Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Questo protocollo mira a placcare stabilmente assembloidi fusi dorsale-ventrale su array multi-elettrodi per modellare l'epilessia in vitro.

Abstract

Gli organoidi cerebrali umani sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che ricapitolano aspetti dello sviluppo cerebrale fetale. La fusione in vitro di organoidi cerebrali dorsali e ventrali specificati a livello regionale genera assembloidi, che hanno microcircuiti funzionalmente integrati con neuroni eccitatori e inibitori. A causa della loro complessità strutturale e della diversa popolazione di neuroni, gli assembloidi sono diventati un utile strumento in vitro per studiare l'attività aberrante della rete. Le registrazioni MEA (Multi-Electrode Array) servono come metodo per catturare i potenziali del campo elettrico, i picchi e la dinamica della rete longitudinale da una popolazione di neuroni senza compromettere l'integrità della membrana cellulare. Tuttavia, l'adesione degli assembloidi agli elettrodi per registrazioni a lungo termine può essere difficile a causa delle loro grandi dimensioni e della limitata superficie di contatto con gli elettrodi. Qui, dimostriamo un metodo per placcare gli assembloidi su piastre MEA per registrare l'attività elettrofisiologica in un arco di 2 mesi. Sebbene l'attuale protocollo utilizzi organoidi corticali umani, può essere ampiamente adattato agli organoidi differenziati per modellare altre regioni del cervello. Questo protocollo stabilisce un robusto test elettrofisiologico longitudinale per lo studio dello sviluppo di una rete neuronale e questa piattaforma ha il potenziale per essere utilizzata nello screening farmacologico per lo sviluppo terapeutico nell'epilessia.

Introduction

Gli organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono strutture 3D spazialmente auto-organizzate che rispecchiano l'architettura dei tessuti e le traiettorie di sviluppo in vivo. Sono composti da più tipi di cellule, tra cui progenitori (cellule neuroepiteliali, glia radiale, progenitori neuronali, progenitori gliali), neuroni (neuroni eccitatori corticali e interneuroni inibitori) e cellule gliali (astrociti e oligodendrociti)^1,2. Gli assembloidi rappresentano la prossima generazione di organoidi cerebrali, in grado di integrare più regioni cerebrali e/o linee cellulari all'interno di una coltura 3D. Forniscono uno strumento utile per modellare le connessioni tra varie regioni del cervello che assomigliano alle controparti in vivo, catturando le interazioni tra neuroni e astrociti per imitare meglio le reti neurali mature e complesse e per studiare l'assemblaggio dei circuiti neurali. Pertanto, gli assembloidi stanno diventando uno strumento ampiamente utilizzato per ricapitolare i segni distintivi della fisiopatologia dell'epilessia, in cui sono necessarie misure funzionali per interrogare le reti neurali aberranti che possono essere alla base della causa della malattia 3,4,5,6.

Per modellare le interazioni tra i neuroni glutammatergici corticali e gli interneuroni GABAergici, diversi gruppi hanno sviluppato organoidi separati simili al cervello dorsale e ventrale e poi li hanno fusi insieme in un assembloide multi-regione 7,8,9,10. Qui, è stato applicato un protocollo di coltura assembloide precedentemente descritto con sottotipi neurali specifici a livello regionale⁹. Tuttavia, un ostacolo significativo è la mancanza di saggi funzionali riproducibili per monitorare l'attività della rete neurale durante il neurosviluppo. Molti test funzionali delle reti negli organoidi producono risultati che hanno un'elevata variabilità tra lotti di differenziazioni e linee cellulari. Le tecniche che comportano l'affettatura o la dissociazione degli organoidi alterano le loro reti intrinseche recidendo la connettività sinaptica⁸.

Gli array multi-elettrodo (MEA) forniscono una visione su larga scala dell'attività della rete nel tempo con un'elevata risoluzione temporale per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche degli organoidi senza alterare le condizioni di coltura o l'integrità della membrana cellulare¹¹. Rispetto all'elettrofisiologia patch clamp, la MEA consente l'acquisizione di dati ad alto rendimento basata su grandi popolazioni di neuroni piuttosto che su singole cellule. Le piattaforme MEA variano nella densità degli elettrodi, soddisfacendo le diverse esigenze nella ricerca sugli organoidi cerebrali¹². I sistemi ampiamente utilizzati, come mostrato in questo protocollo, registrano da 8 a 64 elettrodi per pozzetto 13,14,15. I MEA ad alta densità con un massimo di 26.400 elettrodi per pozzetto consentono una maggiore risoluzione spaziale e temporale, la quantificazione della velocità di propagazione del potenziale d'azione e la combinazione con la stimolazione optogenetica 14,16,17. Pertanto, la MEA funge da potente strumento per modellare l'epilessia in vitro e da paradigma traslazionale per lo screening dei farmaci antiepilettici.

Una delle sfide principali consiste nel stabilizzare gli assembloidi di grandi dimensioni su una superficie metallica idrofobica per registrazioni a lungo termine. Questo protocollo delinea una metodologia dettagliata per la placcatura di assembloidi intatti su piastre MEA per la registrazione longitudinale a lungo termine insieme a saggi farmacologici. I vantaggi unici del protocollo includono l'adesione stabile degli assembloidi alla superficie dell'elettrodo senza perdere l'attività elettrica, l'uso di terreni basali neurofisiologici disponibili in commercio per accelerare la maturazione della rete funzionale dopo la piastra, la fattibilità di condurre saggi funzionali a valle come il trattamento farmacologico e l'ampia applicazione agli organoidi generati con altri protocolli specifici per regione.

L'obiettivo è quello di fornire un test funzionale con un'elevata risoluzione temporale per studiare l'attività della rete, esaminare i cambiamenti specifici della malattia e testare farmaci con potenziale terapeutico nell'epilessia. Vengono fornite istruzioni video per le fasi più impegnative di questo protocollo, che mostrano le tecniche per la placcatura degli assembloidi su piastre MEA, nonché registrazioni rappresentative di queste colture.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali dimostrate di seguito sono state condotte in conformità con le linee guida etiche del Comitato di revisione istituzionale della University of Michigan Medical School e del Comitato di supervisione della ricerca sulle cellule staminali pluripotenti umane. Le linee iPSC utilizzate in questo protocollo e gli esperimenti rappresentativi sono stati derivati da fibroblasti del prepuzio umano ottenuti da una fonte commerciale. I dettagli delle linee cellulari, dei reagenti e delle apparecchiature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Derivazione di organoidi cerebrali fate-specifici da iPSCs

NOTA: Questo protocollo contiene informazioni per la preparazione di 3 pozzetti nella piastra di coltura a micropozzetti da 5 pozzetti confluenti (~85%) di una piastra a 6 pozzetti. Il protocollo di manutenzione dell'iPSC varia a seconda delle linee cellulari.

1. Preparare i singoli terreni di coltura cellulare utilizzando la composizione descritta nella Tabella 1. Conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Sciacquare una volta tutti i pozzetti da utilizzare nella piastra di coltura per micropozzetti con 1 mL di DMEM/F-12. Aggiungere 1 mL/pozzetto di mTeSR plus + 50 μM di Y-27632 e ruotare la piastra a 2000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzetti. Conservare la piastra in un incubatore a 37 °C 5% CO₂ .
3. Pulire le regioni di iPSC differenziate con una punta di pipetta P10 sterile al microscopio in un banco pulito a flusso laminare. Lavare via i detriti cellulari dal monostrato con 1 mL/pozzetto di PBS senza calcio o magnesio.
4. Dissociare il monostrato in singole cellule aggiungendo 1 mL/pozzetto di reagente di dissociazione cellulare preriscaldato e posizionando la piastra in un incubatore a 37 °C al 5% di CO₂ per 4-7 minuti (a seconda delle caratteristiche e della confluenza delle linee cellulari) fino al distacco della maggior parte delle cellule, con una leggera agitazione ogni 2-3 minuti.
5. Aggiungere 4 mL di DMEM/F-12 a ciascun pozzetto per diluire il reagente di dissociazione cellulare e triturare moderatamente con una pipetta sierologica da 10 mL. Raccogliere la sospensione cellulare da tutti i pozzetti della stessa linea in una provetta conica da 50 mL.
6. Centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL e risospendere le cellule in 2 mL di mTeSR più + 50 μM di Y-27632. Estrarre 10 μL di sospensione cellulare, miscelare 1:1 (v/v) con blu di tripano e contare le cellule con un contatore di cellule automatizzato.
7. Piastra 3 x 10⁶ cellule vive per pozzetto, 3 pozzetti per linea. Aggiungere ulteriore mTeSR plus + 50 μM di Y-27632 secondo necessità per portare il volume totale a 2 mL/pozzetto. Girare il piatto a 100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimetterlo nell'incubatrice.
   NOTA: La piastra di coltura per micropozzetti utilizzata qui contiene 300 micropozzetti per pozzetto, quindi la placcatura di 3 x 10⁶ celle produce 10.000 cellule/micropozzetto.
8. Il giorno successivo, eseguire una sostituzione del terreno a mezzo volume rimuovendo delicatamente 1 mL di terreno e aggiungendo lentamente 1 mL di mTeSR più terreno (senza Y-27632) con un puntale per pipetta P1000. Tenere la punta vicino alla superficie del terreno e aspirare il più lentamente possibile, in modo da non disturbare le cellule aggreganti nella parte inferiore.
9. Controllando al microscopio invertito un giorno dopo il cambio del supporto, si può vedere un chiaro contorno di ciascun aggregato. Rimuovere il terreno originale da ciascun pozzetto con i puntali per pipette P1000.
10. Spruzzare moderatamente 0,5 mL di terreno di induzione neurale (NIM) con dorsomorfina (DM) e SB-4321542 (SB) in ciascun pozzetto con puntali P1000 sterili e tagliati. Immediatamente, pipettare delicatamente gli aggregati sospesi in un terreno di coltura e trasferirli in una piastra di coltura sterile in sospensione da 10 cm. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli aggregati non sono stati trasferiti. NON triturare.
11. Aggiungere ulteriore NIM + SB/DM secondo necessità per portare il volume totale a 10 mL/piatto. Porre la capsula su un agitatore orbitale in un incubatore a 37 °C al 5% di CO₂ per evitare la fusione spontanea degli aggregati. Contrassegnare la data di trasferimento come Giorno 0 della coltura di organoidi.
12. Dal giorno 1 alla fine, seguire la ricetta multimediale nella Tabella 1 e la sequenza temporale di modifica dei media⁹ nella Figura 1. In particolare, gli organoidi sono divisi in due piastre di coltura in sospensione designate come "dorsale" e "ventrale" il giorno 4.
    NOTA: Diversi punti temporali chiave da tenere a mente: l'espansione degli organoidi inizia il giorno 6, quando il terreno viene passato al mezzo di differenziazione neurale (NDM) con EGF/FGF. La differenziazione neuronale è supportata a partire dal giorno 25 da NDM + BDNF/NT3 e gli organoidi vengono mantenuti in NDM senza fattori di crescita a partire dal giorno 46.

2. Marcatura virale e generazione di assembloidi

NOTA: La marcatura virale ^7,9 è raccomandata per riconoscere l'identità di ciascun organoide specifico della regione in un assembloide e assegnare l'attività elettrofisiologica da elettrodi specifici alle regioni assembloidi. È ottimale se viene impiattato un solo organoide per ogni pozzetto MEA. Questo protocollo può essere applicato anche alla placcatura di singoli organoidi.

1. Calcolare i volumi di stock di virus e i terreni di diluizione da utilizzare: sono necessari 200 μL di terreno con virus per ogni organoide da etichettare. Gli organoidi dorsali sono marcati con pAAV1-CAG-tdTomato, tipicamente con un rapporto di diluizione di 1:1000 (v/v), o circa 2 x 10¹⁰ vg/mL. Per gli organoidi ventrali, viene utilizzato il virus pAAV1-mDLX-GFP 1:300 (v/v) o 2 x^{10 11} vg/mL.
   NOTA: Le diluizioni devono essere titolate all'effetto desiderato e sono influenzate dal titolo virale.
2. Riscaldare la quantità appropriata di fluido a 37 °C. Scongelare le scorte di virus conservate a -80 °C su ghiaccio. Etichettare un numero sufficiente di piastre a 48 pozzetti per ospitare tutti gli organoidi etichettati.
3. Metti un bicchiere contenente il 10% di candeggina nel cappuccio. Espellere tutti i materiali a contatto con i virus nel becher. Diluire i virus completamente scongelati in terreni di coltura in provette coniche separate da 15 mL, etichettate come "dorsale" e "ventrale".
4. Spostare gli organoidi del giorno 56 dalle piastre di coltura alle piastre da 48 pozzetti. Si raccomanda un organoide per pozzetto per evitare la fusione spontanea in coltura statica. Rimuovere il più possibile il maggior numero possibile di terreni di coltura residui.
5. Aggiungere rispettivamente 200 μl di miscela virus-terreno in ciascun pozzetto. Rimettere le piastre nell'incubatore a 37 °C 5% CO₂ . Inclinare le piastre su una piastra sterile vuota per concentrare le particelle virali sul fondo del pozzetto e ottimizzare l'efficienza di trasduzione.
   NOTA: Le particelle virali tendono ad affondare sul fondo della provetta conica da 15 mL, quindi capovolgere frequentemente la provetta per mescolare i virus con i terreni prima di aggiungerli a ciascun pozzetto è molto importante per garantire un'efficienza di trasduzione uniforme per tutti gli organoidi.
6. Il giorno successivo (giorno 57), aggiungere altri 800 μL di terreno di coltura a ciascun pozzetto per portare il volume totale a 1 mL/pozzetto.
7. Tre giorni dopo (giorno 60), eseguire un cambio completo del terreno sugli organoidi etichettati. Candeggiare tutti i materiali a contatto con particelle virali.
8. Tre giorni dopo (giorno 63), controllare l'espressione della fluorescenza al microscopio invertito a epifluorescenza. Se il segnale è forte, iniziare a generare assembloidi (vedere il passaggio 2.9).
9. Sciacquare due volte tutti gli organoidi marcati con 1 mL/pozzetto di PBS per evitare la contaminazione incrociata da parte delle particelle virali residue durante la fusione degli organoidi. Utilizzare un puntale per pipetta P1000 tagliato per trasferire un organoide ventrale in ciascun pozzetto dorsale (o viceversa) e rietichettare la piastra assembloide di conseguenza. Inclinare le piastre come al punto 2.5 per una migliore fusione.
10. Eseguire con cautela un cambio del mezzo di volume 3 giorni dopo la procedura di fusione (giorno 66) senza interrompere gli assembloidi. Di solito ci vuole circa una settimana per formare assembloidi stabili (giorno 70).

3. Posizionamento di assembloidi su piastre MEA pretrattate

NOTA: Sono necessari almeno 4 giorni per completare le procedure di preparazione della superficie delle lastre MEA prima di placcare gli assembloidi. Per risparmiare tempo, la fusione degli organoidi dorsali e ventrali (passaggio 2.9) e il pretrattamento MEA possono essere eseguiti in parallelo.

1. Preparare i reagenti per il pretrattamento superficiale e il rivestimento.
   1. Per preparare una soluzione detergente/enzimatica all'1%, sciogliere 0,5 g di enzima/detersivo in polvere in 50 ml di acqua deionizzata. Agitare accuratamente fino a quando la polvere non è completamente sciolta. Sterilizzare la soluzione con un filtro sterile per vuoto nella cabina di biosicurezza prima di aggiungerla ai pozzetti MEA. Preparare fresco prima di ogni utilizzo.
      NOTA: Il detergente/enzima sterilizza la superficie MEA, rimuove eventuali oli residui dal processo di produzione MEA e garantisce che la superficie sia sufficientemente idrofila da promuovere le interazioni con il composto idrofilo polietilenimmina (PEI)¹⁸.
   2. Per preparare una soluzione di PEI allo 0,07%¹⁹, iniziare con la preparazione di una soluzione stock di PEI al 7% mescolando 1 mL di soluzione di PEI al 50% in una provetta conica da 15 mL con 6 mL di tampone borato 1x. Diluire 1 mL di soluzione madre di PEI al 7% in 99 mL di tampone borato 1x per ottenere la concentrazione di lavoro finale. Per la sterilizzazione, filtrare attraverso un'unità filtrante da 0,22 μm nella cabina di biosicurezza prima dell'uso.
      NOTA: Il PEI, un polimero caricato positivamente, viene utilizzato nel processo di rivestimento primario per facilitare l'adesione di un rivestimento secondario caricato negativamente con la matrice della membrana basale (BMM) e gli assembloidi²⁰. Prelevare 1 mL di PEI al 50% versandolo invece di pipettarlo nella provetta conica, poiché la soluzione madre è molto viscosa. La quantità necessaria può essere misurata più facilmente pesandola in una provetta conica e la soluzione di PEI al 50% ha una densità di 1,08 g/mL. La soluzione madre di PEI al 7% può essere conservata in aliquote da 1 mL a -20 °C per un massimo di un mese. Eseguire tutti i passaggi successivi nella cabina di biosicurezza.
2. In considerazione delle dimensioni di ciascun assembloide, vengono utilizzate piastre MEA a 6 pozzetti con 64 elettrodi per pozzetto per ospitare un assembloide per pozzetto. Calcolare il numero di piastre MEA necessarie per gli esperimenti per garantire un numero sufficiente di repliche biologiche.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione detergente/enzimatica all'1% in ciascun pozzetto di una piastra MEA sterile. Fare attenzione a non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta. Se si utilizza un aspiratore a vuoto per i lavaggi, evitare che la punta tocchi l'array di elettrodi. Incubare in un'incubatrice a 37 °C per 2 ore.
4. Rimuovere il detersivo/enzima e lavare ogni pozzetto cinque volte con 1,5 ml di acqua deionizzata sterile. Poiché il detergente/enzima non è biocompatibile, è importante assicurarsi che le sostanze chimiche rimanenti vengano completamente lavate via.
5. Riempire ogni pozzetto con 1 mL di terreno di coltura per il precondizionamento. Rimettere le piastre a 37 °C 5% CO₂ incubatore per 2 giorni. L'esposizione della superficie MEA alle condizioni di coltura cellulare favorisce l'adesione cellulare.
6. Rimuovere il terreno di coltura e coprire gli elettrodi MEA in ciascun pozzetto con 50 μl di soluzione di PEI allo 0,07% per il rivestimento primario. Incubare a 37 °C per 1 ora.
7. Aspirare completamente la soluzione di PEI. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di acqua deionizzata sterile. Eseguire 3 lavaggi rapidi in totale. Asciugare le piastre a temperatura ambiente per 15 minuti nella camera di biosicurezza senza coperchio.
8. Coprire l'area dell'elettrodo in ciascun pozzetto con 50 μl di BMM 1:20 (v/v) diluito in terreno di coltura per il rivestimento secondario. Rimettere le piastre MEA nell'incubatore a 37 °C per una notte. Aggiungere acqua sterile negli scomparti che circondano i pozzetti per garantire un'umidità sufficiente durante tutto il corso del rivestimento.
9. Il giorno successivo, aspirare il BMM diluito con il vuoto, lasciando uno strato sottile sulla superficie. Se si è formato uno strato spesso, spruzzare con forza l'area di contatto dell'elettrodo con il terreno di coltura utilizzando un puntale per pipetta P1000. Lavare tutte le volte necessarie per eliminare eventuali pezzi spessi.
   NOTA: Il BMM denso residuo può interferire con il contatto dell'elettrodo con le celle.
10. Raccogliere un assembloide con una punta P1000 ampiamente tagliata e posizionarlo sopra gli elettrodi in un pozzetto, trasferendo il minor numero possibile di terreno.
11. In una cappa a flusso laminare sotto un endoscopio di dissezione, spingere con cautela l'assembloide con un ago di dissezione sterile o una punta P20 nella posizione desiderata, dove sia gli organoidi dorsali che quelli ventrali possono essere per lo più coperti da elettrodi. Utilizzare una punta P20 per rimuovere il liquido attorno all'assembloide. Ripeti l'operazione per tutti gli assembloidi o per un sottoinsieme, operazione che può essere eseguita in pochi minuti.
    NOTA: Cercare di NON toccare o graffiare la superficie MEA con la punta della pipetta e/o l'ago. Cerca di NON colpire o strappare l'assembloide con i puntali delle pipette. Terminare la placcatura il più rapidamente possibile per evitare che l'organoide si secchi completamente.
12. Incubare gli assembloidi a 37 °C per 10 minuti (senza terreno). Trasferire le piastre dall'incubatore a una cappa a flusso laminare e applicare 2-3 piccole gocce di BMM 1:50 diluite in terreno di coltura sopra gli assembloidi in un endoscopio di dissezione. Incubare a 37 °C per altri 30 minuti.
13. Aggiungere con cautela 3 gocce di terreno di coltura vicino agli assembloidi sotto un cannocchiale di dissezione. Questo mantiene gli organoidi idratati. Incubare a 37 °C per 1 ora.
    NOTA: Se l'assembloide si muove o galleggia in qualsiasi passaggio successivo, la placcatura deve essere riavviata dal passaggio 3.11.
14. Ogni ora, aggiungere con cura 20-50 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto sotto un endoscopio di dissezione. Questo può essere fatto nel corso di una giornata. L'obiettivo è raggiungere almeno 250 μL di volume totale alla fine della giornata.
15. Il giorno successivo, controllare se tutti gli assembloidi si sono stabilizzati e stabilizzati sotto l'ambito di dissezione. Aggiungere altri 750 μL di terreno di coltura per raggiungere un volume totale di 1 mL/pozzetto. Lasciare le piastre indisturbate per almeno 2 giorni.
16. Eseguire con attenzione i cambi di terreno settimanali prelevando 500 μL di terreno di coltura e aggiungendo 700 μL di terreno basale neurofisiologico. Il volume aggiuntivo di terreno aggiunto tiene conto dell'evaporazione e può essere regolato in base alla quantità di evaporazione della piastra MEA utilizzata. Aggiungere acqua sterile intorno ai pozzetti, se necessario, per ridurre al minimo l'evaporazione dai pozzi MEA.

4. Registrazione MEA e analisi dei dati

1. Iniziare la registrazione MEA circa una settimana dopo il passaggio ai mezzi basali neurofisiologici (di solito intorno al giorno 78).
2. Attendere che la camera di registrazione raggiunga la temperatura impostata (di solito 37 °C). Trasferire una piastra sul dispositivo e lasciarla equilibrare per almeno 5 minuti prima della registrazione.
3. Impostazioni hardware in tempo reale
   1. Impostare la frequenza di campionamento, ovvero la velocità con cui vengono registrati i dati di tensione grezza. Si consiglia l'impostazione predefinita (12,5 kHz).
   2. Specificare la modalità analogica (in genere Neural Spikes, come in questo caso) per configurare la larghezza di banda e il guadagno dell'hardware per applicazioni specifiche. Per il monitoraggio visivo dell'attività durante la registrazione, utilizzare i moduli Spike Detector e Burst Detector .
      NOTA: Le impostazioni analogiche influiscono sul modo in cui vengono registrati i dati di tensione grezza e non possono essere modificate dopo la registrazione dei dati.
   3. (Facoltativo) Applicare un filtro digitale hardware ai dati di registrazione. Le opzioni di filtro passa-basso includono una finestra Kaiser a 2 kHz o 3 kHz. Le impostazioni predefinite possono essere modificate dopo aver selezionato le impostazioni analogiche.
   4. Impostare il riferimento in base alla mediana (impostazione predefinita), che è altamente consigliato per la registrazione neurale, come in questo caso. Il riferimento migliora la qualità dei segnali a bassa ampiezza riducendo l'interferenza di rumore comune ai gruppi di canali.
      NOTA: I parametri di cui sopra possono essere regolati secondo necessità a seconda dell'attività osservata negli assembloidi, ma devono essere mantenuti coerenti per tutte le registrazioni in un determinato esperimento.
4. Aggiungere mappe e descrizioni delle placche (se necessario). Importare la mappa della lastra dalla registrazione precedente per la stessa lastra per garantire la coerenza e facilitare l'elaborazione dei dati in batch. Assicurati che i file abbiano un nome corretto.
5. Se i segnali sono buoni (rumore e artefatti minimi), registrare i dati grezzi. Generalmente 2-5 minuti di registrazione sono sufficienti per un campione rappresentativo.
6. Registrare longitudinalmente l'attività elettrica una o due volte alla settimana, per 5-15 minuti, a seconda del disegno sperimentale. Attendere almeno 24 ore dopo ogni cambio di supporto prima di iniziare il ciclo di registrazione successivo, poiché l'attività elettrica diminuisce immediatamente dopo ogni cambio di supporto.
7. (Facoltativo) Se l'attività elettrica deve essere localizzata e distinta tra organoidi dorsali e ventrali, o se l'attività di ciascun elettrodo deve essere analizzata separatamente, ottenere un'immagine di ciascun assembloide in campo chiaro ed epifluorescenza (Figura 2B) dopo ogni registrazione.
8. Quando si analizzano i dati, applicare una configurazione di analisi, che includa un rilevatore di picchi/burst e un compilatore di statistiche. Utilizzare una soglia adattiva impostata su 5,5-6 deviazioni standard dal basale per il rilevamento dei picchi. Identifica i burst come attività con picchi di ≥5 in 100 ms¹³. Definisci l'attività di rete quando oltre il 25% del totale degli elettrodi attivi si accende entro 100 ms con un minimo di 50 picchi per burst di rete^13,14.
   NOTA: Questi parametri sono modulati in base alle caratteristiche di cottura di uno specifico esperimento. Per aumentare la sensibilità per i picchi di bassa ampiezza, la soglia adattiva per il rilevamento dei picchi può essere abbassata. Per il rilevamento dei burst, è possibile utilizzare vari metodi e i parametri possono essere adattati per rilevare picchi di picchi che differiscono in modo significativo dall'attività di fondo. I parametri dell'attività della rete possono essere modulati a una percentuale inferiore di elettrodi, soprattutto quando gli assembloidi non coprono l'intero campo degli elettrodi. Tutti i parametri devono rimanere coerenti per tutta la durata di un esperimento per consentire confronti longitudinali.
9. Eseguire il modulo Statistics Compiler per l'elaborazione batch durante la riproduzione dei dati registrati. Esporta metriche avanzate e/o file di output spike per analisi avanzate.
   NOTA: L'output delle metriche avanzate contiene .csv file con le medie degli elettrodi, dei pozzetti e dei gruppi per l'attivazione media, lo scoppio e la sincronia. L'output dei picchi (file .spk) include tracce di forme d'onda per tutti i picchi, che possono essere importate su altre piattaforme per l'analisi avanzata, ad esempio l'ordinamento dei picchi.

5. Saggio farmacologico end-point e riciclo su piastra

NOTA: I saggi di trattamento farmacologico possono essere eseguiti dopo che gli assembloidi sono sufficientemente maturi e l'attività elettrica raggiunge i picchi. La registrazione dell'attività basale/pre-trattamento e dell'attività post-trattamento deve essere effettuata lo stesso giorno.

1. Aggiungere 1-10 μL di soluzione farmacologica proprio sopra l'assembloide e agitare delicatamente la piastra per garantire una miscela uniforme. In alcuni casi si raccomanda un tempo di incubazione più lungo in terreni contenenti farmaci, ad esempio saggi di trattamento farmacologico correlati alle sinapsi con agonisti/antagonisti del recettore glutammato/GABA (Figura 2E) (vedere la sezione Risultati per i dettagli).
   NOTA: Si consiglia di aggiungere una piccola quantità di soluzione farmacologica a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione di lavoro finale poiché una grande variazione di volume ridurrà temporaneamente l'attività elettrica in generale. È importante assicurarsi che l'aggiunta di un veicolo in cui sono disciolti i farmaci di interesse non provochi cambiamenti significativi nei parametri elettrofisiologici.
2. Eseguire un numero sufficiente di lavaggi PBS (in genere 3) e lavare via i farmaci dopo la registrazione post-trattamento. Effettuare un'ulteriore registrazione il giorno successivo al wash-out del farmaco per vedere se l'attività elettrica ritorna al livello basale.
3. Facoltativamente, pipettare con forza i terreni per separare gli assembloidi dalla piastra MEA alla fine delle registrazioni per eseguire ulteriori esperimenti, ad esempio imaging dal vivo, fissazione con paraformaldeide al 4% per l'immunocolorazione a montaggio intero o lisi per l'estrazione di RNA o proteine.
4. Ai fini dell'analisi, utilizzare almeno tre repliche tecniche e biologiche per ciascuna condizione. Esprimere i dati elettrofisiologici come media di n ≥ 3 repliche.
5. Per riciclare la lastra al termine degli esperimenti, aspirare il terreno rimanente dopo aver rimosso gli assembloidi attaccati. Lavare una volta con PBS sterile. Coprire completamente l'area metallica con 200 μL/pozzetto di tripsina-EDTA allo 0,25% e rimettere la piastra in un incubatore a 37 °C per una notte.
6. Il giorno successivo, aspirare la tripsina, lavare due volte con etanolo sterile al 70% e tre volte con acqua deionizzata sterile.
7. Asciugare la piastra nella camera di biosicurezza all'aria per 15 minuti senza il coperchio o fino a quando non è completamente asciutta. Sigillare la piastra pulita in un sacchetto di plastica e conservarla a temperatura ambiente fino al futuro utilizzo.
   NOTA: Una lastra MEA ben pulita può essere riutilizzata tre volte senza compromettere in modo significativo la qualità della registrazione.

Results

Gli assembloidi dorsali-ventrali umani sono stati placcati su una piastra MEA a 6 pozzetti (n = 6 per differenziazione, 3 differenziazioni), con ogni pozzetto contenente 64 elettrodi (Figura 2A). Nove degli assembloidi su dieci previsti per la registrazione longitudinale sono stati saldamente attaccati agli elettrodi per oltre 50 giorni in vitro (Figura 2D). 6 degli 8 assembloidi designati per i saggi farmacologici sono stati risolti con successo attraverso la fase di wash-out con un'attività di rete appropriata allo stadio di sviluppo (Figura 2E). Vengono mostrate immagini di contrasto di fase e fluorescenza da un pozzetto rappresentativo (Figura 2B), in cui si distinguono facilmente gli organoidi dorsali marcati con AAV-CAG-tdTomato e gli organoidi ventrali marcati con AAV-mDLX-GFP ^7,9.

L'attività dei neuroni su un MEA può essere analizzata per valutare l'eccitabilità cellulare complessiva e l'attività della rete, attraverso una varietà di parametri. Le percentuali complessive di attivazione in tutta la coltura forniscono informazioni sull'eccitabilità cellulare e di rete, mentre la frequenza delle esplosioni sincronizzate su più elettrodi indica la gamma di reti di neuroni sinapticamente attive. Picchi multipli ripetuti che si verificano su elettrodi spazialmente distinti per un breve periodo di tempo (network bursting) possono fungere da correlati biologici all'attività simile alle convulsioni, sebbene gli assembloidi sui MEA rimangano limitati rispetto a un intero organismo che può avere convulsioni in buona fede . La Figura 2C illustra i modelli di bursting della rete di assembloidi coltivati in terreni basali neurofisiologici disponibili in commercio nei giorni 84 e 91, con un aumento della durata del bursting nel momento successivo, probabilmente dovuto alla maturazione funzionale dei neuroni. In questo caso, l'attività cellulare e della rete aumenta gradualmente dal giorno in cui gli assembloidi vengono placcati, di solito raggiungendo il picco il giorno 92 e quasi svanendo il giorno 125 (Figura 2D). L'aumento della maturazione nella fase successiva probabilmente contribuisce all'estensione della durata del burst sincronizzato nel momento della registrazione successiva.

La bicucullina, un antagonista del recettore GABA_A , migliora l'attività di rete sincronizzata degli assembloidi, come dimostrato da tassi di attivazione significativamente più elevati e frequenze di burst (di rete) dopo l'aggiunta del farmaco al giorno 108 (Figura 2E). Questo è simile a ciò che è stato precedentemente dimostrato nelle registrazioni di elettrofisiologia a singola cellula²¹. Un'analisi di potenza per il test farmacologico è stata condotta utilizzando la base G*Power3 su una dimensione dell'effetto di 0,94 e un alfa di 0,05. Per ottenere una potenza di 0,8 è stato necessario un campione totale di 15 assembloidi con tre gruppi di uguali dimensioni di n = 5 (Figura 2E). È incluso un controllo del veicolo per verificare che la risposta sia un vero evento di segnalazione e non semplicemente una variazione dell'intensità del segnale che può derivare dall'aggiunta di una piccola quantità di media (Figura 2E).

Figura 1: Panoramica dello studio. Protocollo per la generazione e la placcatura di assembloidi a doppia marcatura sulla cronologia MEA del protocollo di differenziazione che descrive in dettaglio le fasi critiche e i corrispondenti supplementi di piccole molecole (per ulteriori informazioni sulla composizione, vedere la Tabella 1 e la Tabella dei materiali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Registrazione MEA degli assembloidi. (A) Mappa termica dell'attività media di sparo da una singola piastra MEA (n = 6 pozzetti) al giorno 82, cioè al giorno 10 dopo la placcatura. Tutti i pozzetti rappresentano colture della stessa condizione e genotipo. (B) Immagini rappresentative a contrasto di fase e confocali dell'assembloide, con l'assembloide dorsale marcato in rosso e ventrale in verde. Le punte di freccia bianche indicano la migrazione degli interneuroni GABAergici dal lato ventrale a quello dorsale. Barra di scala = 500 μm. (C) Grafici raster rappresentativi su 120 s di tempo di registrazione da un singolo pozzetto. I burst di rete sono evidenziati con una casella viola. Vengono dimostrati due punti temporali separati, il giorno 78 (1 settimana dopo la placcatura, giorno di inizio della registrazione) e il giorno 92 (3 settimane dopo la placcatura, anche quando l'attività raggiunge il picco). (D) Quantificazione delle velocità medie di sparamento, della frequenza di burst e della frequenza di bursting della rete dal giorno 78 al giorno 127 (n = 3 differenziazioni, 3 assembloidi/differenziazione). Ogni curva indica un singolo assembloide, compilato da 3 differenziazioni (codificate a colori). La curva rossa mostra il valore medio. (E) Quantificazione dei risultati del saggio della bicucullina (n = 6 assembloidi/condizione). Il grafico a barre veniva visualizzato come media ± SEM. Ogni punto rappresenta un assembloide, compilato da 3 lotti di differenziazione (codificati a colori). È stato eseguito un test di Friedman non parametrico. **p < 0,01; ns, non significativo. MEA, array multi-elettrodo. Le mappe di calore e i grafici raster vengono generati utilizzando il software analitico Neural Metric Tool. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Componenti dei mezzi nelle varie fasi di differenziazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Metodi basati su MEA per registrazioni elettrofisiologiche dell'attività di rete in assembloidi derivati da iPSC sono stati utilizzati per la modellazione in vitro dell'epilessia^22,23. Questa piattaforma proposta che integra connessioni sinaptiche eccitatorie e inibitorie ha il potenziale per affrontare i meccanismi di ipereccitabilità neuronale e il ruolo degli interneuroni corticali nel processo di epilettogenesi. Inoltre, questa piattaforma consente la stabilizzazione degli assembloidi e la raccolta di dati elettrofisiologici longitudinali per circa 50 giorni in vitro, anche in presenza di perturbazioni farmacologiche, fornendo così un approccio per testare composti con potenziali bersagli terapeutici.

Stabilizzare in vitro assembloidi maturi e relativamente grandi su una superficie idrofobica per un lungo periodo è stato tecnicamente impegnativo. Per superare questo ostacolo, la strategia del doppio rivestimento viene applicata con sostanze chimiche caricate inversamente per facilitare l'aderenza a breve e lungo termine degli organoidi alla superficie dell'elettrodo. Questo protocollo ottimizza il metodo²⁴ precedentemente utilizzato commutando i reagenti di rivestimento delle piastre da poli-L-ornitina (PLO)/laminina a PEI/BMM, ottenendo un solido legame con alte percentuali di successo e bassa tossicità. Inoltre, questo sistema di coltura stabilizzato a lungo termine ha il potenziale per produrre dati ad alto rendimento. Ad esempio, la pre-marcatura con virus doppi può integrare lo smistamento degli spike da parte dei singoli elettrodi per localizzare e confrontare l'attività di diverse regioni. La piattaforma proposta fornisce anche uno strumento stabile per la registrazione dei potenziali di campo locale, che è molto rilevante per la funzione degli interneuroni senza interrompere la struttura intatta degli assembloidi²⁵. La principale limitazione di questo protocollo è che gli assembloidi vengono appiattiti dopo la placcatura, il che solleva preoccupazioni sul fatto che le strutture 3D iniziali siano conservate o meno. La coltivazione di organoidi attorno agli elettrodi utilizzando piattaforme MEA più avanzate che avvolgono un organoide con elettrodi²⁶ potrebbe potenzialmente superare la limitazione.

Uno dei principali ostacoli dei metodi basati su MEA per la registrazione elettrofisiologica degli organoidi è la variabilità e la riproducibilità dei risultati sperimentali attraverso i protocolli di differenziazione e persino i lotti di differenziazione. Studi precedenti mostrano che l'attività di rete dei neuroni misurata dalla MEA dipende dallo stato di maturazione neuronale degli organoidi dorsali e ventrali²⁷. La registrazione da assembloidi in un momento successivo con neuroni e circuiti relativamente maturi è un modo per migliorare la coerenza. Inoltre, la scelta di sistemi MEA multi-pozzo che generano dati ad alto rendimento consentirà confronti statistici alla luce della variabilità sperimentale. Se l'attività elettrofisiologica di una coltura non è coerente con ciò che ci si aspetta in un dato momento, la raccolta della coltura intatta dalla piattaforma funzionale per le misure di controllo della qualità, tra cui l'analisi immunocitochimica e trascrittomica, sarà importante e utile.

Fondamentale per la piattaforma proposta è integrare funzionalmente i neuroni corticali eccitatori specificati a livello regionale sul lato dorsale e gli interneuroni inibitori sul lato ventrale. I protocolli per la generazione di organoidi specifici della regione cerebrale presenti in letteratura differiscono notevolmente in relazione alle condizioni dei terreni, ai tempi delle colture, alla resa e ai profili di maturazione, tra gli altri fattori²⁸. Mentre questo protocollo è specifico per la corteccia e l'eminenza gangliare nella sua capacità di generare neuroni eccitatori e interneuroni GABAergici, tecniche di differenziazione ben consolidate possono essere utilizzate per generare neuroni derivati da iPSC che mostrano altre identità, come i motoneuroni²⁹ e le cellule di Purkinje³⁰. Pertanto, la piattaforma proposta ha il potenziale per modellare i circuiti neurali tra la corteccia cerebrale e il midollo spinale/cervelletto. Dopo alcune ottimizzazioni relative ai tempi di placcatura e visualizzazione dei tipi di cellule con marcatura virale, questo metodo può essere tradotto in altri modelli di malattia oltre all'epilessia, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Piastre di coltura non trattate con TC	Corning	08-772-32	Per la coltura in sospensione sull'agitatore
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Etanolo	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoetanolo (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Concentrazione di lavoro 100 μ Piastra
coltura cellulare M a 48 pozzetti	Fisher Scientific	50-202-140
Piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Centrifuga refrigerata Allegra X-14R	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	sospeso 5 mg in DMSO per ottenere 1 mM di soluzione stock. Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Diluire a 1:10.000 per l'uso. Concentrazione di lavoro 100 nM.
Contatore di cellule automatizzato	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA piastre a 6 pozzetti	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Piattaforma Axion Maestro MEA Axion	Biosystems		Maestro Con controllo ambientale della temperatura
Integratore di B-27 (regolare, con vitamina A)	Thermo Fisher	21985023
integratore di B-27 (senza vitamina A)	Thermo Fisher	12587010
Matrice di membrana basale - Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bagno di perline	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Microscopio invertito da banco	Olympus	CKX53	Tenuto in flusso laminare banco pulito
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Concentrazione di lavoro 10 μ M
Candeggina	CLOROX	67619-26
Tampone borato 20x	Thermo Fisher	28341	Concentrazione di lavoro a 1x
terreno BrainPhys StemCell	Technologies	5790
Reagente di dissociazione cellulare (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Agitatore orbitale Celltron	HT-Infors	I69222
Detergente/enzima (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Concentrazione di lavoro 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutammina	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorfina	Sigma-Aldrich	P5499	Sciogliere 5 mg in DMSO per ottenere 10 mM di soluzione stock. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:2000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 5 μ M)
D-PBS senza calcio o magnesio	Thermo Fisher	14190144
Neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μ g in 1mL di PBS a 100 μ g/mL. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:5000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 ng/mL).
Integratore GlutaMAX	Thermo Fisher	35050061
Ematocitometro	Scienze della microscopia elettorale	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Incubatore per colture cellulari a umidità controllata	Thermo Fisher	370	impostato su 37 ° C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Precipiterà se scongelato a temperatura ambiente. Le aliquote congelate devono essere inserite direttamente in 37 ° C prima dell'uso.
Sostituzione del siero knockout (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (terreno + integratori)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, terreno stabilizzato senza alimentatore per cellule iPSC umane
Integratore di N2	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μ g in 1mL di PBS a 100 μ g/mL. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:5000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 ng/mL).
NuFF Fibroblasti del prepuzio neonatale umano	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilina/Streptomicina	Thermo Fisher	15140122
Pipetta (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Puntali P1000 tagliati in autoclave per la raccolta di organoidi
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Pasta madre diluita in tampone borato sterile. Concentrazione di lavoro 0,07%. Vedi i dettagli nel manoscritto.
Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF)	R& D Systems	236-EG-200	sospeso in PBS. Aliquotare e congelare a -20 °C.
Fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinanti (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	sospeso in PBS. Aliquotare e congelare a -20 °C.
Fattore neurotrofico ricombinante derivato dal cervello umano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuga brevemente prima della ricostituzione. Sciogliere 100 μ g in 1 mL di PBS a 100 μ g/mL. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:5000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 ng/mL).
Acido retinoico (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Sciogliere 100 mg in 3,3 mL di DMSO per ottenere 100 mM di soluzione stock. Aliquotare il titolo 100 μ L/tubo e congelare a &meno; 80 °C. Prendi 200 μ L di 100 mM di stock e diluire 10 volte (aggiungere 1,8 mL di DMSO) per ottenere 10 mM di stock. Aliquot 50 μ L/tubo e conservare a &meno; 80 °C. Diluire a 1:100.000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 100 nM).
Inibitore ROCK Y-27632	Tocris	1254	1:200 da 10 mM stock
SAG (agonista levigato)	Selleckchem	S7779	Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Concentrazione di riserva 1mM. Utilizzare a diluizione 1:10.000 (concentrazione di lavoro 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Sciogliere 5 mg in 1,3 mL di DMSO per ottenere 10 mM di soluzione madre. Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 μ M)
Riempitrice per pipette sierologiche	Fisher Scientific	14-387-166
Filtro superiore per tubi sottovuoto Steriflip	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Cappe per colture cellulari sterili	Baker Company	SG-600
Soluzione di tripano blu (0,4%)	Thermo Fisher	15250061
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher	25200056
Stereomicroscopio zoom	Olympus	SZ61/SZ51	Conservato in banco pulito a flusso laminare