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Articolo metodologico

Saggio quantitativo basato sulla PCR per misurare la segnalazione sonica del riccio nel modello cellulare di ciliogenesi

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DOI:

10.3791/67407

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31 gennaio 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

In questo articolo

Sommario

Lo studio dimostra un test quantitativo basato sulla PCR per l'attivazione della via di segnalazione Sonic Hedgehog (SHH) mediata dalle ciglia primarie utilizzando l'agonista SHH in un modello cellulare di ciliogenesi.

Abstract

La ciliopatia si riferisce a un insieme di malattie e disturbi umani multisistemici e poligenici che insorgono a causa dell'aberrazione della struttura o della funzione delle ciglia mobili o non mobili (primarie) che sono sporgenze cellulari basate su microtubuli. Le ciglia primarie (PC) sono presenti nella maggior parte dei tessuti epiteliali ed endoteliali umani e fungono da hub per la trasduzione fisiologica del segnale, inclusa la segnalazione Sonic Hedgehog (SHH). Varie situazioni richiedono l'esame della funzione del PC, che può essere ottenuta misurando la via di segnalazione SHH canonica che è quasi esclusivamente mediata dal PC. Qui, viene sviluppata una tecnica basata sulla PCR quantitativa (qPCR) per misurare il livello trascrizionale dei geni della via SHH nelle cellule hTERT-RPE1 (o RPE1) quiescenti che contengono principalmente PC. La quiescenza nelle cellule RPE1 si ottiene con la fame sierica per 48 ore, mentre l'attivazione della via SHH è promossa da un agonista specifico. Questo test basato su colture cellulari è facile da seguire e sensibile. La dimostrazione di successo di questo test in cellule di RPE1 ciliate indica il suo immenso potenziale come test in vitro per esaminare la corretta funzione del PC in seguito all'alterazione genetica o epigenetica di uno o più geni, che può essere associata a varie ciliopatie.

Introduzione

Un cilio è una sporgenza basata su microtubuli e rivestita di membrana dalla superficie cellulare, che è assemblata su un corpo basale1. Nei vertebrati si osservano due tipi di ciglia, vale a dire mobili e non mobili. Le ciglia mobili si trovano in tessuti specializzati e conferiscono motilità. Le ciglia primarie non mobili (PC) sono presenti nella maggior parte delle cellule dei vertebrati e svolgono funzioni sensoriali e trasducono segnali critici dall'ambiente extracellulare all'interno delle cellule2. Una volta assemblato, l'allungamento ciliare è aiutato dal macchinario di trasporto intraflagellare (IFT), che è un sistema di trasporto bidirezionale che trasporta merci guidato da chinesine (movimento anterogrado) e proteine motrici della dineina-II (movimento retrogrado)3,4. Difetti strutturali o funzionali nelle ciglia mobili o primarie possono portare a una pletora di malattie umane multisistemiche che sono note collettivamente come ciliopatie 5,6.

Il PC funge da hub per vari processi di segnalazione dello sviluppo, come Wingless (Wnt), recettori accoppiati a proteine G (GPCR), recettori-tirosin-chinasi (RTK), fattore di crescita trasformante β (TGFβ) e segnalazione del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) 7,8. Nei mammiferi, la segnalazione di Sonic Hedgehog (SHH) è fondamentale, che viene trasdotta quasi esclusivamente da PC in cellule contenenti PC 9,10,11. La struttura o la funzione aberrante del PC porta a vie di segnalazione attenuate che sono associate a malattie come difetti cardiaci congeniti, malattia del rene policistico, anomalie craniofacciali, distrofia retinica e alcune malattie rare come la sindrome di Bardet-Biedl (BBS), la sindrome di Joubert (JBTS), la sindrome di Alström, la displasia toracica asfissiante di Jeune (JATD)12,13,14,15. La maggior parte di queste sono malattie poligeniche dei tessuti epiteliali o endoteliali, che rendono le sfide nella diagnosi precoce e nel trattamento di queste malattie. Determinare in che modo tali mutazioni contribuiscono all'attenuazione della segnalazione mediata da PC in un modello di coltura cellulare può non solo fornire informazioni sulla complessità molecolare di tale via di segnalazione, ma anche facilitare la diagnosi di varie ciliopatie e può suggerire interventi terapeutici. Con questa nozione, viene sviluppato un test basato sulla PCR quantitativa (qPCR) per determinare l'alterazione della via di segnalazione SHH mediata da PC nelle cellule epiteliali pigmentate retiniche immortalizzate della trascrittasi inversa della telomerasi umana (hTERT) (hTERT-RPE1, qui indicato come RPE1). Le cellule RPE1 sono cellule umane quasi diploidi, non trasformate, ampiamente utilizzate come modello cellulare per la ciliogenesi, poiché circa il 75%-80% di queste cellule assembla il PC dopo la fame sierica (incubazione di cellule in terreno privo di siero) per 24-48 ore, rispetto a solo il 15%-18% di ciliazione in una coltura asincrona di cellule RPE116.

La segnalazione del riccio (HH) è conservata tra i vertebrati per lo sviluppo embrionale17. Nei mammiferi, si osservano tre diversi tipi di segnalazione Hedgehog: Sonic (SHH), Indian (IHH) e Desert (DHH), di cui SHH e IHH mostrano funzioni sovrapposte a livello tissutale11. La segnalazione SHH svolge un ruolo chiave durante lo sviluppo embrionale regolando il pattern degli arti e la specificazione del tipo di cellula nel sistema nervoso e mantenendo l'omeostasi del tessuto adulto 10,11,18. Sebbene la trasduzione del segnale SHH sia complessa, ci sono prove crescenti che suggeriscono che il segnale canonico SHH dipende dal PC 7,11,19, che è mediato dalle funzioni collettive dei fattori di trascrizione Gli (Gli1, Gli2 e Gli3). È stato suggerito che la segnalazione di HH e PC si siano coevolute, con componenti critici di segnalazione concentrati nel volume compatto all'estremità del cilio per consentire risposte efficaci a bassi rapporti di ligando11.

In assenza di ligandi SHH, Patched1 (Ptch1), che è localizzato sulla membrana del PC, inibisce l'attività di Smoothened (Smo) attraverso un meccanismo poco noto che probabilmente coinvolge il trasporto lipidico, mantenendo così la via repressa 7,20. Il GPR161 ciliare costitutivamente attivo, che è un recettore proteico accoppiato a G e un regolatore negativo del sistema, assicura il mantenimento della repressione preservando alti livelli di AMP ciclico ciliare (cAMP) che aumenta l'attività della proteina chinasi A (PKA)21 e mantenendo la localizzazione ciliare di PKA7. L'attività della PKA, insieme alla caseina chinasi 1 (CK1) e alla glicogeno sintasi chinasi 3 β (GSK3β), fosforila residui multipli delle proteine Gli, Gli2 e Gli3, all'interno del PC. Gli2 e Gli3 possono agire sia come attivatori che come repressori della trascrizione di geni bersaglio. La fosforilazione mediata da PKA provoca l'inibizione della funzione attivatrice di Gli2, mentre Gli3 fosforilata viene scissa dalle proteasi per produrre la forma repressore Gli3R22. Nel complesso, l'espressione dei geni bersaglio SHH è repressa in tali condizioni.

Quando il ligando SHH è presente, Ptch1 si lega ad esso, e GPR161 lascia PC, e Smo, essendo fosforilato dal recettore accoppiato a proteine G (GPCR) chinasi 2 (GPRK2) e CK1, viene trafficato in PC, insieme a β-arrestina e al motore dei microtubuli KIF3A23. Di concerto, la localizzazione di Gli2/3, Soppressore di Fused (SUFU) e Kif7 all'apice ciliare è promossa ed è legata alla diminuzione della scissione di Gli2/3, aumentando così la funzione attivatrice di Gli2/324,25. Una volta attivata, Gli2/3 induce l'espressione di Gli1, che può funzionare solo come attivatore, e quindi amplifica la risposta della via SHH22. Il legame di SHH a Ptch1 è facilitato da oncogeni (CDO), fratello di CDO (BOC), GAS1 specifico per l'arresto della crescita (GAS1) e proteina 2 correlata al recettore delle lipoproteine a bassa densità (LRP2). Al contrario, la proteina che interagisce con Hedgehog (HHIP) può sequestrare SHH interagendo direttamente con essa e compete anche con Ptch1 dall'interazione con SHH26. È importante sottolineare che GLI1, HHIP e PTCH1 sono trascritti all'attivazione della via SHH, mentre gli ultimi due partecipano alla regolazione negativa della via SHH.

Studi precedenti hanno dimostrato che i livelli di trascrizione dei geni bersaglio SHH possono essere misurati per valutare la via SHH, sebbene possano variare significativamente in diversi tipi di cellule27,28. Tale variazione nella risposta della via SHH può essere attribuita a diverse combinazioni di segnalazione SHH mediata da PC e segnalazione SHH mediata dalla membrana cellulare, probabilmente in assenza di PC. SAG è un agonista Smo che viene utilizzato in questo metodo per imitare l'attivazione della segnalazione SHH nelle cellule RPE1 affamate di siero che sono principalmente ciliate. I livelli di trascrizione dei geni bersaglio SHH come HHIP, GLI1 e PTCH1 e di un gene non bersaglio SMO sono stati misurati utilizzando la qPCR in cellule di controllo e trattate con SAG e sono stati confrontati per determinare l'attivazione della via SHH. La dimostrazione di successo di questo saggio sensibile basato su colture cellulari per misurare la segnalazione SHH mediata da PC suggerisce la sua promettente applicazione nella ricerca biomedica associata alla funzione primaria delle ciglia.

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Protocollo

1. Coltura cellulare

  1. Passaggio di un pallone di coltura cellulare T-25 quasi confluente di cellule RPE1 alla diluizione 1:5 della coltura originale in un pallone di coltura cellulare T-25 fresco contenente 5 mL di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), una miscela di penicillina-streptomicina all'1% (concentrazione finale: 100 U/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina). Questo mezzo è indicato come il mezzo completo. Far crescere le cellule a 37 °C in presenza del 5% di CO2.
    NOTA: Le cellule RPE1 sono cellule non trasformate comunemente utilizzate per studiare la regolazione molecolare dell'assemblaggio e del disassemblaggio del PC in coltura cellulare. Circa l'80% delle cellule RPE1 assembla il PC dopo la fame nel siero, che viene nuovamente disassemblato dopo la reaggiunta del siero16.
  2. Preparare i vetrini coprioggetti rotondi da 12 mm incubandoli in 50 mL di HCl 1 N in un becher di vetro coperto per una notte senza agitare a 60 °C in un bagno d'acqua o in un'incubatrice.
  3. Il giorno successivo, utilizzando una pipetta da 25 ml, pipettare la soluzione acida e gettarla correttamente in un contenitore per rischi chimici. Quindi, lavare i vetrini coprioggetti 3 volte in 100 ml di acqua distillata incubandoli per 15 minuti agitando di tanto in tanto, quindi pipettando.
  4. Ripetere le fasi di lavaggio con etanolo al 70% ed etanolo al 95%. Asciugare i vetrini coprioggetti posizionandoli singolarmente su una carta assorbente da laboratorio in una cabina di biosicurezza. Una volta essiccato, sterilizzare con radiazioni UV per 60 min.

2. Crescita cellulare, fame di siero e trattamento SAG

  1. Risospendere le cellule nel pallone T-25 in un terreno completo preriscaldato dopo aver rimosso le cellule mediante l'attività enzimatica della soluzione preriscaldata di tripsina-EDTA allo 0,25%. Determinare la densità cellulare della sospensione contando le cellule utilizzando un emocitometro.
  2. Preparare due piastre per colture cellulari da 35 mm e posizionare due vetrini coprioggetti sterili da 12 mm in ciascuna di esse. Passaggio 2 x 105 cellule RPE1 a crescita asincrona in ogni piatto da 35 mm contenente vetrini coprioggetti e far crescere le cellule in 2 mL di terreno completo per 24 ore.
  3. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di coltura delle cellule RPE1 e lavare le cellule 1 volta con 1 mL di tampone DPBS preriscaldato. Aggiungere 2 mL di terreno DMEM preriscaldato contenente l'1% di penicillina-streptomicina ma privo di FBS (terreno privo di siero) in ciascuna piastra e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in presenza del 5% di CO2.
  4. Dopo 24 ore, sostituire il terreno con il terreno privo di siero contenente SAG a una concentrazione finale di 250 nM o DMSO come solvente di controllo e incubare le cellule per altre 24 ore. Un diagramma a fumetti del protocollo di coltura cellulare è mostrato nella Figura 1A.

3. Raccolta di cellule

  1. Trasferire i vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti con un vetrino coprioggetti in ogni pozzetto. Aggiungere 0,5 mL di metanolo refrigerato a ciascun pozzetto e incubare la piastra a -20 °C per 10 minuti per fissare le cellule sui vetrini. Subito dopo, lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 0,5 mL di tampone di lavaggio (1x PBS contenente 0,5 mM di MgCl2 e 0,05% di Triton-X 100).
  2. Eliminare il terreno e aggiungere 0,5 mL di reagente trizol direttamente in ogni piatto. Lasciare distribuire uniformemente e tenere per 5 min. Pipettare su e giù alcune volte per ottenere una miscela omogenea e raccoglierla in provette per microcentrifuga prive di nucleasi da 1,5 mL.

4. Preparazione dell'RNA totale e del cDNA

  1. Aggiungere 0,1 mL di cloroformio a ciascuna provetta contenente cellule lisate e incubare per 2-3 minuti. Centrifugare ogni campione per 15 minuti a 12.000 x g a 4 °C. Trasferire la fase acquosa contenente l'RNA in provette fresche per microcentrifuga.
  2. Aggiungere 0,25 mL di isopropanolo alla fase acquosa e incubare per 10 minuti. Centrifugare per 10 min a 12.000 x g a 4°C. Il precipitato di RNA forma una pallina bianca simile a un gel. Utilizzando una micropipetta, scartare il surnatante.
  3. Risospendere il pellet di RNA in 0,5 mL di etanolo al 75% appena diluito. Agitare brevemente i campioni, quindi centrifugare per 5 minuti a 7500 x g a 4°C. Eliminare il surnatante con una micropipetta.
  4. Asciugare all'aria il pellet di RNA per 10 minuti e risospendere in 25 μL di acqua priva di nucleasi. Determinare la concentrazione di RNA totale misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
  5. Utilizzare 1-3 μg di RNA totale da entrambi i campioni per preparare i cDNA seguendo le istruzioni del produttore per un kit di sintesi del cDNA. Conservare i cDNA a -20 °C.

5. PCR quantitativa

  1. Impostare le reazioni qPCR (in triplicato, Tabella 1) utilizzando cDNA diluiti 1:5 da ciascun campione con set di primer di GLI1, PTCH1, HHIP, SMO e β-ACTINA (come gene housekeeping; Tabella 2) geni con una master mix qPCR contenente DNA polimerasi, dNTP e tampone idonei, in un'idonea piastra PCR multipozzetto sensibile alla fluorescenza.
  2. Coprire la piastra con un sigillante adatto, posizionarla in uno strumento qPCR adatto ed eseguire un programma qPCR standardizzato con 40 cicli di amplificazione e una fase di analisi della curva di fusione alla fine del programma. Il programma standardizzato di qPCR a 40 cicli, che include un'analisi della curva di fusione, è mostrato schematicamente nella Figura 1B.
  3. Al termine del programma qPCR, controllare la curva di fusione di ciascun amplicone per un singolo picco alla temperatura desiderata.
    NOTA: Al termine dei cicli di amplificazione, l'analisi della curva di fusione associata misura la temperatura di fusione dell'amplicone aumentando la temperatura di ciascun pozzetto da 65°C a 95°C, con incrementi di 0,5°C per passo della durata di 5 s.
  4. Esportare i dati di amplificazione in un foglio di calcolo e calcolare l'espressione relativa (metodo 2−ΔΔCT) di ciascun trascritto normalizzandolo rispetto a quella del gene β-ACTINA per ciascun campione. Traccia il grafico e calcola la significatività statistica delle variazioni nell'espressione relativa di ciascun trascritto utilizzando un T-Test non accoppiato.

6. Immunocolorazione e acquisizione di immagini mediante microscopia a fluorescenza

  1. Incubare le cellule fissate su vetrini coprioggetti in 200 μL di tampone bloccante (2% BSA e 0,1% TritonX-100 in 1x PBS) per 30 minuti.
  2. Incubare le cellule con una miscela di anticorpi primari (tipicamente un anti-topo contro la α-tubulina acetilata dell'assonema PC e anticorpi anti-coniglio contro la membrana ciliare e il centriolo, rispettivamente) diluiti in tampone bloccante (vedere la Tabella dei materiali per la diluizione finale) per una notte a 4 °C in una camera umidificata.
    1. Creare una camera umidificata mettendo un tovagliolo di carta bagnato nella metà inferiore di una scatola vuota di puntali per pipette da 1 ml. Stendere una striscia di pellicola trasparente sulla superficie del rack e posizionare una gocciolina (20-25 μL) della soluzione anticorpale sulla pellicola, una per ogni vetrino coprioggetti da incubare. Posizionare un vetrino coprioggetti sulle goccioline in modo che le cellule siano immerse e chiudere il coperchio della scatola dei puntali.
  3. Il giorno successivo, capovolgere nuovamente i vetrini coprioggetti e rimetterli nella piastra a 24 pozzetti. Lavare i vetrini coprioggetti con il tampone di lavaggio e quindi incubarli in 150 μL di miscela di anticorpi secondari con una diluizione pre-standardizzata di anticorpi (qui, anti-topo coniugato con colorante fluorescente verde e anti-coniglio coniugato con colorante fluorescente rosso diluiti in tampone bloccante) e reagenti di colorazione del DNA nucleare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte.
  4. Individuare una gocciolina (circa 3-5 μL) della soluzione di montaggio contenente il reagente antidissolvenza su un vetrino da microscopio. Posizionare un vetrino coprioggetti, con il lato della cella rivolto verso il basso, sulla soluzione di montaggio. Asciugare il liquido in eccesso premendo delicatamente un panno pulito. Applicare lo smalto trasparente lungo il bordo del vetrino coprioggetti per sigillarlo sul vetrino.
  5. Mettere un vetrino sul microscopio (vedi Tabella dei materiali) collegato con un tavolino motorizzato e una fotocamera in grado di eseguire l'imaging digitale. Utilizzare un obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60x (con un'apertura numerica di 1,4) per acquisire le immagini delle cellule RPE1 affamate di siero a temperatura ambiente, per visualizzare il PC nelle cellule, come indicato dagli anticorpi menzionati.
  6. Acquisizione di immagini dei diversi campioni su vetrini coprioggetti separati utilizzando lo stesso tempo di esposizione per diversi fluorofori lungo l'asse Z utilizzando un pacchetto software di imaging per microscopia digitale. Contare il numero di cellule contenenti PC da almeno 500 cellule per determinare la percentuale di ciliazione in condizioni di carenza di siero di 48 ore.

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Risultati

L'attivazione della via di trasduzione del segnale SHH mediata da PC è un modo per comprendere il corretto funzionamento di PC7. Qui, l'espressione relativa dei geni bersaglio della via SHH viene misurata utilizzando il saggio RT-qPCR sull'attivazione mediata da SAG della via SHH nelle cellule RPE1 che sono per lo più ciliate. Le uscite trascrizionali dirette della via SHH, GLI1 e PTCH1, sono spesso impiegate per misurare l'attività di questa via11. Questo protocollo includ...

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Discussione

Esaminare la funzionalità del PC è un passo cruciale verso la comprensione delle dinamiche della ciliazione e delle malattie o disturbi associati alla disfunzione del PC. Oltre a esaminare la ciliazione mediante immunocolorazione per marcatori ciliari o componenti strutturali ciliari marcati con fluorofori, la funzione del PC è comunemente determinata analizzando l'attivazione canonica della via SHH misurando la traslocazione ciliare di Smo nei tessuti e nelle cellule utilizzando la micr...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato dalla borsa di studio Ramalingaswami a SM dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT), Govt. dell'India, e da una sovvenzione di ricerca da Science and Engineering Research Board (SERB), Govt. of India a SM (CRG/2020/004042). La Fellowship of PH è sponsorizzata dalla University Grant Commission (UGC), Govt. dell'India. Gli autori ringraziano sinceramente il dottor Chandrama Mukherjee e il signor Avik Mukherjee del RNABio Lab dell'Institute of Health Sciences, President University per aver avuto accesso allo strumento qPCR e alla formazione sullo strumento.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMSO, filtrato sterileSigmaD2650
Donkey, anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Donkey, anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific 41965039
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Siero fetale bovino (FBS)MicroscopioRM1112
dotato di obiettivo 60XCarl Zeiss Axio observer colibrì 5
cellule hTERT-RPE1ATCCCRL-4000
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708891
Topo, anticorpo monoclonale anti-acetilina tubulinaMilipore Sigma-AldrichT7451Diluizione finale 1:1000
Penicillina-Streptomicina, 100XGibco, ThermoFisher Scientific 15140122
Macchina per PCR quantitativa, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Coniglio, anticorpo policlonale Arl13BProteinTech17711-1-APDiluizione finale 1:250
Coniglio, anticorpo policlonale Cep135ProteinTech24428-1-APDiluizione finale 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Levigato Agonista (SAG) AbmoleM4865Soluzione madre: in DMSO, 5
mM SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
Reagente TRIzolInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028
a fluorescenza Himedia

Riferimenti

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