Articolo metodologico

Imaging tridimensionale dei tessuti aortici nell'aterosclerosi

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DOI:

10.3791/67400

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25 ottobre 2024

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo protocolli ottimizzati di pulizia dei tessuti per visualizzare l'aorta murina in tre dimensioni (3D). Delineiamo procedure all'avanguardia per l'immunocolorazione, la pulizia ottica e l'imaging con l'intento di definire la prossimità anatomica del sistema nervoso periferico con le placche aterosclerotiche e l'avventizia nell'aterosclerosi.

Abstract

Recenti ricerche hanno fatto progredire la comprensione dell'aterosclerosi come una malattia infiammatoria cronica transmurale che coinvolge tutti e tre gli strati della parete arteriosa, compresa la placca intima, la media e l'avventizia, che forma il rivestimento esterno del tessuto connettivo delle arterie. I nostri studi recenti hanno suggerito che l'avventizia viene utilizzata dal sistema nervoso periferico come condotto per raggiungere tutte le cellule dei tessuti. Abbiamo anche scoperto che il sistema nervoso periferico, cioè il sistema nervoso sensoriale e simpatico, subisce importanti processi di rimodellamento che coinvolgono la neogenesi delle reti assonali adiacenti alle placche aterosclerotiche. In questo contesto, la comprensione della struttura della rete neurale e delle sue interazioni con i componenti vascolari delle arterie malate è molto promettente per una migliore comprensione della patogenesi delle malattie cardiovascolari. Per raggiungere questi obiettivi, sono necessari metodi per visualizzare l'architettura subcellulare delle arterie sane e malate intatte insieme ai compartimenti perivascolari circostanti. La pulizia dei tessuti consente l'imaging intatto dei tessuti profondi di compartimenti tissutali più grandi che altrimenti sarebbero inaccessibili. Consente l'imaging volumetrico di arterie intatte attraverso l'integrazione di strumenti di etichettatura, pulizia, imaging microscopico avanzato ed elaborazione delle immagini. Qui, descriviamo due approcci distinti ma complementari per la pulizia passiva dei tessuti, ovvero la pulizia acquosa del 2,2-tiodietanolo (TDE) e l'imaging tridimensionale abilitato dall'immunomarcatura a base di solvente della purificazione dell'organo con solvente (iDISCO) per l'imaging di segmenti aortici isolati o dell'intera aorta in situ nell'intero topo.

Introduzione

Le tecniche istologiche forniscono una comprensione di base dei campioni biologici attraverso il sezionamento di tessuti/organi. Tuttavia, la delineazione di complesse interazioni anatomiche cellula/cellula e tessuto/tessuto in tre dimansioni (3D) è stata, fino a poco tempo fa, difficile da realizzare. Questo bisogno insoddisfatto era particolarmente evidente nel contesto del sistema cardiovascolare in condizioni sane e malate. In passato, l'imaging di tessuti intatti è stato difficile a causa dell'assorbimento e della diffusione della luce, che li rendevano intrinsecamente opachi. La pulizia dei tessuti rende trasparente il campione biologico intatto riducendo al minimo queste limitazioni. I recenti sviluppi nelle tecniche di pulizia dei tessuti consentono l'imaging 3D ad alta risoluzione di tessuti trasparenti non sezionati per fornire una visione considerevole della microarchitettura cellulare e strutturale di interi organi a risoluzione micrometrica, consentendo così la definizione di reti di connettività anatomica.

L'aterosclerosi coinvolge tre strati della parete arteriosa, tra cui lo strato intimo interno, lo strato medio medio e lo strato esterno del tessuto connettivo, che è chiamato avventizia. Le placche aterosclerotiche nello strato interno delle arterie sono state un obiettivo convenzionale della ricerca per decenni 1,2. Tuttavia, lo strato avventizio contiene vasi sanguigni, vasi linfatici e fibre nervose del sistema nervoso periferico. Inoltre, l'avventizia è collegata al tessuto adiposo perivascolare e ai componenti del tessuto neuronale, compresi i nervi periferici e i gangli perivascolari 3,4. È noto che i nervi periferici utilizzano l'avventizia come condotti per raggiungere i tessuti bersaglio distanti e, in effetti, le cellule5. I nostri studi recenti hanno fatto avanzare i progressi nella comprensione delle interazioni a più livelli dei principali sistemi biologici, che includono il sistema immunitario, il sistema nervoso e il sistema cardiovascolare. Abbiamo chiamato queste interazioni interfacce neuroimmunitarie-cardiovascolari 6,7. Durante l'aterogenesi, i componenti della parete arteriosa subiscono una robusta ristrutturazione e rimodellamento. Ad esempio, adiacente alla progressione della placca aterosclerotica nell'intima, si formano aggregati di cellule immunitarie e la neogenesi degli assoni neuronali si verifica nell'avventizia aortica murina 6,8,9. Con il progredire dell'aterosclerosi, gli aggregati di cellule immunitarie si sviluppano in organi linfoidi terziari arteriosi (ATLO) ben strutturati con aree distinte di cellule T, cellule B e plasmacellule10. Tuttavia, delineare questi cambiamenti in 3D, l'imaging ad alta risoluzione del tessuto intatto è stato difficile a causa dell'insufficiente permeabilizzazione della membrana e della diffusione intrinseca della luce11. Gli approcci di pulizia tissutale hanno superato i principali limiti degli approcci istologici convenzionali 11,12,13,14,15 con una maggiore penetrazione degli anticorpi per raggiungere in profondità i tessuti o gli organi intatti regolando uniformemente l'indice di rifrazione (RI), portando a immagini con risoluzione micrometrica con una maggiore profondità di imaging nei voxel. Le RI dei campioni possono essere abbinate al glicerolo (RI 1.46) o all'olio da immersione (RI 1.52), riducendo così notevolmente la dispersione della luce e le aberrazioni sferiche, consentendo un'alta risoluzione. Recenti progressi nelle tecniche di pulizia dell'intero organo o dell'intero corpo di tessuto, come il 2,2-tiodietanolo a base acquosa (TDE) e l'imaging 3D di organi purificati con solvente (iDISCO) abilitati dall'immunomarcatura, insieme alle tecniche di imaging volumetrico (tra cui l'imaging confocale, multifotonico e al microscopio a foglio di luce) hanno permesso di ricostruire la microanatomia dell'architettura vascolare costruendo il loro atlante di connettività11,16. La visualizzazione di queste connessioni cellulari e strutturali in 3D può fornire nuove intuizioni per rispondere a domande biologiche finora senza risposta.

Protocollo

Il presente studio è stato condotto secondo le linee guida del comitato locale e nazionale per l'uso e la cura degli animali. Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi iperlipidemici Apoe-/- su sfondo C57BL/6J mantenuti con una dieta standard per roditori che sviluppano spontaneamente l'aterosclerosi durante l'invecchiamento.

1. Imaging a montaggio intero dell'aorta isolata e della pulizia TDE

  1. Preparazione dei tessuti
    1. Preparare l'anestetico a 150 mg/kg di ketamina e 30 mg/kg di xilazina (vedere la tabella dei materiali) per topo. Anestetizzare profondamente i topi mediante iniezione intraperitoneale e confermarlo con la mancanza di reazione al test del dolore profondo.
      NOTA: La concentrazione e il volume di iniezione sono i seguenti: ketamina 100 mg/mL; Xilazina 20 mg/mL; Volume di iniezione 50:50 miscela in volume di ketamina e xilazina a 3 μL/g.
    2. Posiziona il mouse su una piastra di schiuma ricoperta di carta assorbente chirurgica e fissa braccia e gambe in posizione supina con del nastro adesivo. Disinfettare il torace con etanolo al 75% (vedere Tabella dei materiali) e prelevare il sangue attraverso il ventricolo sinistro con una siringa monouso da 1 ml per rimuovere il sangue per una migliore perfusione.
      NOTA: È possibile utilizzare anche il prelievo di sangue cardiaco tramite toracotomia.
    3. Praticare un'incisione sulla linea mediana sul torace per esporre il cuore e una piccola incisione nell'atrio destro per consentire la perfusione transcardiaca. Perfondere il topo attraverso il ventricolo sinistro con 10 mL di acido etilendiamminetraacetico 5 mM (EDTA; vedere Tabella dei materiali) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti, seguiti da 20 mL di PBS per 5-10 minuti fino a quando il sangue non viene espulso. Infine, perfondere con 10 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti.
      NOTA: Tutte le procedure possono essere eseguite con una pompa di perfusione peristaltica con pressione di 100-125 mm Hg a temperatura ambiente (RT). L'ago di perfusione viene inserito nel cuore del topo attraverso lo stesso foro dell'estrazione del sangue.
    4. Rimuovere gli organi interni, tra cui milza, fegato, polmone e organi gastrointestinali e riproduttivi, utilizzando strumenti chirurgici. Mantenere intatti il cuore, l'aorta e i reni in situ.
      NOTA: Gli strumenti chirurgici utilizzati per la dissezione e la rimozione degli organi sono le forbici da dissezione, le forbici dell'iride fine, le forbici a molla, le pinze smussate, le pinze curve e le pinze fini curve.
    5. Esporre l'intera aorta dall'aorta ascendente alla biforcazione iliaca sotto lo stereomicroscopio da dissezione (ingrandimento 30-40x). Rimuovere con cura il timo e il tessuto adiposo senza ferire l'aorta.
      NOTA: Fare attenzione a non tagliare l'aorta. Per i topi Apoe-/- , mantenere il tessuto adiposo perivascolare circondato minimo dell'aorta per la struttura collegata.
    6. Raccogli l'intera aorta in una capsula di Petri riempita di PBS. Separare l'aorta in diversi segmenti e dividere l'intera aorta longitudinalmente utilizzando un'iride o una forbice a molla per esporre la superficie intimale seguendo la sequenza e la direzione indicate nella Figura 1A per la pulizia TDE.
    7. Appuntare l'aorta en face sulla lastra di cera nera piatta a forma di Y, come indicato nella Figura 1A. Postfissarlo in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
      NOTA: Fissare l'aorta alla piastra di cera prima del fissaggio per evitare che si pieghi e si arricci nei passaggi successivi.
    8. Sganciare l'aorta e trasferirla nel PBS. Lavare accuratamente l'aorta per 5 minuti per 5 volte.
      NOTA: Trasferire l'aorta in diversi tubi riempiti di PBS ogni volta per il lavaggio.
  2. Colorazione degli anticorpi per l'aorta en-face
    NOTA: Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite in provette da 2 mL con chiusura di sicurezza con rotazione delicata o agitazione a RT.
    1. Trasferire l'aorta fissa in una soluzione bloccante per 2 ore per il blocco e la permeabilizzazione.
      NOTA: La soluzione bloccante varia in base agli anticorpi primari e secondari. Ad esempio, soluzione bloccante: 0,5 mg/mL CD16/32 (1:100), 10% siero d'asina normale, 2% Triton X-100 in PBS (vedi Tabella dei materiali)
    2. Incubare l'aorta con gli anticorpi primari nella soluzione bloccante sopra descritta (passaggio 1.2.1), ad esempio CD3e (diluizione 1:100), NF200 (diluizione 1:200) e B220 (diluizione 1:200) per 24 ore (vedere la Tabella dei materiali). Lavare l'aorta in PBS per 5 minuti per 5 volte.
    3. Incubare l'aorta con anticorpi secondari in siero d'asino normale al 10% (diluizione 1:300) e 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1 mg/mL) per la colorazione nucleare durante la notte (vedere la Tabella dei materiali). Lavare l'aorta in PBS per 5 minuti 5 volte e conservare l'aorta in PBS a 4 °C fino alla procedura di pulizia dei tessuti.
      NOTA: Trasferire l'aorta in diversi tubi riempiti di PBS ogni volta per il lavaggio. Copri i tubi con un foglio di alluminio per tenerli al buio per il passaggio 1.2.3.
  3. Pulizia dei tessuti TDE
    NOTA: Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite in provette da 2 mL con chiusura di sicurezza, che ruotano delicatamente a RT e coperte con un foglio di alluminio al buio. Le soluzioni di lavoro TDE (vedi Tabella dei materiali) sono altamente permeabili e devono essere maneggiate con cura in una cappa aspirante. Raccogliere e smaltire i rifiuti secondo le normative locali.
    1. Trasferire l'aorta colorata in soluzioni di lavoro al 20% di TDE e incubare per 1 ora.
    2. Trasferire l'aorta in soluzioni di lavoro al 47% di TDE e incubare per 12 ore. Trasferire l'aorta in soluzioni di lavoro al 60% di TDE e incubare per 24-36 ore fino a quando i campioni diventano trasparenti alla luce visibile per corrispondere al RI.
    3. Conservare l'aorta in TDE al 60% a RT al buio fino all'imaging.
      NOTA: Aggiornare le soluzioni funzionanti ogni 30 minuti per il breve periodo di incubazione (ad esempio, passaggio 1.3.1) e ogni 4 ore per il lungo periodo di incubazione (ad esempio, passaggio 1.3.2). Il tempo di incubazione per ogni fase può essere regolato in base alle dimensioni del tessuto per ottenere una migliore penetrazione degli anticorpi o una trasparenza di eliminazione. Per l'aorta di topo Apoe-/- circondata da tessuto adiposo, il tempo di incubazione deve essere adeguatamente prolungato.
  4. Imaging dell'aorta che chiarisce il TDE utilizzando il microscopio a scansione laser confocale (CLSM)
    1. Utilizzare pozzetti distanziatori rettangolari adesivi su entrambi i lati disponibili in commercio con uno spessore di 0,2 mm (vedere la Tabella dei materiali). Attaccare il pozzetto su un vetrino pulito e trasferire l'aorta liberata. Assicurarsi che l'avventizia aortica sia rivolta verso il vetrino coprioggetti.
      NOTA: Picchiettare delicatamente l'aorta en face con il lato abluminale dell'aorta en face in alto utilizzando una pinza angolata. Se necessario, impilare più pozzetti distanziatori per immagini in modo che corrispondano alle dimensioni del tessuto.
    2. Montare l'aorta con gocce di soluzione di TDE al 60%. Fissare con cura un vetrino coprioggetti al pozzetto, evitando bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti.
      NOTA: Rimuovere con cautela le bolle con un ago prima del vetrino coprioggetti. Non utilizzare una quantità eccessiva di soluzione di montaggio, poiché il campione potrebbe galleggiare.
    3. Utilizzare uno strumento CLSM invertito (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo a immersione (multiplo) 20x (NA: 0,75).
      NOTA: Il CLSM consente l'imaging volumetrico fino a 70 μm di profondità con una risoluzione più elevata, necessaria per l'analisi del diametro del nervo e dell'interazione nervo-cellula immunitaria nell'avventizia aortica.
    4. Selezionare l'obiettivo a immersione (olio) 20x/0,75. Sintonizzare i rilevatori a diodi ibridi in base ai coloranti colorati. Regolare le impostazioni di visualizzazione e selezionare il formato XY 1024 x 1024 pixel per l'imaging.
      NOTA: Un obiettivo a immersione in olio cattura i segnali meglio dell'acqua.
    5. Far cadere l'olio da immersione (con glicerolo) in modo uniforme lungo l'aorta sul vetrino coprioggetti. Spostare grossolanamente l'obiettivo 63x verso il campione fino a toccare l'olio da immersione/vetrino coprioggetti.
    6. Spostare l'obiettivo 63x sotto il microscopio per individuare la regione di interesse. Acquisizione di Z-stack dal lato avventizio dell'aorta en face con incrementi di 2-4 μm fino a 60 μm di profondità per l'imaging 3D.
    7. Assegna un nome al file con i dettagli del campione, i dettagli della scansione e salva i dati.
  5. Imaging dell'aorta di pulizia TDE utilizzando un microscopio multifotone
    1. Seguire i passaggi 1.4.1-1.4.2 per montare l'aorta en face sul vetrino.
    2. Utilizzare un microscopio multifotone verticale (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo 20x (immersione in acqua, NA: 1,00, distanza di lavoro = 2 mm), che consente l'imaging volumetrico fino a 1,5 mm di profondità.
    3. Acquisizione di Z-stack dal lato abluminale con passo di 10-15 μm fino a 700 μm di profondità. Assegnare un nome al file e salvare i dati come indicato nel passaggio 1.4.7.

2. Immunocolorazione di tutto il corpo e pulizia dei tessuti iDISCO

  1. Preparazione dei tessuti
    1. Seguire i passaggi 1.1.1-1.1.3 sopra per l'anestesia, il fissaggio del mouse e la perfusione.
    2. Rimuovere la pelle e gli organi interni, tra cui milza, fegato, polmone e organi gastrointestinali e riproduttivi, utilizzando strumenti chirurgici. Mantenere intatti il cuore, l'aorta e i reni in situ.
    3. Sezionare la parte del corpo al di sopra del livello del diaframma e fissare la parte inferiore del corpo con PFA al 4% per 1-2 giorni a 4 °C.
      NOTA: Eseguire la fissazione, i lavaggi e le incubazioni in provette da 50 mL su uno shaker che ruota delicatamente. Rinfrescare la soluzione in nuove provette per 2-3 volte.
    4. Lavare accuratamente il campione per 10 minuti 3 volte a RT.
      NOTA: Trasferire ogni volta l'aorta in diversi tubi riempiti di PBS.
    5. Incubare il campione in una soluzione di imaging cervello/corpo al 20% chiara e non ostruita e in una soluzione di analisi computazionale (CUBIC) per 48 ore per la decolorazione.
      NOTA: Per una soluzione cubica al 20%, sciogliere 25 g di urea in 15 mL di Triton X-100 e 28 mL di Quadrol e aggiungere PBS al volume finale di 100 mL. Prepararlo nella cappa poiché gli ingredienti sono stimolanti (vedi Tabella dei Materiali).
    6. Lavare accuratamente il campione per 1 ora cinque volte in PBS a RT.
  2. Colorazione degli anticorpi
    NOTA: Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite in provette da 50 mL con rotazione delicata o agitazione a 4 °C.
    1. Incubare il campione in una soluzione di PBS-gelatina-Triton X-100-siero (PGST) per una notte per la permeabilizzazione e il blocco.
      NOTA: La soluzione bloccante varia in base agli anticorpi. Ad esempio, soluzione bloccante: PBS-gelatina-Triton X-100-siero (PGST, vedere Tabella dei materiali) soluzione: 0,2% di gelatina per pelle suina, 0,5% di Triton X-100 e 5% di siero di capra in PBS.
    2. Incubare il campione con anticorpi primari in soluzione PGST, ad esempio NF200 (diluizione 1:200, vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C, e agitare delicatamente per 10-12 giorni. Quindi, lavare accuratamente il campione in PGST per 1 ora e 5 volte a RT.
    3. Incubare il campione con una soluzione di anticorpi secondari (diluizione 1:300) e DAPI (1 mg/mL) in PGST a 4 °C per 7 giorni.
    4. Lavare accuratamente il campione in PGST per 1 ora e 5 volte in RT. Trasferire il campione in PBS e conservare l'aorta in PBS a 4 °C per ulteriori passaggi.
      NOTA: Coprire i tubi con un foglio di alluminio per mantenerli scuri per i passaggi 2.2.3-2.2.4.
  3. Pulizia dei tessuti iDISCO modificata
    NOTA: Durante lo svuotamento, i tubi devono essere coperti con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento/spegnimento del segnale dovuto all'esposizione diretta alla luce naturale/artificiale. Tutti i reagenti organici utilizzati nella pulizia DISCO sono dannosi e tutte le fasi di pulizia devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare un camice da laboratorio, guanti e una maschera quando si maneggiano i reagenti per evitare l'inalazione e il contatto con la pelle e gli occhi. Raccogliere e scaricare i rifiuti di sgombero negli appositi contenitori per rifiuti nel cofano.
    1. Trasferire i campioni colorati dal passaggio 2.2.4 a una serie di concentrazioni aumentate di tetraidrofurano (THF, vedere Tabella dei materiali) soluzioni di lavoro per la disidratazione, ovvero 50%, 70%, 90% e 100% (due volte il 100%). Incubare per 12 ore per concentrazione.
      NOTA: Diluire il reagente THF (99%-100%) in acqua distillata per soluzioni di lavoro di diverse concentrazioni nella cappa. Aggiorna le soluzioni di lavoro ogni 6 ore.
    2. Trasferire il campione in una soluzione di diclorometano assoluto (DCM, vedere Tabella dei materiali) per 3 ore per la rimozione dei lipidi.
    3. Trasferire il campione nella soluzione di lavoro BABB (benzil-alcol-benzil-benzoato) compatibile con RI (vedere la Tabella dei materiali). Incubare per 3-6 ore fino a quando il tessuto è traslucido e per lo più trasparente alla luce visibile.
      NOTA: Per preparare la soluzione di lavoro BABB, mescolare 1 parte di alcol benzilico e 2 parti di benzoato di benzile (1:2) in una bottiglia di vetro. Agitare delicatamente per 5 minuti nella cappa.
  4. Imaging del tessuto di pulizia iDISCO utilizzando un microscopio a foglio luminoso
    NOTA: Acquisire l'immagine del campione cancellato non appena si ottiene una trasparenza ottimale. Per l'imaging viene utilizzato un microscopio a foglio luminoso, come un ultramicroscopio-II (vedi Tabella dei materiali). Riempire il serbatoio di imaging con la soluzione di pulizia finale, la soluzione BABB. Fare attenzione a non versare BABB sullo strumento per evitare danni allo strumento.
    1. Utilizzare un obiettivo pneumatico 1x per immagini a basso ingrandimento che coprono l'intera larghezza dell'intero campione. Trasferire delicatamente il campione dalla soluzione di chiarificazione su un panno di carta e asciugarlo brevemente.
      NOTA: Utilizzare una pinza smussata per evitare di schiacciare il campione.
    2. Selezionare un portacampioni di dimensioni adeguate in base alle dimensioni del campione/tessuto e fissare il lato posteriore del campione al supporto del campione con la supercolla.
      NOTA: Attendere 1-2 minuti fino a quando il campione non è saldamente fissato al supporto del campione.
    3. Riempire il serbatoio di imaging del microscopio a foglio luminoso con la soluzione BABB e posizionare delicatamente il campione al suo interno. Regolare il portacampioni per assicurarsi che il campione sia perpendicolare al foglio luminoso e illuminato correttamente.
    4. Abbassare l'obiettivo per mettere a fuoco il campione e regolare le impostazioni di visualizzazione durante la messa a fuoco per visualizzare correttamente il campione. Selezionare i fogli luminosi appropriati nel software del microscopio e regolarne la larghezza per illuminare uniformemente l'intero campo visivo.
      NOTA: In un sistema a ultramicroscopio con illuminazione laser su entrambi i lati, iniziare allineando e focalizzando il laser su un lato. Una volta impostati entrambi i lati, attivare entrambi i laser laterali per osservare un'immagine di scansione unita da entrambe le illuminazioni.
    5. Selezionare un canale rosso lontano (680 nm) per visualizzare le strutture neuronali colorate con NF200 e un canale di autofluorescenza (488 nm) per visualizzare l'aorta e i tessuti connettivi non colorati. Regolare la potenza del laser in base all'intensità del segnale fluorescente per un rapporto segnale/rumore ottimale, al tempo di esposizione e alla larghezza del foglio o dei fogli luminosi.
    6. Selezionare la modalità di scansione x-y-z. Impostare la scansione z-stack con un passo z di 2-8 μm e selezionare la sovrapposizione del 25%-60% lungo l'asse y longitudinale delle scansioni tile (16 bit) che copre le superfici ventrali e dorsali dei campioni per visualizzare l'intero volume del campione (fino a 6-8 mm di profondità).
    7. Assegna un nome alla scansione con informazioni dettagliate, tra cui la data della scansione, il nome del campione, l'anticorpo utilizzato, l'obiettivo, il fattore di zoom, i passi z e i laser utilizzati. Salvare i dati.
    8. Passa a un ingrandimento maggiore (2x o 4x) tramite la funzione di zoom per visualizzare specifiche regioni del corpo di interesse.
    9. Seguire i passaggi 2.4.4-2.4.7 sopra per l'imaging e salvare i dati.

3. Elaborazione e analisi delle immagini

NOTA: Per l'elaborazione è necessaria una workstation di elaborazione ad alta potenza. Garantire il backup dei dati immediatamente dopo l'elaborazione a causa dell'elevato volume di imaging (5-100 GB per immagine).

  1. Elaborazione di immagini CLSM e multifotone
    1. Carica le immagini affiancate Z-stack da microscopi CLSM e multifotone sulla workstation di elaborazione delle immagini dotata di software Las X, Imaris (software di analisi delle immagini) o Fiji per la visualizzazione, la segmentazione e la quantificazione 3D e bidimensionale (2D).
    2. Per codificare a colori la profondità del volume di una cella o di una struttura, utilizzare un software di ripristino dell'immagine (vedere la Tabella dei materiali) per deconvoluzione dell'immagine grezza e generare una proiezione di massima intensità dei dati deconvoluti utilizzando la codifica temporale a colori a Las X o nelle Figi.
  2. Elaborazione delle immagini di fogli leggeri
    1. Carica la serie di immagini TIFF affiancate Z-stack nel software Fiji. Unisci le immagini con il plug-in di cucitura delle Fiji e salva le immagini cucite in formato TIFF.
      NOTA: Se necessario, comprimere le immagini unite in formato LZW per consentire un'elaborazione rapida con diversi software.
    2. Caricare le immagini unite nel software di visualizzazione 3D (vedere Tabella dei materiali) per la segmentazione delle immagini. Tracciare manualmente le strutture neuronali e vascolari sull'asse x-y-z. Per il tracciamento manuale di piccole fibre nervose, selezionare manualmente i segnali NF200+ pixel per pixel in ogni piano z lungo l'intero percorso della fibra nervosa tra l'aorta e i gangli.
    3. Carica le immagini pre-elaborate nel software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali) per la generazione di video, la visualizzazione 2D e 3D delle immagini.
    4. Utilizzare l'autofluorescenza per segmentare l'aorta e i tessuti connettivi, compresi i linfonodi e i muscoli, nel software di analisi delle immagini. Applica pseudocolori separati nel software di analisi delle immagini per visualizzare segmenti aortici distinti come la parete aortica e la placca.
    5. Utilizzare la funzione di equalizzazione adattiva dell'istogramma a contrasto limitato (CLAHE) nel software Fiji per migliorare il contrasto locale sullo sfondo delle immagini elaborate.

Risultati

Per dimostrare la microanatomia dell'aorta sana e malata intatta e per rivelare le connettività fisiche tra il sistema immunitario, il sistema nervoso e il sistema cardiovascolare in modelli murini di aterosclerosi, abbiamo utilizzato due approcci complementari di pulizia tissutale: la pulizia TDE dell'aorta isolata e la pulizia iDISCO dell'intero topo (Figura 1). Dopo l'immunocolorazione a montaggio intero, l'aorta frontale è stata ripulita con una serie di soluzioni di lavoro TDE. L'RI viene abbinato a 1,4-1,5, a seconda della concentrazione di TDE del passaggio finale, per ottenere una trasparenza ottimale del tessuto aortico senza modificarne il volume (Figura 1A). A differenza della chiarificazione TDE, il protocollo di chiarificazione iDISCO include le fasi di decolorazione e permeabilizzazione prima dell'immunocolorazione a montaggio intero, seguite da delipidazione e disidratazione utilizzando diversi solventi chimici e la corrispondenza dell'RI a 1,56 (Figura 1B). La pulizia iDISCO consente la visualizzazione di tessuti di grandi dimensioni e persino dell'intero corpo del topo a causa del restringimento del tessuto.

L'imaging 3D confocale e multifotone dell'intera aorta en face a montatura liberata da TDE consente la visualizzazione delle strutture, comprese le placche intimali, la cellularità dell'avventizia e le proiezioni neuronali dell'avventizia tra le altre strutture, mentre l'imaging a foglio luminoso del topo cleared iDISCO consente la visualizzazione e la ricostruzione dell'albero arterioso insieme al tessuto adiposo perivascolare, ai linfonodi renali e ai componenti neurali associati, inclusi nervi e gangli (Figura 1C). Ad esempio, l'imaging confocale dell'aorta aterosclerotica liberata da TDE ha rilevato più cellule T colorate con CD3e nella placca e un'estesa neogenesi di fibre nervose colorate con NF200 di diverso diametro negli ATLO, mentre l'imaging multifotone dell'aorta addominale malata dell'intera montatura TDE da topi Apoe-/- invecchiati ha mostrato la territorialità della germinazione dell'assone che esprime NF200 nelle aree delle cellule T B220 negative all'interno degli ATLO (Figura 2A). Al contrario, l'imaging a foglio luminoso dell'intero addome di topo iDISCO ha visualizzato la relazione spaziale tra l'aorta e i gangli simpatici adiacenti. La segmentazione dell'immagine 3D e il tracciamento dei singoli assoni dai gangli alla superficie aortica hanno rivelato una robusta ristrutturazione neuronale, compresi gli assoni colorati con NF200 di nuova formazione nell'avventizia dell'aorta adiacente alla placca aterosclerotica (Figura 2B).

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Figura 1: Flusso di lavoro dello studio. (A) Pulizia TDE a base acquosa dell'aorta en frontale . (B) Pulizia iDISCO a base di solvente dell'intero topo. (C). 3D l'imaging volumetrico e l'elaborazione delle immagini di aorta isolata otticamente chiarita o di campioni interi di topo.Questa figura è stata modificata con il permesso di Sun et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Esempio di immagini 3D di tessuti puliti TDE e iDISCO. (A) Imaging 3D di TDE liberato all'aorta facciale . Pannello superiore: le immagini confocali hanno mostrato cellule T CD3e+ (rosso, freccia) nella placca intimale e assoni nervosi NF200+ (verde) nell'avventizia dell'aorta aterosclerotica (ATLO); Pannello inferiore: le immagini multifotoniche hanno mostrato assoni nervosi NF200+ (verdi, punte di freccia), cellule B B220+ (rosso, triangolo aperto), generazione di seconda armonica derivata dal collagene (SHG, bianco) in ATLO di topi maschi Apoe-/- di 78 settimane. Sytox (blu) e DAPI (blu) hanno mostrato i nuclei. (B) Immagini 3D ricostruite e segmentate dell'intero addome di topo ripulito da iDISCO. Ricostruzione, segmentazione e tracciamento 3D light-sheet di nervi e assoni NF200+ (frecce, verde) e la loro relazione spaziale con i gangli simpatici (punte di freccia) dell'aorta addominale intatta. Il triangolo aperto indicava un assone di nuova formazione adiacente alle placche aterosclerotiche. L'autofluorescenza (auto) è stata utilizzata per visualizzare l'aorta e il tessuto connettivo, compresa la placca (ciano) e il linfonodo renale (RLN, blu). CG, gangli celiaci, SycG, gangli della catena simpatica. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Mohanta et al.6 e Sun et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'aterosclerosi può essere vista come una malattia infiammatoria transmurale delle arterie che coinvolge tutti e tre gli strati della parete arteriosa. Inoltre, le arterie sono circondate dai tessuti adiposi e neuronali perivascolari. Durante la progressione dell'aterosclerosi, ciascuno di questi tessuti subisce notevoli alterazioni cellulari e strutturali, che richiedono metodi per acquisire l'accesso ottico subcellulare ai tessuti intatti che circondano le arterie sane e malate. Questi metodi sono qui forniti per comprendere meglio le interazioni cellula-cellula e cellula-tessuto e per far progredire la comprensione della patogenesi delle malattie cardiovascolari. La pulizia dei tessuti e la successiva imaging microscopico 3D consentono l'imaging di compartimenti tissutali intatti su larga scala, finora inaccessibili, rivelando ricostruzioni dettagliate delle arterie. Qui, introduciamo protocolli per le tecniche di pulizia tissutale TDE e iDISCO, evidenziando la loro efficacia e semplicità nel raggiungere una trasparenza tissutale quasi completa, un imaging efficiente con microscopia confocale/multifotone o a foglio di luce e, allo stesso tempo, mantenere l'integrità strutturale.

La chiarificazione TDE utilizza un reagente solubile in acqua per ottenere la trasparenza dei tessuti regolando l'IR, preservando così efficacemente i segnali di fluorescenza nel tessuto. Rappresenta un metodo efficiente per la pulizia dei tessuti per vasi sanguigni di dimensioni più piccole, ovvero un volume di tessuto di dimensioni da micrometriche a millimetriche senza restringimento dei tessuti. Tuttavia, richiede un tempo di lavorazione più lungo per tessuti più grandi, ovvero volumi di tessuto di dimensioni millimetriche o centimetriche. È importante sottolineare che la procedura può essere adattata alle esigenze dell'utente regolando la concentrazione dei reagenti e il tempo di incubazione. D'altra parte, iDISCO utilizza una serie di solventi organici per rimuovere i lipidi e l'acqua, portando a una migliore trasparenza dei tessuti più grandi, di interi organi o dell'intero topo o di tessuti umani più grandi. Offre i vantaggi unici di tempi di lavorazione brevi e idoneità per grandi volumi di tissue. Tuttavia, porta al restringimento dei campioni chiariti, all'estinzione dei segnali di fluorescenza e alla rimozione dei lipidi, che è una delle principali limitazioni per i tessuti aterosclerotici ricchi di lipidi. Inoltre, la microscopia a foglio luminoso, a differenza della microscopia confocale o multifotonica, non è in grado di visualizzare i dettagli subcellulari a livello micrometrico e di visualizzare proiezioni neuronali di piccolo diametro, come i singoli assoni e le loro connessioni con altre cellule vascolari.

L'innervazione vascolare svolge un ruolo significativo nello sviluppo dell'aterosclerosi 6,7,18. Studiare la distribuzione dei nervi periferici lungo l'albero arterioso e le loro alterazioni aiuterà a comprendere la progressione della malattia. Grazie alla sua efficiente capacità di elaborazione, iDISCO è comunemente utilizzato per l'imaging dell'intera rete vascolare in modelli di aterosclerosi in ratti e topi 12,19,20,21, fornendo immagini tridimensionali ad alta risoluzione. La TDE, d'altra parte, è adatta per studi che richiedono la conservazione di etichette fluorescenti, come l'osservazione di specifici marcatori neuronali, rivelando così con precisione la struttura fine e i cambiamenti nell'innervazione vascolare6. Entrambi i protocolli di pulizia dei tessuti sono necessari poiché la pulizia TDE non comporta il restringimento e può visualizzare i lipidi, mentre iDISCO porta al restringimento dei tessuti a causa della disidratazione e della delipidazione. Inoltre, il protocollo iDISCO modificato può essere utilizzato per la pulizia dei tessuti cardiovascolari umani22,23. Entrambe le tecniche di pulizia offrono vantaggi complementari allo studio del rimodellamento arterioso nell'aterosclerosi. Combinando i punti di forza di entrambi i metodi, è possibile ottenere una comprensione più completa e approfondita dei meccanismi patologici dell'aterosclerosi.

Dichiarazioni

SKM, CJY e AJRH sono cofondatori di Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) SFB1123/Z1, dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK) DZHK 81X2600282 e da una sovvenzione della fondazione Corona (S199/10087/2022) a SKM; e ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 e una sovvenzione governativa ad AJRH presso Easemedcontrol R & D GmbH and Co. KG.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,2'-tiodietanolo (TDE)Sigma 166782Reagente di chiarificazione
AmiraThermo Fisher ScientificSoftware di visualizzazione 3D; Software di elaborazione delle immagini utilizzato per la segmentazione manuale e il tracciamento in immagini 3D
Alcool benzilicoSigma W213713Reagente di chiarificazione
Benzil benzoatoSigmaB6630Reagente di chiarificazione
CD16/32eBioscience14-0161-82Soluzione bloccante
Microscopio a scansione laser confocale Leica MicrosystemsTCS-SP8 3XDispositivo di imaging per l'imaging multidimensionale ad alta risoluzione di tessuti biologici intatti o sezioni con elevata specificità a risoluzione subcellulare.
DAPIInvitrogenD3571Marcatori di nuclei
Diclorometano (DCM)Sigma 270997Reagente di
pulizia Cera pan-black dissezione Thermo Scientific S17432Dissezione e fissazione dell'aorta 
Stereomicroscopio di dissezioneLeica Microsystems Stemi 2000Dissezione organistica del topo
Etanolo SigmaE7023Defezione 
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Roth8040.1Tampone di perfusione 
Figi (ImageJ, NIH)Software di elaborazione delle immagini open source per immagini 2D e 3D
Capra anti-criceto IgG, Cy3Dianova 127-165-099Anticorpo secondario
Capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Anticorpo secondario 
Capra anti-ratto IgG, Cy5Dianova712-175-150Anticorpo secondario
Hamster Anti-CD3e BD Bioscienze145-2C11 Marcatore cellulare Pan-T
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, Paesi BassiVersione 19.10Software per il restauro delle immagini; Software di elaborazione immagini utilizzato principalmente per la deconvoluzione di immagini 2D e 3D
Stazione di elaborazione immaginiMIFCOM MIFCOM X5Stazione di elaborazione immagini dotata di tutti i software di elaborazione delle immagini, tra cui la suite di applicazioni Leica X, Fiji e Imaris per la post-elaborazione delle immagini acquisite da microscopi confocali, multifotone e a foglio di luce Software
ImarisBitplaneversione 8.4; Software di elaborazione delle immagini utilizzato per la segmentazione automatizzata delle immagini 3D
Incubatore e rotatoreMarshall Scientific Innova 4230Dispositivo di incubazione e rotazione durante la pulizia dei tessuti
iSpacerSunjin LabIS4020Pozzetto rettangolare come il supporto del campione
KetaminaLivistoAnestetico
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica MicrosystemsVersione 3.5Software di elaborazione delle immagini per le immagini acquisite con il microscopio Leica
Microscopio otticoLeica MicrosystemsDM LBDispositivo di imaging per immagini luminose
Microscopio a fogli luminosiLaVision BioTechUltramicroscope IITecnica di imaging per l'imaging rapido e ad alta risoluzione di campioni biologici di grandi dimensioni o di topi interi con scarsa esposizione alla luce mediante l'acquisizione rapida di immagini di sezioni ottiche sottili.
Microscopia multifotoneLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Modalità di imaging per l'imaging multidimensionale ad alta risoluzione di tessuti biologici intatti e vitali a livello subcellulare e molecolare per periodi di tempo prolungati, in profondità nel campione e con un'invasione minima.
Siero di capra normale SigmaG9023Soluzione bloccante
Paraformaldeide (PFA) Sigma P-6148 Fissaggio 
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma P4417-100TAB Tampone di lavaggio
Gelatina per pelli suineSigmaG1890Tampone di incubazione
QuadrolSigma122262reagente di chiarificazione CUBIC
Rabbit Anti-NF200SigmaN4142Marcatore pan-neuronale
Rat Anti-B220 BD BioscienceRA3-6B2Marcatore cellulare Pan-B
SaccarosioSigma90M003524V Disidratazione 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Marcatore di nuclei
TetraidrofuranoSigma 401757Reagente di pulizia 
Triton X-100Roth3051.1
Penetrazione Urea Sigma U5128CUBIC reagente di chiarificazione
xileneFisher Chemical x/0250/17 Anestetico 
di analisi delle immagini

Riferimenti

  1. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
  5. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).
  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
  8. Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity. Front Immunol. 10, 1101(2019).
  9. Newland, S. A., et al. Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Commun. 8, 15781(2017).
  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
  11. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies. Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).
  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).
  15. Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain. STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).
  16. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  17. Sun, T., et al. Tissue clearing approaches in atherosclerosis. Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).
  18. Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis. Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).
  19. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Mol Metab. 14, 71-81 (2018).
  20. Kirst, C., et al. Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature. Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).
  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
  22. Bhatia, H. S., et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).
  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

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