Questo protocollo descrive un metodo unico per la costruzione di un modello ortotopico di carcinoma superficiale della vescica.
Articolo metodologico
Definizione di un modello murino di carcinoma superficiale della vescica tramite una tecnica di somministrazione di cellule intravescicali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio presenta un metodo innovativo per stabilire un modello ortotopico di tumore della vescica murina con alta efficienza e precisa localizzazione del tumore. Dopo aver anestetizzato topi femmina C57BL/6J in posizione supina, un ago endovenoso da 24 G viene inserito nella vescica per evacuarne il contenuto. Un ago da 34 G viene quindi introdotto attraverso il catetere, ruotato cinque volte per creare una lesione focale alla mucosa della cupola vescicale e successivamente rimosso. La sospensione cellulare MB49 viene aspirata e collegata a un ago di erogazione da 30 G, che viene inserito nella vescica tramite il catetere. Le cellule tumorali vengono iniettate per via sottomucosa nella vescica sotto pressione. Questa tecnica si traduce in un trauma minimo per i topi, un alto tasso di assunzione del tumore e una posizione fissa del tumore. È caratterizzato da semplicità e ottima riproducibilità. Questo modello fornisce una piattaforma sperimentale ideale per lo sviluppo di terapie intravescicali per il cancro della vescica, facilitando l'avanzamento e l'ottimizzazione delle strategie di trattamento per questo tumore maligno.
Introduzione
Il cancro della vescica rappresenta un significativo onere sanitario globale, con notevoli disparità specifiche per sesso in termini di incidenza e prognosi. Questa neoplasia è caratterizzata da sottotipi molecolari distinti, ciascuno associato a diverse vie patogene. Le caratteristiche molecolari e patologiche differiscono significativamente tra il carcinoma della vescica non muscolo-invasivo (NMIBC) e il carcinoma della vescica muscolo-invasivo (MIBC)1,2. La NMIBC rappresenta circa il 75% dei casi, con tumori di origine epiteliale transitoria che rimangono localizzati senza metastasi o diffusione. Al contrario, la MIBC è caratterizzata dall'infiltrazione di cellule tumorali nello strato muscolare della vescica, accompagnata da un alto rischio di disseminazione, che spesso richiede la cistectomia nella pratica clinica3.
Nella ricerca preclinica, i modelli che rappresentano accuratamente lo stadio superficiale della malattia sono essenziali per valutare le terapie farmacologiche. La creazione di un modello in situ di carcinoma superficiale della vescica è, quindi, di fondamentale importanza, in quanto funge da strumento di ricerca critico per lo sviluppo di farmaci clinici e terapie instillative innovative.
Lo sviluppo di modelli murini di carcinoma ortotopico della vescica ha tradizionalmente affrontato delle sfide. I modelli indotti chimicamente spesso iniziano come tumori superficiali, ma possono evolvere in forme invasive, con una variabilità che ne limita l'utilità negli esperimenti su larga scala4. I modelli tradizionali di impianto ortotopico, che si basano sull'iniezione di cellule tumorali attraverso la parete della vescica5, faticano a riprodurre fedelmente il cancro superficiale della vescica. Sono stati tentati metodi alternativi, tra cui il danno della mucosa combinato con l'instillazione di cellule tumorali 6,7,8,9,10, ma sono limitati da alti tassi di mortalità e bassi tassi di assunzione del tumore, ostacolando la loro più ampia applicazione.
Questo studio mira a sviluppare un nuovo metodo per la costruzione di un modello di cancro superficiale della vescica che dimostri una maggiore stabilità, una minore mortalità e un posizionamento fisso del tumore rispetto ai modelli esistenti. Ottenendo una rappresentazione più precisa della malattia nelle sue fasi iniziali, l'attuale modello è pronto a migliorare la valutazione rigorosa degli interventi preventivi e terapeutici, facendo così progredire il trattamento del cancro della vescica.
Protocollo
Tutti i protocolli e le procedure sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato di revisione etica per la sperimentazione animale della Tianjin Medical University, Tianjin, Cina (numero di approvazione SYXK: 2020-0010). Per questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di sei-otto settimane. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni ambientali controllate, tra cui un ciclo luce-buio di 12 ore, temperature comprese tra 21 e 25 °C, livelli di umidità regolabili tra il 30% e il 70% e accesso illimitato a cibo e acqua, se non diversamente specificato. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione delle cellule
- Coltura della linea cellulare di carcinoma della vescica murina MB49 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completo, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per supportare una crescita ottimale.
- Mantenere le colture cellulari in condizioni standard a 37 °C in un incubatore umidificato con CO2 al 5%. Aggiorna i terreni ogni 2-3 giorni per garantire la salute e la vitalità delle cellule.
- Raccogli le cellule utilizzando una procedura standardizzata di digestione della tripsina. Pipettare delicatamente per rimuovere le cellule dal pallone di coltura dopo aver applicato la tripsina e aver incubato per un breve periodo.
- Conta le cellule raccolte utilizzando un emocitometro per determinare l'esatta densità cellulare. Preparare una sospensione a cellula singola risospendendo le cellule a 2 x 103/μL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mantenere questa sospensione sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare.
2. Preparazione degli animali
- Il gruppo ospita i topi (5 topi per gabbia) in gabbie di policarbonato ventilate individualmente.
- Lasciare che i topi si acclimatino per 7 giorni prima dell'inizio dello studio.
3. Generazione di modelli di tumore ortotopico animale
- Somministrare l'anestesia ai topi tramite iniezione intraperitoneale utilizzando una soluzione al 2,5% di Avertin (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
- Attendere che i topi raggiungano un livello appropriato di anestesia per l'intervento chirurgico, come indicato da una diminuzione della frequenza respiratoria con un aumento della profondità, l'assenza di riflessi palpebrali e corneali, riduzione del tono muscolare e delle risposte riflesse e nessuna reazione a un pizzico della coda.
- Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina per facilitare la procedura.
- Utilizzare un catetere endovenoso da 24 G con lo stiletto dell'ago rimosso per la procedura di cateterismo uretrale. Applicare un'ampia lubrificazione al catetere per ridurre al minimo il disagio e facilitare l'inserimento senza problemi.
- Identificare l'uretra, situata immediatamente posteriormente alle pieghe vulvari e anteriormente alla vagina, mantenendo il topo in posizione supina.
- Inizia il cateterismo avvicinandoti all'uretra con un angolo di 45 gradi per navigare sotto l'osso pubico. Regolare su un angolo più basso per guidare il catetere attraverso l'uretra e nella vescica.
- Evitare di applicare una forza eccessiva contro la resistenza, in quanto ciò può portare alla perforazione uretrale o della vescica. Confermare la posizione del catetere all'interno del lume della vescica controllando la presenza di urina all'interno del catetere.
- Applicare delicatamente una pressione sul basso addome del topo per facilitare il drenaggio dell'urina dalla vescica. Assicurarsi che la vescica sia completamente svuotata per prepararsi alle fasi successive della procedura.
- Spingere delicatamente il catetere endovenoso da 24 G verso la parte superiore della vescica. Assicurarsi che la punta del catetere sia a contatto con l'apice della vescica.
- Una volta confermato il contatto, rilasciare il catetere, lasciandolo ritrarre leggermente. Mantenere il catetere in una posizione fissa rispetto al topo per garantire stabilità e prevenire lo spostamento.
- Inserire l'ago di erogazione da 34 G modificato lungo il catetere da 24 G. Far avanzare l'ago fino a raggiungere la parte superiore della vescica.
- Una volta posizionato, ruotare l'ago sei volte per creare una lesione localizzata della mucosa all'apice della vescica. Dopo aver completato la rotazione, estrarre con cautela l'ago lungo il catetere.
- Collegare l'ago da 30 G alla parte superiore di una siringa da 1 ml. Assicurarsi che il collegamento tra l'ago e la siringa sia sicuro.
- Una volta collegata, aspirare la sospensione cellulare MB49 da 2 x 10³/μL pre-preparata nella siringa tirando delicatamente indietro lo stantuffo. Verificare che la sospensione cellulare sia aspirata nella siringa senza bolle d'aria.
- Inserire l'ago di erogazione da 30 G lungo il catetere da 24 G. Assicurarsi che l'ago sia correttamente allineato e fissato all'interno del catetere.
- Una volta posizionata, esercitare pressione sullo stantuffo della siringa da 1 ml per iniettare il contenuto (preparato al punto 1). Mantenere una pressione costante sullo stantuffo per 60 s per garantire che il contenuto venga erogato senza una significativa riduzione del volume.
- Dopo 60 s, estrarre con cautela la siringa e l'ago da 30 G dal catetere.
4. Monitoraggio post-operatorio
- Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina su un termoforo fino al ritorno del riflesso di raddrizzamento.
- Assicurarsi che l'animale non venga lasciato incustodito fino a quando non ha ripreso sufficiente conoscenza.
- Non restituire l'animale alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
Risultati
L'efficacia delle iniezioni sottomucose è stata inizialmente valutata attraverso la somministrazione di Trypan Blue. Dopo l'iniezione, la distribuzione del colorante all'interno dello strato sottomucoso è stata chiaramente visualizzata, confermando la somministrazione precisa e controllata delle sostanze iniettate (Figura 1).
Lo sviluppo del tumore è stato meticolosamente monitorato. Circa 14 giorni dopo l'impianto, è stata osservata una notevole incidenza di ematuria, un sintomo critico indicativo di neoplasia vescicale. I tumori sono stati identificati come saldamente stabiliti all'interno dello strato sottomucoso della vescica. Il modello di crescita precoce di questi tumori era caratterizzato da un'espansione espansiva e non invasiva, coerente con la classificazione di NMIBC. L'esame istologico ha confermato l'assenza di invasione muscolare, con tumori confinati allo strato sottomucoso, allineandosi così con i criteri per NMIBC (Figura 2).
Le osservazioni macroscopiche hanno ulteriormente corroborato il processo di formazione del tumore. I tumori erano visivamente distinti e mostravano una crescita papillare con una gamma di dimensioni e forme (Figura 3). Inoltre, i tumori sono cresciuti relativamente lentamente, fornendo tempo sufficiente per la ricerca nell'esperimento (Figura 4).
In questo studio, per verificare la localizzazione del tumore e l'assenza di semina uretrale, abbiamo utilizzato cellule MB49-luc per l'impianto, seguito da imaging di piccoli animali. La Figura 5 mostra le immagini in bioluminescenza in vivo scattate 35 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali, dimostrando chiaramente che il tumore si trova nella vescica senza evidenza di semina ectopica, come nell'uretra.
Il tessuto tumorale diventa tipicamente rilevabile 14 giorni dopo l'impianto. Nella nostra esperienza, il 70% o più dei topi mostra ematuria entro il giorno 14. La procedura generalmente non provoca mortalità. Senza intervento, l'eutanasia diventa necessaria entro il 60° giorno. I criteri di eutanasia includono letargia, cachessia, pelo arruffato, curvatura, comportamento non reattivo o una perdita del ≥20% del peso corporeo iniziale.
Figura 1: Efficacia dell'iniezione sottomucosa con blu di tripano. Dimostrazione dell'efficacia dell'iniezione sottomucosa utilizzando il Trypan Blue. Le frecce indicano i siti di iniezione in cui il blu di tripano residuo rimane visibile anche dopo tre lavaggi con PBS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conferma istologica dell'impianto del tumore. Conferma istologica dell'impianto del tumore nella sottomucosa tramite colorazione H&E. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione diretta dei tumori della vescica. Visualizzazione diretta dei tumori della vescica, evidenziando un'evidente proliferazione vascolare alla base del tumore. Barra della scala: 2 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Stato del tumore al giorno 35 dopo l'impianto. Valutazione dello stato tumorale al giorno 35 post-impianto. La parete della vescica alla base del tumore mostra vasi sanguigni ingrossati e disorganizzati, accompagnati da una base tumorale ampiamente estesa. Barra della scala: 2 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging in bioluminescenza in vivo del cancro della vescica. Immagini in bioluminescenza in vivo di topi 35 giorni dopo l'impianto con cellule di cancro della vescica MB49-LUC. Le immagini sono codificate a colori per rappresentare l'intensità della fluorescenza: il rosso indica un'elevata fluorescenza (alta attività tumorale) e il blu indica una bassa fluorescenza (bassa attività tumorale). Le regioni di interesse (ROI) sono state selezionate nell'area della vescica per quantificare il segnale di bioluminescenza specifico per il tumore. I risultati dimostrano che i tumori sono localizzati nella vescica senza evidenza di semina ectopica, come nell'uretra. Le regioni a basso segnale possono essere dovute a segnali diffusi provenienti da aree ad alta intensità che penetrano attraverso il tessuto e non indicano necessariamente la presenza di cellule tumorali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Diagramma della somministrazione intravescicale delle cellule tumorali. Rappresentazione schematica della somministrazione intravescicale di cellule tumorali per costruire il modello ortotopico del carcinoma superficiale della vescica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Configurazione degli aghi di erogazione modificati. Configurazione degli aghi di erogazione modificati all'interno del catetere da 24 G. (A) Fotografia dell'ago di erogazione da 34 G all'interno del catetere da 24 G. (B) Fotografia dell'ago di erogazione da 30 G all'interno del catetere da 24 G. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
La ricerca sul cancro della vescica si basa su modelli animali, indispensabili sia per la ricerca di base che per quella applicata. Per imitare meglio l'ambiente di crescita del tumore, i modelli di tumore ortotopico della vescica forniscono un approccio superiore rispetto ai modelli di tumore sottocutaneo11.
Attualmente, i modelli di carcinoma ortotopico della vescica possono essere classificati in base a scopi sperimentali in due tipi principali: quelli che utilizzano topi immunodeficienti, come i modelli di xenotrapianto derivati da pazienti (PDX)1 e i modelli di xenotrapianto derivati da linee cellulari (CDX)5, e quelli che utilizzano topi immunocompetenti, come i modelli di attecchimento singenico12.
Il modello PDX prevede l'impianto di tessuti tumorali derivati da pazienti in topi immunodeficienti, consentendo una valutazione personalizzata della risposta del tumore ai farmaci chemioterapici. Tuttavia, la mancanza di un sistema immunitario intatto in questi topi presenta limitazioni significative per lo studio dei meccanismi immuno-correlati. Allo stesso modo, il modello CDX, che utilizza linee cellulari tumorali di derivazione umana, offre alti tassi di formazione tumorale ma soffre anche dell'assenza di un microambiente immunitario5.
Nel contesto dei topi immunocompetenti, il metodo principale per la costruzione di tumori ortotopici della vescica prevede l'iniezione di linee cellulari MB49 di derivazione murina nella parete della vescica per formare tumori della vescica in situ 12. Questa procedura richiede la laparotomia e l'iniezione intravescicale di cellule tumorali, ponendo sfide come la potenziale perdita di cellule tumorali e la semina del tratto dell'ago. Di conseguenza, è difficile creare tumori superficiali della vescica, il che ostacola la replicazione accurata della progressione del cancro della vescica umana dagli stadi non muscolo-invasivi a quelli muscolo-invasivi13.
Per stabilire tumori ortotopici superficiali della vescica, le tecniche di modellazione tradizionali prevedono tipicamente l'induzione di lesioni alla mucosa utilizzando agenti come soluzioni acido-base o elettrocauterizzazione, seguita dall'instillazione intravescicale di sospensioni di cellule tumorali, con tempi di ritenzione di 2 ore o più 8,14. Tuttavia, queste metodologie presentano diversi limiti significativi. In primo luogo, non riescono a garantire l'uniformità del numero e della posizione degli impianti tumorali all'interno della vescica, compromettendo così la riproducibilità del modello. Inoltre, queste tecniche spesso provocano gravi danni alla vescica, portando ad alti tassi di mortalità. La conseguente cicatrizzazione della vescica e la ridotta capacità pongono ostacoli sostanziali per gli studi su nuovi agenti terapeutici che richiedono ripetute instillazioni intravescicali. Ciò non solo mina l'affidabilità dei risultati sperimentali, ma solleva anche preoccupazioni etiche riguardo al benessere degli animali.
Pertanto, lo sviluppo di un modello animale in grado di simulare accuratamente il cancro superficiale della vescica umana fornirebbe una migliore piattaforma sperimentale per comprendere la proliferazione e la progressione del tumore. Un tale modello sarebbe prezioso per la ricerca di nuovi agenti terapeutici intravescicali e per far progredire le nostre conoscenze sulla biologia del cancro della vescica.
Questo studio delinea un metodo di impianto in situ che impiega un ago di dispensazione a punta smussata per iniettare cellule tumorali sottomucosamente sotto pressione (Figura 6). Lo studio utilizza la linea cellulare MB49 e i topi femmina C57BL/6J per costruire un modello tumorale in situ .
Durante la costruzione di questo modello, lo strato protettivo sulla normale superficie della mucosa vescicale rappresenta una sfida significativa per l'instillazione diretta delle cellule tumorali, impedendo spesso l'efficace formazione del tumore8. Di conseguenza, è necessario indurre una lesione localizzata nella cupola vescicale utilizzando un ago smussato da 34 G per creare un "terreno" adatto per l'impianto delle cellule tumorali.
Gli aghi da 34 G e 30 G utilizzati in questo studio hanno subito modifiche parziali. La punta dell'ago da 34 G è stata bloccata per creare un'estremità leggermente irregolare, migliorando la sua capacità di causare danni alla mucosa. I punti di connessione di entrambi gli aghi da 34 G e 30 G sono stati tagliati per garantire che le parti esposte sul catetere da 24 G siano rispettivamente da 0,3 mm a 0,5 mm (Figura 7A) e da 1 mm a 1,5 mm (Figura 7B).
L'intera procedura può essere completata entro 10 minuti, eliminando la necessità di laparotomia o legatura uretrale prolungata per l'instillazione intravescicale. Tuttavia, questo approccio ha anche dei limiti. A causa dei molteplici passaggi tecnici coinvolti in questo metodo di modellazione, come l'inserimento del catetere a permanenza attraverso l'uretra nella vescica e la rotazione dell'ago smussato da 34 G per ottenere il grado appropriato di lesione della mucosa senza perforare la parete della vescica, gli sperimentatori devono esercitarsi per migliorare il tasso di successo dell'impianto del tumore. Inoltre, se viene utilizzata una forza eccessiva durante la lesione della mucosa o l'iniezione di cellule tumorali, può portare alla perforazione della vescica o all'impianto del tumore nello strato muscolare.
In conclusione, questa tecnica offre vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali, tra cui tempi procedurali ridotti, minore mortalità e migliore coerenza nella localizzazione e nella crescita del tumore, senza la necessità di procedure invasive o ritenzione intravescicale prolungata. Questi benefici lo rendono uno strumento prezioso per gli studi preclinici volti a valutare nuovi agenti terapeutici per il cancro della vescica.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal fondo Tianjin Municipal Health Industry Key Project (sovvenzione n. TJWJ2022XK014), il fondo per il progetto di ricerca scientifica della Commissione municipale per l'istruzione di Tianjin (sovvenzione n. 2022ZD069), il programma di finanziamento dei talenti dell'Istituto di urologia di Tianjin (sovvenzione n. MYSRC202310), il fondo per il progetto di ricerca in medicina clinica del secondo ospedale dell'Università di medicina di Tianjin (sovvenzione n. 2023LC03), il Fondo per i giovani del secondo ospedale dell'Università di medicina di Tianjin (sovvenzione n. 2022ydey15) e il progetto di coltivazione dei talenti del Dipartimento di Urologia, del Secondo Ospedale dell'Università di Medicina di Tianjin (sovvenzione n. MNRC202313). Gli sponsor hanno avuto un ruolo nella preparazione, nella revisione e nell'approvazione del manoscritto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago di erogazione 34 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, Cina | SGL-362 | |
| Ago di erogazione 30 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, Cina | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich LLC | 302643 |
Riferimenti
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