Acquisisci scansioni micro-CT corporee utilizzando un sistema di imaging preclinico ad alta risoluzione. Cattura un totale di 1.024 proiezioni con un tempo di esposizione di 470 ms ciascuna, utilizzando una rotazione in modalità volo a una tensione di 60 kV e una corrente di 480 μA. Impostare il sistema su un ingrandimento di 1,25, con un campo visivo (FOV) di 94,72 mm per un tempo di acquisizione totale di 8,02 minuti. Acquisisci immagini con un binning di 1 x 1, con una risoluzione di 2.368 x 2.240 pixel.
   NOTA: L'attrezzatura utilizzata in questo manoscritto per le immagini micro-CT presenta limitazioni nell'ottenimento di immagini della testa a causa della sovrapposizione con la maschera anestetica. Inoltre, l'intera lunghezza della coda non viene catturata. Pertanto, abbiamo escluso l'analisi della testa e della coda (vedi sezione 3).
2. Eseguire una scansione con gli stessi parametri su un fantoccio cilindrico in acrilico (diametro: 2,5 cm, lunghezza: 11,5 cm) riempito a metà con acqua distillata per determinare l'HU per aria e acqua. Al termine delle acquisizioni, ricostruire le immagini utilizzando il software di acquisizione con impostazioni ottimizzate per la riduzione del rumore e l'algoritmo di retroproiezione filtrata (FBP). Ricostruisci in batch immagini di animali e fantocci utilizzando una dimensione del voxel isotropo di 147 μm e una matrice di 640.
3. Estrarre l'HU dell'aria e dell'acqua dal fantoccio (dati grezzi) utilizzando il software di riferimento. Converti le immagini in file DICOM e correggi i valori HU.

3. Analisi delle immagini

1. Caricamento di un file
   NOTA: La micro-CT è una tecnica che cattura le immagini temporalmente e spazialmente, generando una sequenza di immagini. Pertanto, è necessario aprire l'intera cartella piuttosto che una singola immagine.
   1. Nell'area in alto a sinistra dell'interfaccia, trova il menu 3D Slicer , evidenziato in un colore grigio-blu. Fare clic su Aggiungi dati ().
   2. Quando viene visualizzata una finestra con due opzioni, selezionare la prima opzione: Scegli directory da aggiungere.
   3. Passare alla cartella contenente la serie di immagini DICOM degli animali di destinazione e fare clic su di essa. Questa azione aprirà la cartella all'interno del software, consentendo di visualizzare tutte le immagini contemporaneamente.
   4. Osserva le immagini visualizzate su tre schermi. Ogni schermo rappresenta un diverso piano anatomico: coronale, sagittale e trasversale, identificato rispettivamente dai colori verde, giallo e rosso.
2. Segmentazione
   1. Individua l'Editor segmenti () nella scheda superiore (Moduli) e fai clic su di esso.
   2. Fare clic sul pulsante verde + Aggiungi per creare segmenti, definendo l'intervallo HU.
   3. Crea segmenti per osso, tessuto magro e tessuto adiposo facendo clic 3 volte ciascuno.
   4. Fare doppio clic su ciascun segmento per nominarlo e colorarlo in base alle impostazioni desiderate.
   5. Impostare l'intervallo HU per ciascun segmento utilizzando la funzione Soglia, situata sul lato sinistro della finestra. A tale scopo, trovare la funzione Intervallo di soglia e inserire i valori HU per ogni tipo di tessuto: tessuto magro (da -29 a 225 HU); tessuto adiposo (da -190 a -30 HU); osso (da 500 a 5.000 HU). Fare clic sul pulsante Applica.
      NOTA: Fare riferimento alla Figura S1 supplementare per il confronto dei valori HU.
   6. Ripetere il processo di segmentazione per ogni tipo di tessuto.
   7. Fare clic su Mostra 3D per generare un rendering 3D.
      NOTA: Il rendering apparirà nel quadrante blu del display.
3. Pulizia dell'immagine
   NOTA: Dopo la segmentazione e il rendering 3D, gli elementi estranei devono essere esclusi per garantire che non vengano inclusi nelle misurazioni volumetriche del tessuto magro, del tessuto adiposo e dell'osso. La rimozione di questi artefatti è essenziale per garantire un'analisi accurata.
   1. Individua lo strumento "Forbici" () nel menu Segmentazione .
   2. Scegli il piano anatomico o il rendering 3D per una visione più chiara dell'oggetto da rimuovere.
      1. Se si utilizza un piano anatomico, fare clic sul pulsante di ingrandimento della vista () sulla barra colorata del piano. All'interno della finestra del piano anatomico, utilizzare il pulsante di scorrimento del mouse per navigare avanti o indietro nella TAC.
         NOTA: Ogni finestra può scorrere in modo indipendente.
      2. Per il rendering 3D, utilizzare il pulsante sinistro del mouse per ruotare lungo qualsiasi asse e il pulsante destro del mouse per ingrandire.
         NOTA: I tasti freccia sulla tastiera possono anche ruotare l'immagine.
   3. Con lo strumento Forbici selezionato, evidenziate la segmentazione attorno all'oggetto indesiderato e circondatelo per rimuoverlo dall'immagine. Il software elimina automaticamente l'oggetto.
      NOTA: Assicurarsi che l'opzione Cancella all'interno sia selezionata. Se l'apparecchiatura utilizzata genera immagini per qualsiasi immagine non biologica, come il microsfone, l'anestetico o l'attrezzatura chirurgica, è importante rimuoverla. Inoltre, se un'area anatomica non è completamente ottenuta, è fondamentale stabilire un riferimento anatomico per rimuovere queste aree che non sono completamente ottenute per garantire la ripetibilità tra gli esperimenti. Gli oggetti indesiderati devono essere rimossi su ogni piano.
   4. Fare clic sull'icona Ripristina layout vista () per tornare alla schermata con le quattro finestre, indipendentemente dalla finestra selezionata.
   5. Ripetere la procedura per tutte le finestre in cui l'oggetto deve essere rimosso.
4. Volume di segmentazione
   1. Dopo la segmentazione, quantifica i volumi dei segmenti utilizzando la funzione di quantificazione che si trova nel menu a discesa.
      NOTA: Tutte le segmentazioni devono essere visibili per questa azione.
   2. Passa a Quantificazione | Statistiche dei segmenti. Fare clic su Applica e attendere che il software generi una tabella che visualizzi i valori per ogni segmentazione. Il software fornisce due valori di volume per ogni segmentazione: Labelmap (LM) e Closed Surface (CS).
      NOTA: Il valore LM è generalmente adatto per il calcolo dei volumi dei segmenti, utilizzando il numero di voxel moltiplicato per il volume di un singolo voxel. CS Value utilizza un modello di superficie levigata e integra il volume basato su elementi di superficie triangolari. Il CS si allinea più strettamente con i contorni anatomici ed è consigliato per misurazioni accurate.
   3. Per caricare i dati di un nuovo animale, salvare e chiudere la scena nel menu file .
5. Analisi della composizione corporea
   1. Utilizzare le misure di volume fornite dal software in cm³ per convertire questi volumi in massa tissutale e applicare la densità appropriata per ogni tipo di tessuto. Utilizzare le seguenti densità tissutali specificate dalla Commissione internazionale per le unità e le misure di radiazione²²: 0,95 g/cm³ (tessuto adiposo), 1,05 g/cm³ (tessuto magro) e 1,92 g/cm³ (tessuto scheletrico)².
      1. Per calcolare la massa tissutale, moltiplicare il volume (cm³) ottenuto dal software per la rispettiva densità tissutale (g/cm³):
         Massa del tessuto adiposo:_{Segmentazione del} volume X 0,95 = Massa_adiposa
         Massa tissutale magra:_{Segmentazione del} volume X 1,05 = Massa_magra
         Massa del tessuto scheletrico:_{Segmentazione del} volume X 1,92 = Massa_scheletrica
         Massa totale: Massa_adiposa + Massa_magra + Massa_scheletrica = Massa_totale
6. Misurazione della lunghezza ossea
   NOTA: Per correggere la massa tissutale in base alla lunghezza ossea per alcune analisi, è necessario ottenere lunghezze ossee specifiche.
   1. Torna al menu Editor segmenti . Nascondi le segmentazioni del tessuto adiposo e del tessuto magro facendo clic sull'icona a forma di occhio () accanto a ciascun segmento.
      NOTA: Solo la segmentazione corrispondente al tessuto scheletrico deve rimanere visibile.
   2. Seleziona l'opzione Attiva/disattiva marcature/barra degli strumenti () nell'angolo superiore del menu principale. Si aprirà un menu secondario appena sotto il menu principale. Individuare il pulsante Crea nuova linea ().
   3. Dopo aver cliccato sul pulsante Crea nuova linea , navigare fino alla ricostruzione 3D e identificare l'osso da misurare.
      NOTA: Le ossa consigliate sono la tibia o il femore²².
   4. Una volta identificato l'osso, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su un'estremità dell'osso e di nuovo sull'altra estremità del tessuto. Questa azione consente al software di calcolare la dimensione dell'osso.
      NOTA: Per misurazioni coerenti, selezionare la stessa regione anatomica dell'osso per ogni animale. Ad esempio, la testa del femore viene utilizzata come un'estremità e il condilo laterale come l'altra estremità del femore.
7. Analisi e normalizzazione dei dati
   NOTA: I dati sulla massa possono essere ottenuti come spiegato nella sezione 3.5 e utilizzati così come sono. In alternativa, la massa magra, grassa e ossea può essere normalizzata in due modi.
   1. Calcola il rapporto tra la massa del tessuto e il peso dell'animale il giorno in cui vengono ottenute le immagini.
      Normalizzazione al peso: Massa_magra ÷ Peso corporeo
   2. Calcola il rapporto tra massa e dimensioni dell'osso (ad esempio, femore o tibia).
      Normalizzazione al femore: massa_magra ÷ Dimensioni_{del femore}
      Normalizzazione della tibia: Massa_magra ÷ Dimensione_{della tibia}
      NOTA: I parametri di normalizzazione vengono scelti in base alla domanda sperimentale. Se sono previsti cambiamenti nelle dimensioni dell'osso (ad esempio: quando si confronta il rimodellamento osseo) si suggerisce la normalizzazione in base al peso corporeo (item 3.7.1). Inoltre, se nella domanda sperimentale sono previste variazioni del peso corporeo, la dimensione dell'osso lungo è il parametro di normalizzazione suggerito (item 3.7.2).

Results

Il corretto posizionamento anatomico dell'animale sedato sul tavolo di imaging garantisce risultati di scansione coerenti e riproducibili, evidenziando l'efficacia dell'acquisizione dei dati nel raggiungimento di risultati affidabili. Un'adeguata sedazione degli animali durante l'imaging, compresi i sistemi specializzati di erogazione del gas e i vaporizzatori, è fondamentale per valutazioni anatomiche precise (Figura 1).

La Figura 2 illustra la segmentazione e il rendering in diversi piani anatomici, presentando immagini sequenziali nei piani coronale, sagittale e trasversale. Queste immagini dimostrano la graduale segmentazione del tessuto scheletrico, adiposo e magro, culminando in una rappresentazione completamente segmentata che integra tutti i tipi di tessuto, evidenziando una chiara distinzione tra i tessuti e dimostrando marcature specifiche per regione basate sui tipi di tessuto identificati. Nonostante le limitazioni dell'attrezzatura precludano la cattura di tutto il corpo, il metodo fornisce informazioni dettagliate sulla distribuzione e la composizione dei tessuti su vari piani anatomici.

La Figura 3 mostra i rendering 3D che enfatizzano i tipi di tessuto - osso (blu), tessuto adiposo (giallo) e tessuto magro (rosso) - offrendo una visualizzazione completa delle strutture anatomiche. Questa visualizzazione sottolinea l'efficacia del protocollo nella generazione di modelli 3D dettagliati essenziali per gli studi anatomici.

La tabella 1 descrive in dettaglio le masse tissutali normalizzate (massa magra, grasso corporeo e massa scheletrica) rispetto al peso dell'animale il giorno dell'imaging. I valori presentati sono il risultato della moltiplicazione del volume tissutale (in cm³) per la corrispondente densità tissutale, come descritto nella fase 3.5.1.1 della metodologia.

La tabella 2 fornisce i valori assoluti della composizione corporea, mostrando la distribuzione della massa di ciascun animale e la percentuale di magro, grasso corporeo e tessuto scheletrico. Ci permette di valutare la quantità totale di ciascun tipo di tessuto e il modo in cui contribuisce alla composizione corporea complessiva di ciascun campione.

La tabella supplementare S1 mostra il tempo impiegato da ciascun analista per completare l'analisi della composizione corporea per ciascun animale e la variabilità dei risultati tra gli analisti. Valuta se esiste una variabilità significativa tra operatori esperti (analisti 1, 2 e 5) e inesperti (analisti 3 e 4) nella misurazione delle metriche di composizione corporea come massa magra, massa grassa corporea e massa scheletrica.

La Figura 4 presenta un'analisi comparativa della composizione corporea tra soggetti adulti e anziani. Rivela una riduzione della percentuale di massa magra e un aumento del grasso corporeo, che si allinea con i tipici modelli di invecchiamento. Questi risultati evidenziano collettivamente la robustezza e la precisione del protocollo di imaging nel fornire dati anatomici critici, essenziali per far progredire le metodologie di ricerca preclinica.

Figura 1: Preparazione degli animali. (A) Le apparecchiature utilizzate per la sedazione degli animali durante l'intero processo di imaging, come i sistemi di erogazione del gas e i vaporizzatori; (B) il sistema di scansione micro-CT. (C) L'animale anestetizzato è sdraiato supino su un letto per topi. Il corretto posizionamento è fondamentale per ottenere risultati coerenti e riproducibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Segmentazione e visualizzazione di fette in diversi piani anatomici. (A) piano coronale, (B) piano sagittale e (C) piano trasversale. Da sinistra a destra, le immagini mostrano una scansione non segmentata (grigio), una segmentazione ossea (blu), una segmentazione del grasso corporeo (giallo), una segmentazione del tessuto magro (rosso) e, infine, una segmentazione completa, comprese tutte le segmentazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rendering 3D. Da sinistra a destra, le immagini mostrano il rendering 3D del soggetto, evidenziando diversi tipi di tessuto: osso in blu, grasso corporeo in giallo, tessuto magro in rosso e l'immagine finale mostra una visione completa che combina osso, tessuto adiposo e tessuto magro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto della composizione corporea tra topi adulti e anziani. Il grafico a barre illustra le percentuali di composizione corporea del tessuto scheletrico (adulto: 10,5 ± 0,5%; anziani: 9,9 ± 1,0%, p = 0,19), grasso corporeo (adulto: 17,2 ± 5,7%; anziani: 27,9 ± 4,4%, p = 0,03) e massa magra (adulto: 72,3 ± 5,7%; anziani: 62,3 ± 3,6%, p = 0,03). I dati sono presentati come MEDIA ± SD degli animali (adulto: n = 3; anziani: n = 3). Le statistiche sono state calcolate utilizzando un test t non accoppiato con un valore p a una coda (* p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MAGRO
ID animale	Massa magra (g)	Peso (g)	Normalizzazione (peso)
Anziani 1	15.1	37.4	0.4
Anziani 2	14.4	44.4	0.3
Anziani 3	14.3	37.7	0.4
Adulto 1	12.3	29.1	0.4
Adulto 2	16.5	30.4	0.5
Adulti 3	16.1	31.7	0.5
GRASSO CORPOREO
ID animale	Massa grassa corporea (g)	Peso (g)	Normalizzazione (peso)
Anziani 1	6.4	37.4	0.2
Anziani 2	8.2	44.4	0.2
Anziani 3	5.3	37.7	0.1
Adulto 1	4.4	29.1	0.2
Adulto 2	2.7	30.4	0.1
Adulti 3	3.4	31.7	0.1
SCHELETRICO
ID animale	Massa scheletrica (g)	Peso (g)	Normalizzazione (peso)
Anziani 1	2.3	37.4	0.06
Anziani 2	2.3	44.4	0.05
Anziani 3	2.4	37.7	0.06
Adulto 1	2.0	29.1	0.07
Adulto 2	2.3	30.4	0.08
Adulti 3	2.2	31.7	0.07

Tabella 1: Normalizzazione delle masse in base al peso dell'animale il giorno dell'imaging. Come spiegato nella Sezione 3.7, la massa del tessuto può essere normalizzata dal peso dell'animale il giorno dell'esame. Questa normalizzazione è stata applicata al tessuto magro, adiposo e osseo in base al peso dell'animale.

Composizione corporea (g)
	Volume di segmentazione x 1,05	Volume di segmentazione x 0,95	Volume di segmentazione x 1,92	Magro + Adiposo + Scheletrico
ID animale	Massa magra (g)	Massa grassa corporea (g)	Massa scheletrica (g)	Massa totale (g)
Anziani 1	15.1	6.4	2.3	23.8
Anziani 2	14.3	8.2	2.3	24.9
Anziani 3	14.3	5.3	2.4	22.0
Adulto 1	12.3	4.4	2.0	18.6
Adulto 2	16.5	2.7	2.3	21.5
Adulti 3	16.1	3.4	2.2	21.7
Composizione corporea (%)
ID animale	Massa magra (%)	Massa grassa corporea (%)	Massa scheletrica (%)	Massa totale (%)
Anziani 1	63.6	26.8	9.6	100
Anziani 2	58.1	32.8	9.0	100
Anziani 3	64.9	24.1	11.0	100
Adulto 1	65.9	23.5	10.6	100
Adulto 2	76.8	12.4	10.9	100
Adulti 3	74.3	15.7	9.9	100

Tabella 2: Composizione corporea. A) la composizione corporea degli animali in grammi; (B) la percentuale della composizione corporea.

Tabella supplementare S1: Composizione corporea valutata da diversi operatori. Per ogni valutazione sono stati registrati la massa magra, la massa grassa corporea, la massa scheletrica e il tempo impiegato per l'analisi (in minuti). Gli analisti 1, 2 e 5 erano operatori esperti, mentre gli analisti 3 e 4 erano inesperti e seguivano solo il protocollo descritto nello studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: Intervallo di densità di diversi materiali biologici e non biologici. La figura illustra gli intervalli di densità di vari tessuti biologici e sostanze non biologiche. I valori sono stati ottenuti dalla letteratura e aggiustati per ottenere una differenziazione tissutale ottimale. Le ossa mostrano la densità più alta, seguite dal tessuto magro, mentre il grasso corporeo mostra una densità significativamente inferiore. Il dispositivo è stato calibrato con acqua come riferimento a una densità di 0. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La valutazione attraverso la tomografia è un metodo efficace e non invasivo per ottenere informazioni dettagliate sulla composizione corporea. La micro-CT, in particolare, offre preziose misure di esito per gli studi preclinici. In campo osseo, la micro-CT ha diversi utilizzi, in quanto particolarmente interessanti sono l'analisi della microarchitettura²³ e del rimodellamento osseo²⁴. La valutazione della morfologia della struttura biologica interna è rilevante anche nella ricerca biomedica, poiché l'analisi della densità vascolare in un tessuto specifico può valutarne la funzione e dedurre il metabolismo²⁵. Per gli studi endocrini e metabolici della massa adiposa, l'uso della micro-CT fornisce informazioni fondamentali in piccoli animali vivi^26,27. Inoltre, la micro-CT può essere applicata in altri campi, come la zoologia e la botanica, dove viene utilizzata per valutare le strutture di piccoli insetti e piante ^28,29.

Un limite significativo della micro-CT è il costo elevato e l'accesso limitato al software di analisi delle immagini. Inoltre, le conoscenze anatomiche pregresse, in particolare di anatomia animale, sono essenziali per misurazioni corrette. Questo manoscritto presenta il software 3D slicer in grado di produrre risultati paragonabili alle alternative commerciali. Questo sistema riduce anche la necessità di ampie conoscenze anatomiche, in quanto è semiautomatico³⁰.

Le immagini ottenute tramite micro-CT e analizzate dal software hanno dimostrato che la composizione corporea dei topi segue una traiettoria simile a quella dell'uomo durante l'invecchiamento, caratterizzata da un aumento del tessuto adiposo totale e da una concomitante diminuzione della massa magra³¹. Questi risultati sono stati evidenti quando si confrontano topi adulti (6 mesi) con topi anziani (22 mesi).

A causa delle limitazioni dell'apparecchiatura, la maschera per anestesia blocca l'acquisizione della testa. Pertanto, non siamo stati in grado di catturare e segmentare accuratamente l'intera testa. Di conseguenza, abbiamo stabilito una convenzione per utilizzare l'osso atlante (C1) come punto di riferimento anatomico, concentrando la nostra analisi sulla regione al di sotto di questo punto nell'attrezzatura qui utilizzata. Pertanto, tutte le immagini sopra il C1 sono state selezionate per essere rimosse. L'attrezzatura non ha raggiunto l'intera lunghezza della coda. Pertanto, la coda è stata rimossa dall'area basale in tutte le analisi. Suggeriamo all'utente di stabilire punti anatomici per selezionare le aree escluse per mantenere la riproducibilità tra gli esperimenti.

Questo articolo presenta un metodo per analizzare le immagini tomografiche utilizzando un protocollo accessibile ed economico. Il software è riuscito a distinguere tra tre tipi di tessuto: massa magra, tessuto adiposo e tessuto scheletrico. Tuttavia, non è stato in grado di distinguere il muscolo scheletrico dagli organi viscerali, una sfida comune nell'analisi della composizione corporea murina.

La micro-CT non ha la capacità di differenziare il tessuto viscerale e la massa muscolare scheletrica. Nonostante questa limitazione, i nostri risultati dimostrano il valore del software per lo studio delle malattie che influenzano la composizione corporea, in particolare quelle che colpiscono il muscolo scheletrico, come l'ipertrofia o l'atrofia. Può essere ripetuto come test non invasivo, consentendo il monitoraggio longitudinale della composizione corporea. Questa capacità aiuta a valutare i trattamenti protettivi e a sviluppare protocolli per modellare molte malattie metaboliche.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, versione 5.6.2		3D Slicer	Un software gratuito e open-source per l'analisi delle immagini e la visualizzazione scientifica.
Amide, versione 1.0.1	Piattaforma Amide		Un software gratuito e open-source utilizzato per correggere i valori dell'unità Hounsfield nelle immagini DICOM elaborate.
Amira, versione 4.1	Thermo Fisher Scientific		Utilizzato per estrarre i valori dell'unità Hounsfield dell'aria e dell'acqua dai dati grezzi del phantom e per convertire le immagini in file DICOM.
Isoforina	Cristá lia		L'isoflurano è un agente anestetico liquido non infiammabile per l'uso in anestesia generale per inalazione mediante vaporizzazione.
Sottosistema Triumph XO Sottosistema	di imaging Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced progettato per l'imaging preclinico di piccoli animali, che offre funzionalità TC e PET ad alta risoluzione per analisi quantitative e qualitative.