Immunizzazione attiva per l'induzione della miastenia grave autoimmune da chinasi muscolo-specifica (MuSK) nei topi

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo completo per un modello murino sperimentale di miastenia grave autoimmune muscolo-specifica chinasi (MuSK), volto a studiare la fisiopatologia e le potenziali strategie terapeutiche per la malattia.

Abstract

La miastenia grave (MG) è una malattia autoimmune che colpisce la giunzione neuromuscolare. Mentre la maggior parte dei pazienti con MG produce autoanticorpi contro il recettore dell'acetilcolina (AChR), un sottogruppo di pazienti presenta autoanticorpi che hanno come bersaglio la chinasi muscolo-specifica (MuSK). La MuSK MG è caratterizzata da grave debolezza muscolare, manifestazioni cliniche resistenti al trattamento e crisi miasteniche, che spesso richiedono ventilazione meccanica. Di conseguenza, i pazienti richiedono spesso l'uso prolungato di immunosoppressori, che sono associati a effetti avversi a lungo termine. Data la gravità e la rarità della MuSK-MG, lo sviluppo di un modello animale sperimentale è fondamentale per far progredire nuove modalità di trattamento e una comprensione più profonda dei meccanismi fisiopatologici sottostanti. La miastenia grave autoimmune sperimentale (EAMG) funge da modello animale per MuSK-MG, imitando in modo efficace ma parziale le caratteristiche cliniche e immunologiche della MG umana. L'induzione di modelli animali autoimmuni può essere ottenuta attraverso l'immunizzazione attiva o passiva. Nel protocollo sperimentale qui presentato, l'immunizzazione attiva è stata impiegata somministrando per via sottocutanea il dominio extracellulare purificato di MuSK umano emulsionato in adiuvante completo di Freund con Mycobacterium tuberculosis ucciso termicamente. L'immunizzazione è stata eseguita in quattro siti, seguita da un'iniezione di richiamo di MuSK il 28° giorno. Questo adiuvante con M. tuberculosis consente l'attivazione del sistema immunitario attraverso TLR4 e una maggiore fagocitosi dell'antigene somministrato. Questo articolo descrive in dettaglio lo sviluppo e la caratterizzazione di MuSK-EAMG dall'inizio alla conclusione.

Introduzione

La miastenia grave (MG) è una malattia autoimmune che si sviluppa attraverso meccanismi mediati da anticorpi dipendenti dalle cellule T. È causata principalmente da anticorpi contro i recettori nicotinici dell'acetilcolina (AChR) sulla membrana postsinaptica della giunzione neuromuscolare (NMJ) nell'80%-85% dei pazienti e da anticorpi contro la chinasi muscolo-specifica (MuSK) in circa il 5% dei pazienti, nonché da altre proteine NMJ. La MG è diventata un prototipo per le malattie autoimmuni e un modello per comprendere la funzione postsinaptica¹. I modelli animali di malattie autoimmuni possono essere suddivisi in due categorie principali: (1) modelli spontanei, in cui gli animali sviluppano naturalmente una malattia autoimmune, e (2) modelli indotti, in cui la malattia autoimmune viene imitata e replicata artificialmente. Gli studi sulla miastenia grave (MG) hanno dimostrato che sia l'immunizzazione attiva che quella passiva possono indurre la malattia, contribuendo in modo significativo alla comprensione delle condizioni mediate dagli anticorpi².

Il trasferimento passivo è un metodo molto efficace per valutare gli effetti acuti delle malattie mediate da autoanticorpi ed è stato ampiamente utilizzato per studiare gli anticorpi derivati dai pazienti nella MG. Questo approccio è stato utile per ampliare la comprensione dei fattori immunologici alla base della malattia. Ad esempio, studi di trasferimento passivo hanno dimostrato l'impatto patogenetico delle IgG4 anti-MuSK sulla riduzione dei cluster AChR³. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni al modello di trasferimento passivo, come le differenze funzionali tra le IgG umane e quelle dei roditori e il sistema immunitario e l'insufficienza del modello di trasferimento passivo a imitare i meccanismi di attivazione iniziale dell'autoimmunità anti-MuSK che si verifica nei tessuti linfoidi.

D'altra parte, una potenziale limitazione degli studi di immunizzazione è la variabilità immunogenetica tra i diversi ceppi di topo⁴. Ad esempio, mentre i topi C57BL/6 (B6) sono suscettibili all'immunizzazione attiva con AChR, i topi AKR/J sono resistenti. Pertanto, quando si crea un modello animale EAMG, è fondamentale selezionare correttamente la specie animale, il metodo di immunizzazione e il contenuto del protocollo per riflettere accuratamente la malattia⁵.

Inoltre, l'utilizzo dell'antigene bersaglio come proteina intera spesso si traduce in titoli anticorpali elevati. Tuttavia, non tutti gli anticorpi possono reagire in modo crociato con l'antigene del topo o produrre epitopi che causano la malattia. Pertanto, i modelli di immunizzazione attiva non sempre riflettono accuratamente la patologia umana. Tuttavia, quando riescono a creare un fenotipo clinico e fisiologico appropriato, questi modelli forniscono una piattaforma a lungo termine per testare terapie sperimentali.

Gli studi clinici indicano meccanismi di malattia e requisiti terapeutici divergenti per MuSK-MG, evidenziando la necessità di un'ulteriore identificazione delle caratteristiche patogenetiche specifiche di questo sottotipo^{MG 4,5,6}. Precedenti studi sull'immunizzazione attiva basati sull'immunizzazione MuSK EAMG hanno mostrato un coinvolgimento predominante dell'immunità di tipo Th2 e delle IgG1 anti-topo nell'autoimmunità MuSK e hanno identificato una serie di potenziali modalità di trattamento (ad esempio, teriflunomide, cellule staminali mesenchimali, shRNA FCRLB) per MuSK MG ^7,8,9 umano. Ciò ha dimostrato l'importanza del modello MuSK EAMG nella sperimentazione di nuovi bersagli terapeutici e nello studio della fisiopatologia MuSK MG.

In questo articolo sono state descritte in dettaglio le procedure per l'induzione del modello animale, il monitoraggio della progressione della malattia e la convalida dell'induzione dell'EAMG. La valutazione clinica ha comportato il monitoraggio del peso, della postura, della forza di presa e dei punteggi clinici da parte di un osservatore. I topi sono stati soppressi 28 giorni dopo la seconda immunizzazione e vari tessuti, tra cui sangue, muscolo degli arti posteriori, milza e linfonodi ascellari e inguinali, sono stati raccolti per confermare l'instaurazione della malattia. Gli anticorpi anti-MuSK sono stati quantificati in sieri utilizzando il metodo ELISA. Inoltre, è stata eseguita una colorazione immunofluorescente sui tessuti muscolari per visualizzare i depositi nella giunzione neuromuscolare. Per dimostrare e confrontare le risposte cliniche e immunitarie in gruppi di topi con diversa suscettibilità a MuSK EAMG, i topi trattati con KCNS3 shRNA hanno mostrato un'azione proinfiammatoria (non pubblicata) e l'FCRLB shRNA ha mostrato un'azione antinfiammatoria⁹, come determinato in studi precedenti.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato etico locale per gli esperimenti sugli animali dell'Università di Istanbul (HADYEK) con la decisione numero 2020/29. Nei nostri studi precedenti ^7,8,9, il modello EAMG è stato indotto in topi BALB/c o B6 di 8-10 settimane tramite immunizzazione attiva con la proteina MuSK. Questo articolo presenta dati esemplari ottenuti da diversi esperimenti con topi BALB/C immunizzati con MuSK (4-8 topi per gruppo). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Produzione e preparazione di MuSK umano per l'immunizzazione

1. Clonare gli amminoacidi del dominio extracellulare MuSK umano 24-495 (sequenza di riferimento NCBI: NP_005583.1) nel vettore pPIC9.
2. Espressione secernente nel sistema del lievito Pichia pastoris (ceppo GS115).
3. Indurre l'espressione mediante l'aggiunta di metanolo (2,5% v/v) nel terreno di coltura.
4. Aggiungere un tag 6xHIS C-terminale per scopi di purificazione.
5. Esprimere la proteina come proteina glicosilata secreta e purificarla in condizioni native. Dializzare il terreno di coltura con 50 mM di tampone fosfato pH 8,0, 300 mM di NaCl.
6. Continuare con la cromatografia di affinità con ioni nichel utilizzando Ni²⁺/nitrilotriacetato agarosio (Ni-NTA). Conservare la proteina purificata dopo l'aggiunta del 10% di glicerolo a -80 °C, dove è stabile per almeno due anni¹⁰.
   NOTA: I livelli di espressione, stimati dopo la purificazione con Ni-NTA, sono di circa 0,4 mg/L di coltura. Non sono state rilevate altre impurità proteiche nei campioni analizzati da SDS-PAGE.
7. Prima dell'immunizzazione, verificare la purezza del dominio extracellulare isolato della proteina MuSK mediante elettroforesi su gel (Figura 1 supplementare).
8. Preparare il MuSK per ogni topo a una concentrazione di 45 μg/100 μL di PBS.
9. Omogeneizzare (emulsionare) il MuSK in un rapporto 1:1 con PBS (100 μL) e Complete Freund's Adjuvant (CFA-100 μL) contenente Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 mL) (il volume totale dell'emulsione è di 200 μL per topo).

2. Procedura di anestesia e immunizzazione

1. Prima dell'immunizzazione, diluire il propofol in PBS (rapporto 1:5).
2. Somministrare per via intraperitoneale a 50 mg/kg per topo.
   NOTA: L'isoflurano può essere utilizzato anche per l'anestesia per inalazione (seguendo protocolli approvati istituzionalmente). La concentrazione iniziale è tipicamente fissata al 3%-5% con una portata di ossigeno di 1-2 L/min, mentre la concentrazione di mantenimento è solitamente dell'1%-3% con una portata di ossigeno di 0,5-1 L/min.
3. Prima immunizzazione: iniettare un totale di 45 μg/200 μl di MuSK preparato in CFA per via sottocutanea nelle spalle e nelle zampe posteriori interne (circa 11,25 μg/50 μl per ciascuna parte).
4. Seconda immunizzazione: iniettare un totale di 45 μg/200 μL di MuSK preparato in CFA per via sottocutanea nelle spalle e nei fianchi (circa 11,25 μg/50 μL per ciascuna parte).
   NOTA: Somministrare le iniezioni due volte a intervalli di 28 giorni per stabilire il modello. La somministrazione intramuscolare è associata a dolore muscolare, che può interferire con la valutazione della debolezza clinica. Poiché l'EAMG è una malattia muscolare, l'utilizzo dell'iniezione intramuscolare può indurre debolezza non miastenica correlata al dolore e quindi agire come confondente. Si raccomanda un gruppo di controllo immunizzato solo con CFA (senza MuSK).

3. Punteggio clinico

1. Esercita i topi trascinandoli delicatamente 40 volte attraverso la griglia superiore di una gabbia mentre tentano di afferrare la griglia per indurre affaticamento, poiché i sintomi della miastenia grave nei topi diventano più pronunciati dopo l'esercizio e l'affaticamento.
2. Dopo l'esercizio, osserva attentamente i topi per i cambiamenti nell'attività, nel peso e nella forza muscolare. Assegna punteggi appropriati in base a queste osservazioni per guidare i criteri di valutazione.
   NOTA: Punteggio 0: I topi rimangono attivi e continuano a esplorare il loro ambiente; Punteggio 1: dopo l'esercizio si osserva una postura curva, ma i topi tornano alla normale attività e socialità. La toelettatura del pelo è generalmente mantenuta. Punteggio 2: Una postura curva è visibile anche prima dell'esercizio e diventa più pronunciata dopo l'esercizio. Si nota una diminuzione dell'auto-cura e dell'attività. Punteggio 3: Prima e dopo l'esercizio si osserva una postura curva drammatica. C'è una significativa diminuzione del movimento, della socievolezza e della forza muscolare, accompagnata da una perdita di peso di 1-2 grammi ogni 2-3 giorni. Si verifica disidratazione, rendendo difficile per i topi raggiungere acqua e cibo. La disidratazione è identificata dalla pelle che non ritorna rapidamente dopo essere stata pizzicata e dai cambiamenti nelle feci. I topi che soffrono sono caratterizzati da strabismo e postura curva. I topi che mostrano segni di forte dolore e perdita di peso superiore al 20% vengono sacrificati. Punteggio 4: Il topo viene trovato morto nella gabbia. Il topo deceduto deve essere rimosso immediatamente e la gabbia deve essere cambiata⁵.
3. Controlla i topi ogni giorno poiché i sintomi sono progrediti rapidamente circa 10 giorni dopo la seconda immunizzazione. Eseguire punteggi clinici e misurazioni settimanalmente per i primi 28 giorni e poi due volte a settimana.
4. Eseguire la misurazione del peso.
   NOTA: La misurazione del peso fornisce un parametro cruciale per monitorare la progressione della malattia. A causa degli alti tassi metabolici dei topi, il peso corporeo può variare in modo significativo. È importante utilizzare la stessa scala per tutte le misurazioni ed eseguire queste misurazioni alla stessa ora del giorno per coerenza.
5. Eseguire la misurazione della forza muscolare. Utilizzare un dinamometro orizzontale con un filo a griglia per misurare la forza muscolare.
   1. Esercita i topi per il punteggio clinico trascinandoli delicatamente sopra la gabbia 40 volte per indurre l'affaticamento.
   2. Posiziona immediatamente ogni mouse sulla griglia del dinamometro e tira delicatamente per la coda, assicurandoti che tutte le zampe afferrino saldamente la griglia. Considera solo le misurazioni in cui i topi afferrano la griglia con tutte e quattro le zampe.
      NOTA: Provare ad applicare una quantità uguale di forza durante ogni misurazione e si consiglia che lo stesso ricercatore esegua tutte le misurazioni per mantenere l'affidabilità e ridurre la variabilità. Poiché l'affaticabilità è il segno distintivo della debolezza MG, è necessario eseguire una serie di test della forza di presa senza misurare la forza di presa. Successivamente, sono state eseguite sette misurazioni per ciascun topo e i valori massimo e minimo sono stati scartati. La media delle restanti cinque misurazioni viene calcolata per garantire risultati affidabili.

4. Preparazione del campione di tessuto

NOTA: Sacrificare i topi 28 giorni dopo la seconda immunizzazione seguendo i protocolli approvati istituzionalmente. La raccolta di sangue, muscoli, milza e linfonodi dai topi sacrificati sarà utile per ulteriori indagini.

1. Prelievo di sangue cardiaco
   NOTA: Per raccogliere il sangue cardiaco, anestetizzare i topi utilizzando un anestetico adeguato (ad es. propofol) approvato dal comitato etico. La puntura cardiaca richiede l'anestesia ed è una procedura terminale, il che significa che gli animali devono essere soppressi subito dopo.
   1. Dopo aver anestetizzato profondamente il ratto, posizionarlo sulla schiena, aprire l'addome e localizzare il cuore, a circa 1 cm sopra la costola più bassa e leggermente a destra.
   2. Utilizzando un ago da 25-35 G, prelevare il sangue con cautela dal ventricolo sinistro con un angolo di 45 gradi senza muovere la siringa per evitare complicazioni¹¹.
   3. Trasferire i campioni di sangue in provette asciutte per la separazione del siero e/o in provette EDTA per l'isolamento dell'RNA, se previsto.
   4. Separare il siero mediante centrifugazione e conservare i campioni di siero a -20 °C fino al momento dell'utilizzo.
2. Conservazione e preparazione del campione muscolare
   1. Raccogliere il muscolo tibiale anteriore 11,12,13. Risciacquare con PBS ghiacciato.
   2. Posizionare i campioni in crioprovette, immergerli immediatamente nell'isopentano raffreddato con azoto liquido a -20 °C e conservarli in un congelatore a -80 °C.
      NOTA: I campioni devono essere congelati a scatto per ottenere risultati più accurati negli esperimenti.
   3. Posizionare i fazzoletti verticalmente su un supporto di sezionamento; Si può usare un tappo di sughero. Incorporare i campioni per la colorazione in immunofluorescenza nell'OCT (composto a temperatura di taglio ottimale).
   4. Lasciare che il tessuto galleggi sull'isopentano liquido raffreddato con azoto. Conservare in congelatore a -80 °C fino al sezionamento con un criostato.

5. Valutazione delle giunzioni neuromuscolari mediante marcatura in immunofluorescenza

1. Sezionamento e fissazione del criostato
   1. Sezionare i tessuti congelati incorporati nell'OCT a -24 °C a uno spessore di 7 μm utilizzando un criostato.
   2. Fissare le sezioni in acetone raffreddato a -20 °C. Lavare con PBS per 5 min.
   3. Lavare nuovamente il PBS contenente lo 0,4% di Triton X (PBS-T) per 10 min.
      NOTA: Una fase di permeabilizzazione può essere eseguita per correggere la conformazione delle molecole interessate dalla fissazione, garantendo un legame più accurato. La permeabilizzazione ha comportato il trattamento con PBS contenente l'1% di FBS per 10 minuti e PBS-T per altri 10 minuti.
   4. Bloccare le sezioni con PBS-T contenente il 10% di FBS per 30 minuti per evitare legature non specifiche.
2. Colorazione in immunofluorescenza
   NOTA: Per la colorazione possono essere utilizzati i seguenti anticorpi: C3, IgG, marcatore del recettore dell'acetilcolina α-bungarotossina.
   1. Diluire gli anticorpi selezionati in PBS-T contenente l'1% di FBS.
   2. Incubare al buio a temperatura ambiente per 2,5 h.
   3. Lavare le sezioni con PBS-T contenente l'1% di FBS.
   4. Contromacchia con DAPI.
   5. Conservare le sezioni fino all'esame al microscopio a fluorescenza in un ambiente buio e umido a 4 °C.
   6. Esegui l'imaging e l'analisi.
      NOTA: Le giunzioni neuromuscolari positive alla bungarotossina (BTX) in ciascuna sezione devono essere contate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Cattura immagini con ingrandimento 20x. Per l'analisi, le giunzioni neuromuscolari BTX e C3 o IgG-positive sono state contate manualmente al microscopio. Per l'analisi deve essere utilizzata la percentuale di giunzioni doppie positive rispetto al totale delle giunzioni marcate con BTX nelle sezioni seriali.

6. Macchia occidentale

1. Isolamento e quantificazione delle proteine
   1. Utilizzare campioni muscolari congelati a scatto.
   2. Preparare il tampone di lisi con inibitori della proteasi e della fosfatasi.
   3. Aggiungere 0,5 mm di perle di ossido di zirconio pari al peso del campione e 2 volte il volume del tampone di lisi.
   4. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore.
   5. Centrifugare il lisato a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
   6. Raccogliere il surnatante contenente la proteina lisato.
   7. Utilizzare un kit di dosaggio BCA o un reagente Bradford per quantificare la concentrazione proteica.
   8. Preparare i campioni di proteine alla concentrazione desiderata con il tampone di lisi. 25 μg di proteina per pozzetto sono efficaci per mostrare l'AChR.
2. Elettroforesi su gel SDS-PAGE
   1. Mescolare i campioni proteici con 4 tamponi Laemmli.
   2. Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti per denaturarli.
   3. Caricare quantità uguali di proteine e una scala proteica nei pozzetti di un gel SDS-PAGE.
   4. Far funzionare il gel a 200 V per 30 minuti (il tempo può variare tra i diversi alimentatori).
3. Trasferimento di proteine
   1. Per il trasferimento semisecco con membrana in nitrocellulosa, bagnare ogni componente con un tampone di trasferimento a freddo.
   2. Prepara il sandwich di trasferimento: spugna, carta da filtro, gel, membrana, carta da filtro, spugna.
      NOTA: Assicurarsi che non siano presenti bolle tra gli strati. Il programma di trasferimento deve essere selezionato secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
4. Blocco e incubazione degli anticorpi
   1. Bloccare la membrana nel latte in polvere scremato al 5% o BSA in TBST per 1 ora a temperatura ambiente con un leggero oscillamento.
   2. Incubare la membrana con anticorpo primario (anti-AChR) diluito in tampone bloccante al 2,5% per una notte a 4 °C con un leggero oscillamento.
   3. Lavare la membrana 3 volte per 10 minuti ciascuna in TBST.
   4. Incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato HRP (IgG HRP) diluito in tampone bloccante al 2,5% per 1 ora a temperatura ambiente.
   5. Lavare la membrana 3 volte per 10 minuti ciascuna in TBST.
5. Rilevamento e imaging
   1. Applicare il substrato ECL sulla membrana secondo le istruzioni del produttore.
   2. Cattura il segnale chemiluminescente utilizzando un sistema di imaging.
   3. Analizza le bande utilizzando il software di imaging.
      NOTA: Tenere sempre le proteine e i reagenti sul ghiaccio per evitare la degradazione. Garantire un carico equo eseguendo una proteina di pulizia (ad esempio, beta-actina, alfa-tubulina o GAPDH) come controllo. Ottimizza le concentrazioni di anticorpi e i tempi di incubazione per ottenere i migliori risultati. Dimostrare che la proteina AChR è meno espressa nei topi immunizzati con MuSK è fondamentale.

7. ELISA IgG anti-MuSK fatto in casa

1. Preparare l'antigene MuSK a una concentrazione di 0,5 μg per pozzetto in 100 μl di tampone bicarbonato di carbonato (rivestimento su piastra).
2. Erogare 100 μl della soluzione antigenica in ciascun pozzetto di una piastra per immunodosaggio.
3. Incubare la piastra per una notte a 4 °C.
4. Lavare la piastra con PBS contenente lo 0,5% di Tween 20 (soluzione di lavaggio).
5. Incubare la piastra con PBS contenente il 5% di FBS (soluzione bloccante) per 90 minuti a 4 °C per bloccare i siti di legame aspecifici (Blocking).
6. Poiché gli studi di ottimizzazione hanno mostrato alti livelli di MuSK-IgG, diluire i campioni di siero 1/50.000 in soluzione bloccante.
7. Senza lavare dopo il blocco, aggiungere i campioni di siero diluito ai pozzetti.
8. Incubare la piastra a 37 °C per 90 min.
9. Lavare la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio.
10. Diluire l'anticorpo secondario IgG di topo coniugato HRP (ab97023) 1/5000 in soluzione bloccante.
11. Aggiungere 100 μl dell'anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto.
12. Incubare la piastra a 37 °C per 90 min.
13. Lavare la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio.
14. Aggiungere 100 μl di substrato TMB a ciascun pozzetto e osservare il cambiamento di colore.
15. Arrestare la reazione al momento opportuno utilizzando 2 M H₂SO_4.
16. Misurare la densità ottica a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro.
17. Eseguire tutti i campioni in duplicati e sulla stessa piastra per coerenza.
    NOTA: Per l'analisi è necessario utilizzare i valori di densità ottica poiché non erano disponibili diluizioni standard del campione. Non ci dovrebbe essere alcun cambiamento di colore nei pozzetti di controllo negativi (bianco). È previsto un rapido cambiamento di colore, quindi la soluzione di arresto deve essere tenuta nelle vicinanze per interrompere immediatamente la reazione nei pozzetti.

Risultati

Nella valutazione e convalida del modello MuSK Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG), diversi parametri chiave e risultati sperimentali sono fondamentali per dimostrare il successo dell'induzione e della caratterizzazione del modello di malattia. Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi che confermano l'istituzione del modello MuSK EAMG.

Punteggio clinico
I topi vengono monitorati e valutati per i sintomi clinici della miastenia grave utilizzando un ...

Discussione

La MuSK-EAMG murina imita la MuSK-MG umana sia nei suoi aspetti clinici che immunopatogeni in termini di debolezza muscolare, perdita di peso dovuta a debolezza muscolare bulbare, anticorpi anti-MuSK circolanti e riduzione dell'AChR muscolare. Per quanto riguarda le tappe fondamentali e la tempistica prevista per questo modello MuSK-EAMG, i segni clinici di debolezza muscolare dovrebbero comparire entro la prima settimana dopo la seconda immunizzazione. Circa il 5% dei topi può sviluppar...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
125I-&alfa;-bungarotossina	Invitrogen	BTX T1175
2-metilbutano	Sigma-Aldrich	M32631
40 μ m Filtro cellulare	NEST	258369
96 pozzetti Piastra Maxisorp	Sigma-Aldrich	M9410
Coadiuvante Incompleto	Becton Dickinson & Co.	263910
Anti-AChR alfa1	Alomone	ANC-001
Anti-topo IgG HRP	Abcam	ab97023
Bullet Blender Storm	Next Advance		Omogeneizzatore tissutale
C3	Novus	NB200-540G
Tampone carbonato-bicarbonato Merck		C3041
Criostato	Leica	CM1860
Dinamometro Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
Microscopio a fluorescenza	Leica	DM4M
Siringa in vetro con luer lock	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
Fotometro per micropiastre, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
Kit chirurgico per topi	Kent Scientific Corparation	INSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton Dickinson & Co.
OCT Composto	Agar Scientific	AGR1180
Siringhe, 1 ml Becton	Dickinson & Co.		Siringhe 309625
, 2 mL	B. Braun	7389
Immobilizzatore universale	per animali Merck	Z756911-1EA Kit di
rilevamento blotting WesternBright Sirius-Western	Advansta	K-12043-D10	ECL