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AGGIORNAMENTI:
Si tratta di un aggiornamento del protocollo presentato in precedenza1
Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e la conformità con le normative federali e le politiche e le procedure dell'Università della California sono state approvate dall'Università della California, Riverside IACUC.
1. Animale
Aggiungere la seguente nota al passaggio 1.1:
NOTA: Se i topi diabetici omozigoti vengono acquistati direttamente dai fornitori, alloggiare i topi in un vivaio convenzionale per consentire la colonizzazione della pelle con una flora cutanea normale. Possono essere utilizzati sia maschi che femmine.
Aggiungere la seguente sezione dopo il passaggio 1.3:
1.4.Eseguire la genotipizzazione
NOTA: Eseguire la genotipizzazione dopo aver allevato l'animale come descritto in precedenza fino al passaggio 1.31. Il seguente protocollo è stato modificato da una procedura precedentemente pubblicata2. Sia i topi maschi che le femmine possono essere genotipizzati già a 14-21 giorni durante lo svezzamento.
1.4.1. Estrazione del DNA grezzo
1.4.1.1. Raccogliere la biopsia con punzone dall'orecchio dal topo e posizionare il campione di tessuto in una provetta da microcentrifuga.
1.4.1.2. Aggiungere 180 μl di NaOH da 50 mM, assicurandosi che il campione sia sommerso.
1.4.1.3. Incubare il campione a 95 °C per 10 minuti, depressurizzando e agitando la provetta ogni 5 minuti.
1.4.1.4. Raffreddare il campione con ghiaccio per almeno 1 minuto.
1.4.1.5. Aggiungere 20 μl di 1 M Tris HCl a pH 8,0 e vortex.
1.4.1.6. Conservare i campioni a -20 °C fino al momento dell'uso.
1.4.2. Reazione a catena della polimerasi
1.4.2.1 Assemblare la seguente miscela di primer in una provetta da microcentrifuga (Tabella dei primer).
NOTA: I primer amplificano la regione intorno alla mutazione puntiforme di LepR.
1.4.2.2. Impostare 20 μl di reazioni a catena della polimerasi in provette per PCR. Aggiungere 10 μL di 2x Taq polimerasi master mix (che contiene Taq DNA polimerasi, dNTP, MgCl2 e KCI), 1 μL di miscela di primer (vedi Tabella dei primer), 4 μL di estratto di DNA grezzo e 5 μL di H2O.
1.4.2.3. Impostare i parametri di termociclo come segue: 94 °C per 2 min; 40 cicli a 97 °C per 30 s, 52 °C per 45 s e 72 °C per 45 s; seguito da 72 °C per 2 minuti e 10 °C per una tenuta infinita.
1.4.2.4. Al termine della PCR, aggiungere 4 μl di colorante caricante DNA 6x ai prodotti della PCR e separare su un gel di agarosio al 2% (Figura 1).
NOTA: Ogni reazione PCR genera 3 prodotti PCR: 610 bp di prodotto comune, 406 bp di prodotto dell'allele T mutante e 264 bp di allele G wild-type. Il genotipo wild-type è costituito dai prodotti 610 bp e 264 bp, il genotipo eterozigote è costituito da tutti e tre i prodotti e il genotipo db/db è costituito dai prodotti 610 bp e 406 bp.
2. Vivaio e allevamento
Sostituire il passaggio 2.1 con il passaggio seguente e la nota:
2.1 Alloggiare i topi db/db in un vivaio convenzionale (non una struttura barriera/specifica priva di agenti patogeni) in modo che una microflora possa stabilirsi sulla pelle dei topi db/db . Per modellare in modo specifico gli esseri umani che soffrono di ferite croniche, non prendere precauzioni speciali per prevenire l'esposizione ai patogeni naturali presenti nell'ambiente dei topi, poiché i patogeni essenziali dello studio potrebbero andare persi con condizioni di pulizia più rigorose del vivaio.
NOTA: Poiché questi topi sono molto grandi e diabetici, è meglio ospitare fino a 3 topi db/db per gabbia prima di utilizzarli per esperimenti su ferite croniche.
3. Requisiti per lo sviluppo di ferite croniche
Aggiungere il passaggio seguente dopo il passaggio 3.2
3.3. Tenere sempre la ferita coperta con una medicazione in pellicola trasparente per evitare l'essiccazione del tessuto della ferita.
5. Impostazione del reagente
Aggiungere la seguente nota dopo la versione 5.2
NOTA: Utilizzare solo ATZ dell'azienda elencata nella Tabella dei materiali. L'ATZ di altre aziende non è compatibile con questo modello e aumenterà la mortalità.
6. Chirurgia
6.1. Trattamento e anestesia
NOTA: Di seguito viene descritto un regime di anestesia aggiornato.
6.1.5. In un sistema aperto, somministrare isoflurano al 5% somministrato con O2 al topo a una velocità di flusso (2-3,5 L/min) per indurre l'anestesia. Monitora continuamente lo stato del mouse.
NOTA: Una volta che il mouse è incosciente o non si muove più, posizionarlo su un tampone chirurgico bianco e inserire la testa con un cono nasale fissato al vaporizzatore per consentire la somministrazione continua di isoflurano durante l'intervento chirurgico.
6.1.6. In un sistema aperto, somministrare isoflurano all'1% alla stessa velocità di flusso durante l'intervento chirurgico e regolare il flusso di isoflurano per mantenere la profondità dell'anestesia.
6.3. Ferimento
6.3.5. Interrompere la somministrazione di isoflurano all'1% al topo al termine della procedura.
7. Trattamento e recupero post-operatorio
Sostituire il passaggio 7.1 nel protocollo originale con il passaggio seguente e notare:
7.1. Dopo aver applicato la medicazione in pellicola trasparente subito dopo l'intervento chirurgico, utilizzando una siringa da insulina, depositare localmente l'MSA sulla parte superiore della ferita creata sul dorso del topo penetrando la medicazione in pellicola trasparente con l'ago. Utilizzare 150 mg/kg di MSA in soluzione sterile di PBS entro 10 minuti dall'intervento chirurgico. Questa concentrazione è stata determinata dopo un'ampia ricerca bibliografica, come spiegato in precedenza 3,4.
NOTA: L'MSA tende a precipitare se non è costantemente agitato. Assicurarsi che l'MSA sia completamente disciolto nella soluzione prima di applicarlo sulla ferita per erogare la dose calcolata al topo.
Sostituire il passaggio 7.4 nel protocollo originale con il passaggio seguente:
7.4. Somministrare la seconda dose di Buprenex 6 ore dopo l'intervento chirurgico. Quindi, dosare periodicamente i topi secondo le regole IACUC locali per le prime 48 ore.
NOTA: Non è consigliabile utilizzare formulazioni a rilascio prolungato di analgesici che devono essere somministrate per via sottocutanea in questo modello murino. La buprenorfina legata ai lipidi può essere sospesa nell'olio di trigliceridi degli acidi grassi a catena media (MCT). Mentre l'effetto dell'olio MCT è stato testato in topi db/db molto giovani, gli effetti dell'MCT su topi db/db obesi più anziani o geriatrici non sono stati testati 5,6. Dato il peso dei topi, grandi volumi di analgesici iniettati per via sottocutanea vicino alla ferita possono influenzare significativamente i processi cellulari e molecolari di guarigione delle ferite e l'inizio e lo sviluppo delle ferite croniche. Inoltre, questo antidolorifico si dissolverà negli alti livelli di grasso in questi topi e, quindi, potrebbe non essere efficace nell'uccidere il dolore e potrebbe diventare tossico.
8. Raccolta dati, gestione dei topi dopo la ferita, strategie di sopravvivenza e suggerimenti aggiuntivi
8.1 Raccolta dei dati
Aggiungere i passaggi seguenti dopo il passaggio 8.1.3.
8.1.4. Assicurarsi che il tessuto raccolto per l'analisi includa solo tessuto che si trova a 2 mm di distanza dal margine della ferita, sia nelle ferite di controllo che in quelle croniche. Le ferite possono essere raccolte tramite escissione già 1-2 ore dopo l'applicazione di MSA.
8.1.5. Raccogliere il liquido in eccesso che si accumula dalla ferita, o essudato della ferita, con una siringa sterile perforando la medicazione in pellicola trasparente. Conservare a -20 °C per studi batterici o -80 °C per studi chimici e molecolari.
8.1.6 Per raccogliere l'intero tessuto della ferita, compreso il biofilm, dopo 10 giorni, applicare il 4% di PFA in PBS sulla ferita, localmente per 10 minuti prima di asportare con pinze e forbici. Quando si rimuove il tessuto, aggiungere un ulteriore margine di 5-10 mm in modo che il tessuto della ferita sia supportato da ulteriore tessuto normale. Continuare la fissazione in PFA al 4% in PBS e successivi lavaggi e preparazione per l'inclusione.
NOTA: Le ferite croniche 10 giorni dopo l'intervento chirurgico possono diventare troppo fragili per essere raccolte per l'istologia.
8.5. Strategie di sopravvivenza
8.5.1. Fornire un supporto extra all'idratazione: controlla se i topi diventano letargici e non mangiano o bevono attivamente perché l'intervento chirurgico e la generazione di cronicità sono stressanti. Somministrare soluzione fisiologica calda (35-38 °C) per via sottocutanea o intraperitoneale a un volume di 0,25 ml per 10 g di peso corporeo durante le prime 48-72 ore dopo l'intervento. Il supporto dell'idratazione può essere necessario fino a 2-3 volte al giorno, a seconda di quanto sono letargici i topi. Inoltre, pellet di cibo e gel d'acqua possono essere posizionati nella lettiera per un facile accesso, anche se potrebbero essere necessari cambi di gabbia più frequenti.
8.5.2. Fornire un supporto termico extra: la sopravvivenza post-operatoria è significativamente aumentata se i topi vengono posti in gabbie su un cuscinetto riscaldato da acqua circolante (93 oC) subito dopo l'intervento chirurgico e quando si trovano nel vivaio. Posiziona la gabbia per 1/2 sopra e 1/2 fuori dal cuscinetto per consentire all'animale di allontanarsi dal calore se si scalda troppo e di spostarsi sopra il tappetino se si raffredda.
