Questo protocollo mira a placcare stabilmente assembloidi fusi dorsale-ventrale su array multi-elettrodi per modellare l'epilessia in vitro.
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Articolo metodologico
Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi cerebrali umani sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che ricapitolano aspetti dello sviluppo cerebrale fetale. La fusione in vitro di organoidi cerebrali dorsali e ventrali specificati a livello regionale genera assembloidi, che hanno microcircuiti funzionalmente integrati con neuroni eccitatori e inibitori. A causa della loro complessità strutturale e della diversa popolazione di neuroni, gli assembloidi sono diventati un utile strumento in vitro per studiare l'attività aberrante della rete. Le registrazioni MEA (Multi-Electrode Array) servono come metodo per catturare i potenziali del campo elettrico, i picchi e la dinamica della rete longitudinale da una popolazione di neuroni senza compromettere l'integrità della membrana cellulare. Tuttavia, l'adesione degli assembloidi agli elettrodi per registrazioni a lungo termine può essere difficile a causa delle loro grandi dimensioni e della limitata superficie di contatto con gli elettrodi. Qui, dimostriamo un metodo per placcare gli assembloidi su piastre MEA per registrare l'attività elettrofisiologica in un arco di 2 mesi. Sebbene l'attuale protocollo utilizzi organoidi corticali umani, può essere ampiamente adattato agli organoidi differenziati per modellare altre regioni del cervello. Questo protocollo stabilisce un robusto test elettrofisiologico longitudinale per lo studio dello sviluppo di una rete neuronale e questa piattaforma ha il potenziale per essere utilizzata nello screening farmacologico per lo sviluppo terapeutico nell'epilessia.
Introduzione
Gli organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono strutture 3D spazialmente auto-organizzate che rispecchiano l'architettura dei tessuti e le traiettorie di sviluppo in vivo. Sono composti da più tipi di cellule, tra cui progenitori (cellule neuroepiteliali, glia radiale, progenitori neuronali, progenitori gliali), neuroni (neuroni eccitatori corticali e interneuroni inibitori) e cellule gliali (astrociti e oligodendrociti)1,2. Gli assembloidi rappresentano la prossima generazione di organoidi cerebrali, in grado di integrare più reg....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali dimostrate di seguito sono state condotte in conformità con le linee guida etiche del Comitato di revisione istituzionale della University of Michigan Medical School e del Comitato di supervisione della ricerca sulle cellule staminali pluripotenti umane. Le linee iPSC utilizzate in questo protocollo e gli esperimenti rappresentativi sono stati derivati da fibroblasti del prepuzio umano ottenuti da una fonte commerciale. I dettagli delle linee cellulari, dei reagenti e delle apparecchiature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
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Risultati
Gli assembloidi dorsali-ventrali umani sono stati placcati su una piastra MEA a 6 pozzetti (n = 6 per differenziazione, 3 differenziazioni), con ogni pozzetto contenente 64 elettrodi (Figura 2A). Nove degli assembloidi su dieci previsti per la registrazione longitudinale sono stati saldamente attaccati agli elettrodi per oltre 50 giorni in vitro (Figura 2D). 6 degli 8 assembloidi designati per i saggi farmacologici sono .......
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Discussione
Metodi basati su MEA per registrazioni elettrofisiologiche dell'attività di rete in assembloidi derivati da iPSC sono stati utilizzati per la modellazione in vitro dell'epilessia22,23. Questa piattaforma proposta che integra connessioni sinaptiche eccitatorie e inibitorie ha il potenziale per affrontare i meccanismi di ipereccitabilità neuronale e il ruolo degli interneuroni corticali nel processo di epilettogenesi. Inol.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni rilevanti.
Ringraziamenti
Questo manoscritto è stato supportato da R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). La Figura 1 è stata generata utilizzando biorender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 cm Corning Piastre di coltura non trattate con TC | Corning | 08-772-32 | Per la coltura in sospensione sull'agitatore |
| 100 mL Beaker | Fisher Scientific | FB100100 | |
| 100% Etanolo | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
| 2-Mercaptoetanolo (β-ME) | Thermo Fisher | 21985023 | Concentrazione di lavoro 100 μ Piastra |
| coltura cellulare M a 48 pozzetti | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
| Piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
| Centrifuga refrigerata Allegra X-14R | Beckman Coulter | BE-AX14R | |
| Allopregnanolone | Cayman | 16930 | sospeso 5 mg in DMSO per ottenere 1 mM di soluzione stock. Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Diluire a 1:10.000 per l'uso. Concentrazione di lavoro 100 nM. |
| Contatore di cellule automatizzato | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| Axion CytoView MEA piastre a 6 pozzetti | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
| Piattaforma Axion Maestro MEA Axion | Biosystems | Maestro Con controllo ambientale della temperatura | |
| Integratore di B-27 (regolare, con vitamina A) | Thermo Fisher | 21985023 | |
| integratore di B-27 (senza vitamina A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| Matrice di membrana basale - Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | |
| Bagno di perline | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
| Microscopio invertito da banco | Olympus | CKX53 | Tenuto in flusso laminare banco pulito |
| Bicuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | Concentrazione di lavoro 10 μ M |
| Candeggina | CLOROX | 67619-26 | |
| Tampone borato 20x | Thermo Fisher | 28341 | Concentrazione di lavoro a 1x |
| terreno BrainPhys StemCell | Technologies | 5790 | |
| Reagente di dissociazione cellulare (StemPro Accutase) | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Agitatore orbitale Celltron | HT-Infors | I69222 | |
| Detergente/enzima (Terg-A-Zyme) | Sigma-Aldrich | Z273287 | Concentrazione di lavoro 1% m/v |
| DMEM/F12 + HEPES/L-Glutammina | Thermo Fisher | 113300 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
| Dorsomorfina | Sigma-Aldrich | P5499 | Sciogliere 5 mg in DMSO per ottenere 10 mM di soluzione stock. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:2000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 5 μ M) |
| D-PBS senza calcio o magnesio | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 μ g in 1mL di PBS a 100 μ g/mL. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:5000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 ng/mL). |
| Integratore GlutaMAX | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ematocitometro | Scienze della microscopia elettorale | 63510-20 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Heraguard ECO Clean Bench | Thermo Fisher | 51029692 | |
| Incubatore per colture cellulari a umidità controllata | Thermo Fisher | 370 | impostato su 37 ° C, 5% CO2 |
| IWP-2 | Selleckchem | S7085 | Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Precipiterà se scongelato a temperatura ambiente. Le aliquote congelate devono essere inserite direttamente in 37 ° C prima dell'uso. |
| Sostituzione del siero knockout (KOSR) | Thermo Fisher | 10828010 | |
| mTeSRplus (terreno + integratori) | StemCell Technologies | 100-0276 | cGMP, terreno stabilizzato senza alimentatore per cellule iPSC umane |
| Integratore di N2 | Thermo Fisher | 17502048 | |
| Neurobasal A | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | Dissolve 100 μ g in 1mL di PBS a 100 μ g/mL. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:5000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 ng/mL). |
| NuFF Fibroblasti del prepuzio neonatale umano | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
| Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Penicilina/Streptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Pipetta (P10, P200, P1000) | Eppendorf | EP4926000034 | Puntali P1000 tagliati in autoclave per la raccolta di organoidi |
| Poly (Ethyleneimine) (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Pasta madre diluita in tampone borato sterile. Concentrazione di lavoro 0,07%. Vedi i dettagli nel manoscritto. |
| Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF) | R& D Systems | 236-EG-200 | sospeso in PBS. Aliquotare e congelare a -20 °C. |
| Fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinanti (FGF)-basic | Peprotech | 100-18B | sospeso in PBS. Aliquotare e congelare a -20 °C. |
| Fattore neurotrofico ricombinante derivato dal cervello umano (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuga brevemente prima della ricostituzione. Sciogliere 100 μ g in 1 mL di PBS a 100 μ g/mL. Aliquotare e congelare a &meno; 20 °C. Diluire a 1:5000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 ng/mL). |
| Acido retinoico (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Sciogliere 100 mg in 3,3 mL di DMSO per ottenere 100 mM di soluzione stock. Aliquotare il titolo 100 μ L/tubo e congelare a &meno; 80 °C. Prendi 200 μ L di 100 mM di stock e diluire 10 volte (aggiungere 1,8 mL di DMSO) per ottenere 10 mM di stock. Aliquot 50 μ L/tubo e conservare a &meno; 80 °C. Diluire a 1:100.000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 100 nM). |
| Inibitore ROCK Y-27632 | Tocris | 1254 | 1:200 da 10 mM stock |
| SAG (agonista levigato) | Selleckchem | S7779 | Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Concentrazione di riserva 1mM. Utilizzare a diluizione 1:10.000 (concentrazione di lavoro 100 nM). |
| SB-431542 | Tocris | 1614 | Sciogliere 5 mg in 1,3 mL di DMSO per ottenere 10 mM di soluzione madre. Aliquotare e congelare a &meno; 80 °C. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 μ M) |
| Riempitrice per pipette sierologiche | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
| Filtro superiore per tubi sottovuoto Steriflip | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
| Cappe per colture cellulari sterili | Baker Company | SG-600 | |
| Soluzione di tripano blu (0,4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermo Fisher | 25200056 | |
| Stereomicroscopio zoom | Olympus | SZ61/SZ51 | Conservato in banco pulito a flusso laminare |
Riferimenti
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
- Tanaka, Y., et al. Synthetic analyses of single-cell transcriptomes from multip....
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Ristampe e permessi
