Articolo metodologico

Colorazione viva/morta per la quantificazione di cellule vitali ma non coltivabili nei batteri che causano ferite trattati con miele di Manuka

DOI:

10.3791/67398

⸱

25 aprile 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Eastern Washington University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presentato descrive una procedura per quantificare le cellule vitali ma non coltivabili (VBNC) in colture batteriche trattate con miele di Manuka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La resistenza agli antibiotici e la tolleranza tra i batteri rappresentano una minaccia significativa per la salute globale. I meccanismi che contribuiscono alla resistenza e alla tolleranza agli antibiotici includono mutazioni genetiche e l'acquisizione di geni di resistenza e la transizione rispettivamente a stati vitali ma non coltivabili (VBNC) e ad altri stati di dormienza. Sebbene geneticamente identiche alle loro controparti non tolleranti agli antibiotici, le cellule VBNC eludono gli effetti degli antibiotici rimanendo metabolicamente inattive. Gli antibiotici sono efficaci solo quando i loro processi bersaglio, come la replicazione o la trascrizione del DNA, sono attivi. Poiché i fattori di stress ambientale, in particolare gli antibiotici, possono portare i batteri in dormienza, sono necessari antimicrobici alternativi per ridurre al minimo o prevenire questa risposta. L'antimicrobico Miele di Manuka (MH) è efficace contro molti batteri, con un raro sviluppo di resistenza. I suoi molteplici meccanismi antimicrobici lo rendono un agente prezioso per il trattamento delle infezioni batteriche. Questa ricerca ha studiato la recalcitranza dell'MH allo sviluppo della resistenza agli antibiotici testando l'ipotesi che l'MH induca meno cellule VBNC rispetto agli antibiotici convenzionali. Per indagare su questo, è stato sviluppato un protocollo per trattare i batteri patogeni Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa con concentrazioni inibitorie minime di MH o gli antibiotici convenzionali tobramicina o meropenem, che hanno poi utilizzato la conta delle piastre vitali per identificare le cellule coltivabili metabolicamente attive e la colorazione viva/morta per identificare tutte le cellule vitali. Il numero di cellule VBNC è uguale al numero di cellule vitali meno il numero di cellule coltivabili. In alcuni esperimenti, il numero di cellule coltivabili era superiore al numero di cellule vitali, dando un numero negativo di cellule VBNC; pertanto, i numeri di cellule VBNC non sono stati confrontati direttamente. Invece, sono stati confrontati i numeri di cellule coltivabili e vitali per ciascun trattamento. Solo P. aeruginosa trattata con tobramicina aveva un numero significativamente inferiore di cellule coltivabili rispetto alle cellule vitali, indicando un numero più elevato di cellule VBNC. Questo protocollo è semplice e veloce e può essere utilizzato per valutare l'induzione MH di cellule VBNC in altri batteri patogeni.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I batteri in stato di dormienza vitale ma non coltivabile (VBNC) sopravvivono al trattamento antibiotico e causano malattie infettive ricorrenti e talvolta mortali 1,2,3. Più familiare a noi è la resistenza agli antibiotici, che si verifica attraverso un cambiamento genetico ereditario4. Il cambiamento genetico fornisce resistenza a un antibiotico specifico attraverso diversi meccanismi, tra cui la limitazione dell'assorbimento di un antibiotico, l'aumento dell'efflusso dell'antibiotico, la modifica del bersaglio antibiotico o l'inattivazione dell'antibiotico4. Al contrario, i batteri in stato di dormienza mostrano una tolleranza agli antibiotici più ampia e non ereditabile riducendo il loro metabolismo 2,3. Gli antibiotici mirano a specifici processi metabolici, tra cui la replicazione del DNA e la sintesi della parete cellulare, e sono inefficaci contro le cellule VBNC metabolicamente inattive4. Le cellule VBNC esistono stocasticamente in numero ridotto insieme ai loro fratelli geneticamente identici sensibili agli antibiotici nella maggior parte delle popolazioni batteriche5. Tuttavia, i fattori di stress ambientale, tra cui l'esposizione agli antibiotici, inducono le cellule batteriche sensibili a entrare nello stato VBNC tollerante agli antibiotici 3,6. Il trattamento antibiotico ucciderà le cellule sensibili agli antibiotici all'interno della popolazione, mentre le cellule VBNC dormienti rimangono. Come suggerisce il nome, le cellule VBNC non sono coltivabili su terreni adatti alla crescita dei loro fratelli metabolicamente attivi. Tuttavia, le loro membrane e il materiale genetico non sono danneggiati e possono riprodursi 7,8. Quando gli antibiotici vengono rimossi, sono necessari stimoli specifici come i nutrienti, la temperatura o i fattori dell'ospite per risvegliare le cellule VBNC dal loro stato di dormienza e ripristinare la crescita 3,9. Le cellule VBNC sono state documentate in molte specie batteriche patogene, tra cui P. aeruginosa e S. aureus, principali agenti eziologici delle infezioni delle ferite10,11.

Il miele è stato a lungo utilizzato in applicazioni mediche, compreso il trattamento delle ferite, grazie alle sue proprietà antibatteriche12. Il miele di Manuka (MH), derivato dai fiori del cespuglio di Manuka (Leptospermum scoparium), è stato notato per la sua attività battericida ad ampio spettro (recensito in 13,14,15). Uccide con successo la maggior parte dei batteri umani che causano infezioni testati, compresi ceppi batterici come lo Staphylococcus aureus resistente alla meticillina e l'enterococcus resistente alla vancomicina che mostrano una resistenza ereditaria agli antibiotici tradizionali16,17. Inoltre, la resistenza batterica indotta all'MH è rara, essendo rilevata solo nei biofilm di P. aeruginosa esposti al miele e nell'Escherichia coli coltivati in concentrazioni crescenti di un sottogruppo del miele testato 18,19,20,21. Ciò suggerisce che i meccanismi antimicrobici dell'MH sono distinti dagli antibiotici convenzionali e possono indurre meno o nessuna cellula VBNC. Questa ipotesi è stata testata determinando l'impatto dell'MH sulle popolazioni VBNC rispetto agli antibiotici convenzionali.

Le cellule VBNC devono essere distinte dai loro fratelli coltivabili metabolicamente attivi e dalle cellule morte. Le cellule coltivabili vengono contate utilizzando la tecnica del conteggio su piastra vitale, in cui le cellule vengono trasferite in terreni di coltura di routine e incubate per un periodo sufficiente a consentire divisioni cellulari sufficienti per produrre colonie osservabili. Sono stati sviluppati diversi metodi per distinguere le cellule VBNC dalle cellule morte in base alle loro membrane intatte e alla trascrizione a basso livello. L'assorbimento del substrato e del colorante fluorescente, combinato con la microscopia o la citometria a flusso, consente il conteggio diretto delle cellule mediante microscopia o citometria a flusso con un colore che indica membrane intatte22,23. I saggi di respirazione che richiedono la presenza della catena di trasporto degli elettroni in una membrana cellulare intatta sono stati utilizzati anche per distinguere tra cellule vitali e morte24. Sono stati inoltre sviluppati metodi di PCR quantitativa (qPCR) combinati con coloranti modificanti il DNA che impediscono l'amplificazione; solo il DNA proveniente da cellule vitali sarà amplificato poiché le membrane intatte escludono il colorante25. Sebbene le cellule VBNC siano dormienti, trascrivono ancora i geni a un livello basso, e questo può anche essere utilizzato per distinguerle dalle cellule morte utilizzando la PCR26 a trascrizione inversa.

In questo lavoro, è stato sviluppato un test per quantificare le cellule VBNC in due batteri patogeni che causano ferite, S. aureus e P. aeruginosa, trattati con MH. Descrive il trattamento dei batteri con MH e antibiotici convenzionali e l'uso della conta su piastra vitale e della colorazione viva/morta per rilevare cellule coltivabili e vitali. Questo protocollo semplice ed economico consentirà l'analisi della capacità dell'MH di indurre cellule VBNC resistenti agli antibiotici in molti patogeni batterici.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poiché P. aeruginosa (ATCC9721) e S. aureus (ATCC29213) sono classificati come agenti di Biosicurezza di Livello 2, i locali in cui viene condotto il lavoro devono avere un accesso limitato ed essere dotati di una cabina di biosicurezza per manipolazioni che potrebbero creare schizzi o aerosol, come l'agitazione e la centrifugazione di colture. In tutte le fasi di questo protocollo, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti. Tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate negli esperimenti sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di brodo sterile e terreni di coltura di agar

  1. Preparare Luria Bertani e Mueller Hinton, NaCl (0,85%), antibiotici e vetreria.
    1. Preparare il terreno di coltura secondo le istruzioni del produttore, aggiungendo polvere di agar all'1,5% per il terreno di agar. Aggiungere 0,85 g di NaCl a 100 mL di dH20 per preparare NaCl 0,85%. Applicare del nastro adesivo per autoclave sui recipienti, metterli in un contenitore adatto all'autoclave e sterilizzarli in autoclave con un ciclo di liquidi adeguato ai volumi utilizzati.
    2. Al termine del ciclo in autoclave, raffreddare l'agar agar a circa 60 °C prima di versarlo in piastre di Petri sterili.
  2. Preparare 100 μg/mL di soluzioni madre degli antibiotici tobramicina e meropenem in dH2O per la diluizione e il trattamento dei batteri. Sterilizzare le scorte di antibiotici utilizzando una siringa sterile da 5 ml collegata a un filtro sterile da 0,2 μm.
    1. Conservare le scorte di antibiotici sterilizzati a -20 °C in più piccole aliquote per evitare la perdita di attività dovuta a più cicli di congelamento-scongelamento.

2. Recupero dei ceppi archiviati di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa a partire da -80 °C (Giorno 1)

  1. Raccogliere i materiali per striare una piccola aliquota dei ceppi batterici congelati dalle loro fiale di congelamento a 80 °C in agar Luria Bertani (LB). Ciò include più bastoncini di legno sterili e una piastra di agar LB etichettata con l'organismo e la data.
  2. Aprire il congelatore a -80 °C, rimuovere rapidamente le fiale di interesse e chiudere la porta del congelatore. Aprire ogni fiala in sequenza e utilizzare uno stick sterile per raschiare una piccola quantità di batteri congelati sulla piastra di agar LB opportunamente etichettata. Riposizionare il tappo del flaconcino e rimetterlo rapidamente nel congelatore a -80 °C.
  3. Incubare le piastre di agar LB inoculate, con l'agar rivolto verso l'alto, a 37 °C in condizioni aerobiche (atmosferiche) per 18-24 ore. Trascorso il periodo di incubazione, sigillare le piastre di agar LB inoculate con nastro adesivo da innesto e conservarle a 4 °C per non più di una settimana. Inoculare settimanalmente colture batteriche fresche dal brodo congelato a -80 °C, se necessario.

3. Preparazione di S. aureus e P. aeruginosa per il trattamento con il miele di Manuka (MH) e l'antibiotico (giorno 2)

  1. Raccogli i materiali necessari per iniziare una coltura di brodo LB di ciascun ceppo, tra cui piccole provette sterili, pipette sierologiche da 5 ml, brodo LB sterile e un circuito di inoculazione. Inoltre, procurati un pipettatore manuale o elettrico da utilizzare con pipette sierologiche, un bruciatore Bunsen e un'incubatrice a scuotimento.
  2. Lavorando accanto alla fiamma del bruciatore Bunsen, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire 2 mL di brodo LB in due provette sterili. Sterilizzare l'ansa di inoculazione nella fiamma del bruciatore Bunsen e quindi trasferire un quarto di ansa piena di batteri dalle piastre di agar LB alla provetta con brodo LB opportunamente etichettata.
    1. Incubare la provetta in condizioni aerobiche in un'incubatrice con agitazione (~250 giri/min) a 37 °C per 18-24 ore.

4. Preparazione di MH e messa a punto di MH e trattamenti antibiotici di S. aureus e P. aeruginosa (T = 0) (Giorno 3)

  1. Raccogli i materiali necessari per l'esperimento, tra cui il brodo Mueller Hinton e le piastre di agar, le colture batteriche del brodo LB del giorno 2, le provette sterili, le scorte di antibiotici su ghiaccio, le pipette (P20, P200 e P1000) e le punte, le provette da 15 ml, le pipette sierologiche e un pipettatore e le provette per microfuge.
    1. Preparare le soluzioni stock MH al 25% e al 50% fresche il giorno in cui viene avviato l'esperimento. In base alla densità di MH (1,47 g/mL), pesare la quantità appropriata di MH in una provetta sterile da 15 mL e aggiungere la quantità appropriata di brodo sterile Mueller Hinton. Risospendere l'MH mettendo i tubi in acqua tiepida e capovolgendoli secondo necessità.
  2. Preparare una diluizione 1:1000 (circa 106 CFU/mL) delle colture batteriche notturne in provette sterili da 15 mL aggiungendo 10 μL di coltura batterica a 10 mL di brodo Mueller Hinton.
    1. Utilizzare le colture diluite per preparare tre campioni per ciascuna specie batterica: un controllo non trattato, un campione trattato con MH (alla concentrazione minima inibitoria, MIC) e un campione trattato con antibiotici (tobramicina per S. aureus o meropenem per P. aeruginosa, al MIC).
    2. Aggiungere la coltura batterica diluita, l'MH e l'antibiotico appropriato ai campioni nei volumi indicati nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
  3. Trasferire 0,1 mL e 0,5 mL del campione non trattato in provette sterili per microcentrifuga per la conta su piastra vitale (fase 5) e la colorazione viva/morta (fase 6), rispettivamente, per i campioni T = 0.
    1. Incubare i campioni di controllo non trattati, trattati con MH e trattati con antibiotici (tobramicina o meropenem) in condizioni aerobiche a 37 °C in un incubatore vibrante (250 giri/min) per 24 ore. Eseguire le tecniche di conta su piastra vitale (fase 5) e di colorazione viva/morta (fase 6) sui campioni T= 0 non trattati.

5. Determinazione delle cellule coltivabili nei campioni utilizzando il metodo della conta su piastra vitale (giorni 3 - 5)

  1. Il giorno 4, dopo l'incubazione del campione di 24 ore, raccogliere 0,1 mL e 0,5 mL di ciascun campione in provette da microcentrifuga per la conta su piastra vitale e la colorazione viva/morta (fase 6), rispettivamente. Questi saranno i campioni T = 24 ore.
  2. Condurre la conta su piastra vitale su campioni T = 0 e T = 24 ore il giorno in cui vengono raccolti preparando diluizioni di 10 volte dei campioni vitali per la conta su piastra in brodo LB per ottenere un numero numerabile di cellule (~25-150).
    1. Distribuire 50 μl di ciascun campione diluito su 1/2 piastra di agar LB. Incubare le piastre di agar LB in condizioni aerobiche a 37 °C per 24 ore.
  3. Il giorno seguente, rimuovere le piastre di agar LB dall'incubatrice e identificare la piastra di diluizione che ha ~25-150 colonie. Contare il numero esatto di colonie sulla piastra e utilizzare la formula delle unità formanti colonie (CFU/mL= # colonie contate/ (volume piastrato, mL) (diluizione utilizzata)) per determinare il numero di cellule coltivabili per mL.
    NOTA: Il campione T = 0 sarà placcato il giorno 3 e analizzato il giorno 4; i campioni T = 24 h saranno piastrati il giorno 4 e analizzati il giorno 5.

6. Determinazione delle cellule vitali nei campioni mediante colorazione viva/morta e microscopia a fluorescenza (giorno 3 o 4)

  1. Raccogli i materiali necessari per la colorazione viva/morta, tra cui NaCl sterile allo 0,85% per mantenere un ambiente osmotico favorevole per cellule, pipette (P20, P200 e P1000) e puntali per pipette sterili, un kit di colorazione vivo/morto per batteri e un emocitometro monouso. Ottieni l'accesso a un microscopio fluorescente con un filtro per isotiocianato di fluoresceina (FITC) impostato per rilevare il colorante SYTO 9, che colora le cellule vive.
  2. Aggiungere 0,5 mL di NaCl allo 0,85% a 0,5 mL di ciascuno dei seguenti campioni vivi/morti: tutti i campioni non diluiti T = 0, T non diluiti = 24 h MH e campioni trattati con antibiotici e una diluizione 1:1000 del campione di controllo non trattato T = 24 h.
    1. Assicurarsi di moltiplicare per due la conta finale delle cellule vive di tutti i campioni e di moltiplicare per 1000 il controllo diluito T = 24 ore non trattato. Combinare 1,5 μl di SYTO 9 e 1,5 μl di ioduro di propidio per campione, quindi aggiungere 3 μl della miscela a ciascun campione. Incubare i campioni a 21 °C al buio per 15 minuti.
  3. Trasferire 6 μl di ciascun campione colorato e delicatamente miscelato in un emocitometro monouso e visualizzarlo utilizzando un microscopio a fluorescenza con filtro FITC e lente dell'obiettivo 40x. Scatta una foto che mostri sia le linee della griglia dell'emocitometro che le cellule verdi vive.
    1. Conta le celle verdi in sei campi per campione, annotando le dimensioni della griglia in modo da poter calcolare il numero di celle verdi per volume.
      NOTA: Le dimensioni del campo negli esperimenti attuali sono 1,05 mm x 0,6 mm x 0,1 mm, che corrispondono a 0,063 mm3 o 6,3 x 10-5 mL. Per ottenere il numero di cellule vitali per mL, dividere il numero di cellule vive contate per 6,3 x 10-5 mL, quindi moltiplicarle per due (o 2000 se è il controllo T = 24 h non trattato).

7. Determinazione del numero di cellule vitali ma non coltivabili (VBNC)

NOTA: Utilizzare il numero di cellule coltivabili ottenuto dalla conta su piastra vitale e il numero di cellule vitali ottenute dalla colorazione viva/morta per determinare il numero di VBNC.

  1. Calcola VBNC/mL sottraendo il numero di cellule coltivabili/mL dal numero di cellule vitali per mL.
  2. Utilizzare un test a coppie abbinate di Wilcoxon per confrontare i VBNC/mL o le cellule coltivabili/mL con le cellule vitali/mL per ciascun trattamento.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le forme di vita batteriche vitali ma non coltivabili (VBNC) sono indotte da fattori di stress, incluso il trattamento antibiotico, e causano infezioni ricorrenti a causa della loro tolleranza agli antibiotici. Poiché l'MH è un antimicrobico ad ampio spettro a cui è stata raramente rilevata resistenza, è stato ipotizzato che l'MH inducesse meno VBNC rispetto agli antibiotici convenzionali. Il metodo qui descritto è stato utilizzato per quantificare le VBNC formate da due batteri che causano ferite, S. aureus e <...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo qui descritto consente il rilevamento di popolazioni cellulari VBNC in batteri che causano ferite trattati con concentrazioni inibitorie minime (MIC) di MH e antibiotici convenzionali. Le fasi critiche del protocollo includevano la preparazione delle diluizioni MH il giorno dell'esperimento, la prevenzione della perdita di campione durante la colorazione viva/morta e il calcolo corretto del volume analizzato. Per questo e altri studi, le MIC MH per S. aureus e ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da due sovvenzioni della Eastern Washington University, la Faculty Research and Creative Works Grant ad A.R.C e la Undergraduate Research & Creative Activities Grant a L.T.B. Bill e Connie Cross hanno donato fondi a EWU per l'acquisto del microscopio a fluorescenza invertita Leica DMIL con fotocamera digitale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Mueller Hinton brodoFisher BioreagentsB12322
Luria Bertani (LB) brodo Fisher BioreagentsBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
cloruro di sodioSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramicinaSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
  Pseudomonas aeruginosaIncubatore
Eppendorfincubatore M13520000
Benchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoneyAmazonNA
DMIL microscopio a fluorescenza invertito Leica Microsystems11521265
Fotocamera digitaleLeica Microsystems12730522
provette per falco da 15 mLGenesee Scientific28-103
pipette sierologicheDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
Bruciatore BunsenFisher ScientificS48108
Pipette RaininPipette.combilancia L-20, L-200, L-1000
Mettler ToledoXS603S
a 96 pozzettiFalcon351172
ansa di inoculazioneFisher Scientific13-104-5
isopropanoloFisher ScientificBP2618-1
vetro divaricatorein casaNA
Kit di colorazione per morti vivi per batteriInvitrogenL7012
Biologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
foglio di stagnolaCostcoNA
Software per la creazione di figureGraphPadNAGraphPad Prism è stato utilizzato per la creazione di figure e l'esecuzione di analisi statistiche.
a scuotimento ATCC ATCC9721 piastra fatto Tubi per microfugi

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258(2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374(2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739(2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569(2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Trattamento con miele di Manukaresistenza agli antibioticiconta delle piastre vitaliStaphylococcus aureusPseudomonas aeruginosamicroscopia a fluorescenzaunit formanti colonie

Articoli correlati