La medicina tradizionale cinese (MTC) rappresenta un ricco tesoro di opzioni di trattamento naturale e svolge un ruolo importante nell'affrontare le diverse esigenze sanitarie in tutto il mondo. Questo studio presenta un'indagine sperimentale completa sull'estrazione, la separazione e le proprietà fisico-chimiche della rutina, il componente attivo chiave di Flos sophorae immaturus.
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Articolo metodologico
Estrazione e caratterizzazione del flavonoide rutina dalla medicina tradizionale cinese Flos sophorae immaturus
In questo articolo
Sommario
Abstract
La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata a lungo un ricco deposito di soluzioni terapeutiche naturali, svolgendo un ruolo fondamentale nell'affrontare le diverse esigenze sanitarie in tutto il mondo. Tra le varie erbe utilizzate nella MTC, la Sophora flavescens è nota per la sua vasta gamma di proprietà medicinali. La sua applicazione risale a secoli fa e continua ad essere molto apprezzata nella medicina moderna, in particolare per i suoi benefici terapeutici nel trattamento delle malattie cardiovascolari. La rutina, un composto flavonoide bioattivo, è ampiamente distribuita in tutto il regno vegetale, con la più alta concentrazione riscontrata in Flos sophorae immaturus. È stato riportato che la rutina riduce l'anomala permeabilità e la fragilità capillare e agisce come agente protettivo per i vasi cardiovascolari e cerebrovascolari. Questo studio presenta un dettagliato protocollo sperimentale per l'estrazione, la separazione e la caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche della rutina derivata da Flos sophorae immaturus. Inoltre, viene introdotto e descritto il protocollo per l'estrazione dei flavonoidi dalla MTC utilizzando il metodo dell'estrazione alcalina e della precipitazione acida.
Introduzione
La Flos sophorae immaturus (FSI), il bocciolo essiccato della Sophora japonica L., è stata per secoli una pietra miliare della medicina tradizionale cinese (MTC). I suoi principali componenti attivi includono rutina, isoquercitrina, Sophorae Flos e altri flavonoidi e saponine. Questi costituenti conferiscono collettivamente una varietà di effetti farmacologici, come l'eliminazione del calore e la disintossicazione, il raffreddamento del sangue e dell'emostasi e l'abbassamento della pressione sanguigna. Nella pratica clinica, l'FSI è principalmente apprezzato per la sua capacità di proteggere la permeabilità capillare1, mantenere la funzione del sistema cardiovascolare2, raffreddare il sangue, arrestare l'emorragia e regolare il fuoco del fegato3. Le sue proprietà terapeutiche sono attribuite ad un'alta concentrazione di rutina (quercetina-3-rutinoside), un flavonoide bioattivo che costituisce fino al 20%-30% del suo peso secco4.
La rutina è un flavonoide ampiamente distribuito nelle piante. Il suo nome chimico è Que-3-O-rutina (C27H30O16) (Figura 1). A temperatura ambiente, la rutina appare come una polvere cristallina di colore giallo chiaro o giallo-verde. Il suo punto di fusione varia con la forma e la purezza dei cristalli, in genere tra 125 °C e 195 °C. La rutina presenta caratteristiche polari pronunciate: è leggermente solubile in acqua fredda, altamente solubile in solventi organici polari come etanolo e metanolo e quasi insolubile in solventi non polari come etere e cloroformio. Inoltre, la sua solubilità è sensibile al pH e aumenta significativamente in condizioni alcaline a causa della dissociazione dei gruppi ossidrilici fenolici che formano sali di sodio o potassio. Queste proprietà fisiche sono strettamente associate ai gruppi poliidrossile e glicosidico nella sua struttura molecolare5, influenzando direttamente il suo processo di estrazione e le applicazioni in medicina, cibo e altre industrie6. La rutina, sebbene onnipresente nelle piante, è più abbondante nell'FSI e mostra molteplici attività farmacologiche, tra cui stabilizzazione capillare7, antinfiammatoria, antiossidante8, antimicrobica9 ed effetti regolatori metabolici10.
Nonostante il suo potenziale clinico11, la scarsa solubilità acquosa e stabilità della rutina rappresentano una sfida per l'estrazione e la formulazione5. Per affrontare queste limitazioni, il metodo di precipitazione acida con estrazione alcalina (AEAP) è emerso come un'alternativa efficace, sfruttando il comportamento dipendente dal pH dei suoi gruppi ossidrilici fenolici.
Sulla base delle proprietà fisiche della rutina, il metodo AEAP è diventato una tecnica standardizzata per isolare la rutina dall'FSI, utilizzando la sua solubilità in soluzioni alcaline e la successiva cristallizzazione in condizioni acide12. L'AEAP sfrutta la ionizzazione commutabile a pH dei gruppi ossidrilici fenolici per migliorare la resa e ottenere l'estrazione di rutina ad alta purezza da FSI. In condizioni alcaline (pH >10), i gruppi fenolici -OH deprotano per formare ioni -O- idrofili, consentendo la completa solubilizzazione dai tessuti vegetali e riducendo al minimo la degradazione ossidativa. L'acidificazione a pH 2-3 inverte questa ionizzazione, precipitando i fenoli bersaglio con una co-precipitazione minima di impurità polari. Essendo un polifenolo con solubilità pH-dipendente, la rutina si dissolve facilmente in soluzioni alcaline (ad esempio, idrossido di sodio) ma precipita in condizioni acide a causa della protonazione del gruppo ossidrile. L'AEAP fornisce un'alternativa economica, scalabile ed ecologica, in linea con i principi della chimica verde evitando i solventi tossici13. Riflette una tendenza più ampia nella chimica dei prodotti naturali che favorisce le tecniche di separazione guidate dal pH14. Metodi comparabili sono impiegati per isolare la curcumina (dalla curcuma) e la berberina (da Coptis chinensis), sfruttando le variazioni di solubilità a specifici valori di pH per l'estrazione selettiva. Il metodo AEAP è ideale per la produzione di rutina ad alto rendimento da fonti ricche di flavonoidi come l'FSI, che richiede solo attrezzature di laboratorio di base (ad esempio, misuratori di pH, centrifughe). Per le matrici vegetali con basso contenuto di rutina o composti interferenti complessi, in futuro potrebbe essere preso in considerazione il pretrattamento dell'idrolisi enzimatica per migliorare l'efficienza dell'estrazione.
In conclusione, l'AEAP rappresenta un approccio conveniente per l'estrazione della rutina, bilanciando efficacia, sicurezza e scalabilità. Il suo ruolo nella modernizzazione della MTC evidenzia il suo potenziale nel collegare le pratiche tradizionali con gli standard farmaceutici contemporanei.
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Protocollo
La rutina è un flavonoide contenente più gruppi ossidrilici fenolici ed è solubile in soluzioni alcaline calde, seguite da acidificazione e precipitazione. Può essere estratto utilizzando il processo di precipitazione acida per estrazione alcalina. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione sperimentale
- Procurarsi i seguenti materiali: Flos sophorae immaturus (20 g), borace (0,8 g), diversi becher, polvere di calce (1,5 g), acido cloridrico concentrato, termometro e strisce reattive per il pH. Vedere la Figura 2 per una versione più grande di questa immagine.
2. Estrazione della rutina
NOTA: Utilizzare un rapporto borace/acqua di 0,8 g di borace per 200 ml di acqua. Utilizzare un rapporto di latte di calce di 1,5 g di polvere di calce per 10 ml di acqua. Regola il pH in modo rapido e preciso. Reintegrare l'acqua persa secondo necessità.
- Estrazione alcalina
NOTA: Filtrare con carta da filtro rotonda da 6 cm.- Aggiungere 250 ml di acqua e 0,8 g di borace in un becher da 500 ml. Scaldare fino a ebollizione, quindi aggiungere 20 g di Flos sophorae immaturus. Continuare a bollire per 2-3 minuti.
- Dopo l'ebollizione, regolare il pH a 8-9 con il latte di lime sotto l'agitazione. Continuare il riscaldamento per 20 min. Filtrare con garza calda fino ad ottenere un filtrato giallo-marrone.
- Estrazione per precipitazione acida
- Regolare l'estratto a pH 2-3 utilizzando acido cloridrico concentrato e lasciarlo depositare. Il passaggio da una soluzione limpida giallo-marrone a una torbida, insieme alla graduale formazione di precipitato flocculante giallo-arancio sul fondo del contenitore, indica un'efficace separazione della rutina.
- Dopo 6 ore di riposo, sottoporre il precipitato a filtrazione in aspirazione a pressione atmosferica. Raccogliere ed essiccare per ottenere rutina grezza.
NOTA: Tagliare il film filtrante in base alla dimensione dell'imbuto Brinell utilizzato (diametro 150 mm). - Lavare il precipitato con acqua fino a quando non si è neutro durante la filtrazione ad aspirazione a pressione atmosferica.
3. Raffinazione della rutina
- Dopo la pesata grossolana, ricristallizzare la rutina con acqua calda con un rapporto di solubilità di 1:200. Far bollire la soluzione acquosa per 30 minuti e filtrare mentre è calda. Assicurarsi che il volume finale della soluzione di rutina sia di 210 ml.
- Filtrare i residui. Lasciare riposare il filtrato indisturbato, quindi filtrare nuovamente ed essiccare sottovuoto in forno a 60-70 °C per ottenere rutina raffinata (Figura 3).
NOTA: Tagliare il film filtrante in base alla dimensione dell'imbuto Brinell utilizzato (diametro 150 mm).
4. Identificazione fisico-chimica della rutina
- Reazione cloridrato-sale di magnesio - identificazione dei nuclei progenitori dei flavonoidi
- Sciogliere 1-2 mL del campione in metanolo e aggiungere 50 mg di polvere di magnesio.
- Aggiungere qualche goccia di acido cloridrico concentrato. Agitare delicatamente. La soluzione dovrebbe diventare rossa (Figura 4).
- Reazione di Molisch - identificazione dei composti zuccherini
- Aggiungere una soluzione di etanolo al 10% di α-naftolo e agitare. Inclinare la provetta e aggiungere con cautela acido solforico concentrato goccia a goccia lungo la parete interna.
- Osservare la formazione di un anello marrone all'interfaccia (Figura 5).
- Reazione di inverdimento zirconia-acido citrico
- Aggiungere 1-2 mL di soluzione di α-naftolo al 10% alla soluzione di etanolo del campione. Agitare bene. Aggiungere lentamente 10 gocce di H2SO4 concentrato lungo la parete del tubo senza agitare.
- Aggiungere il 2% di soluzione di metanolo di acido citrico. Il colore della soluzione dovrebbe schiarirsi (Figura 6).
- Discriminazione di strati sottili
- Utilizzare sia la rutina raffinata che la rutina standard.
- Utilizzare cloroformio:metanolo:acido formico (15:5:1) come agente di sviluppo e una soluzione di etanolo all'1% di AlCl3 come agente cromogenico. Osservare la fluorescenza sotto una lampada UV a 365 nm.
5. Esame TLC della rutina
NOTA: Per valutare la purezza della rutina è stato utilizzato un metodo di cromatografia su strato sottile (TLC). Una piastra di gel di silice è stata utilizzata come fase stazionaria.
- Posizionare il campione di rutina raffinata e lo standard di rutina (1 mg/mL in metanolo) sulla piastra. Sviluppare la lastra in una fase mobile costituita da acetato di etile:acido formico:acqua (8:1:1, v/v/v).
- Dopo l'essiccazione, visualizzare la lastra sotto la luce UV a 254 nm.
- Calcolare il fattore di ritenzione (Rf) del punto campione e confrontarlo con lo standard.
NOTA: Un singolo punto con un valore Rf identico (circa 0,35-0,50 in queste condizioni) indica un'elevata purezza, mentre ulteriori punti suggeriscono la presenza di impurità.
6. Determinazione della purezza della rutina mediante HPLC
NOTA: La purezza della rutina è stata analizzata quantitativamente mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Le condizioni di analisi erano le seguenti: Colonna cromatografica - (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); acetonitrile (A) in fase mobile e soluzione acquosa di acido acetico allo 0,2% (B). Programma di eluizione a gradiente lineare: 0-15 min, 20%-30% A; 15-30 min, 30%-60% A. Portata-1 mL/min. Volume di iniezione-10 μL. Lunghezza d'onda di rilevamento-355 nm. Temperatura della colonna-40 °C.
- Pesare con precisione 0,1 g di polvere campione di rutina e trasferirla in una provetta da centrifuga da 10 mL. Aggiungere 5,0 ml di soluzione di etanolo al 60% e agitare accuratamente.
- Impostare il bagnomaria a temperatura costante o il forno a colonna a 30 °C e ultrasonicare il campione per 30 minuti.
- Centrifugare il campione a 55.900 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare il surnatante come soluzione di test per l'analisi HPLC.
7. Determinazione della rutina mediante LC-MS
NOTA: I composti isolati sono stati identificati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Le condizioni LC corrispondevano al metodo HPLC. La spettrometria di massa è stata eseguita utilizzando la ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità ioni negativi con una tensione capillare di 3,5 kV. Temperatura di desolvatazione-350 °C; Intervallo di scansione di massa-m/z 100-1000.
- Pesare 10 mg di campione di rutina purificata e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 mL. Aggiungere 0,6 mL di DMSO deuterato utilizzando una pipetta fino a quando il campione non è completamente disciolto. Preparare le soluzioni standard di rutina utilizzando la stessa procedura.
- Analizzare i campioni e gli standard trattati utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica (1H NMR).
- Elaborare i dati spettrali utilizzando un software compatibile15.
- Confronta i dati spettrali con la letteratura o i riferimenti di database come NIST o PubChem per la verifica.
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Risultati
Nell'esperimento di identificazione fisico-chimica della rutina, la soluzione è diventata rossa dopo l'aggiunta di polvere di magnesio e una piccola quantità di acido cloridrico concentrato, seguita da agitazione, indicando la presenza di un nucleo genitore flavonoide. Nella reazione di Molisch, un anello viola si è formato all'interfaccia, indicando un risultato positivo e la presenza di frazioni zuccherine nella struttura molecolare. La soluzione del campione è diventata giallo brillante dopo l'aggiunta del reagente cl...
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Discussione
L'estrazione della rutina si basa principalmente sul metodo6 di precipitazione acida con estrazione alcalina, che offre i vantaggi di semplici requisiti di apparecchiature, facilità d'uso, alta efficienza e basso costo. Questa tecnica è spesso integrata dall'estrazione assistita da microonde (MAE)7 e dall'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE)8, che riducono il consumo di reagenti, accelerano i tempi di estrazione ...
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Dichiarazioni
Gli autori di questo articolo dichiarano di aver divulgato tutti i conflitti di interesse che potrebbero essere sorti nel corso della conduzione di questa ricerca e della stesura di questo articolo. Confermiamo di non avere relazioni finanziarie, personali o professionali che potrebbero potenzialmente influenzare la nostra interpretazione dei risultati o delle conclusioni presentate in questo lavoro. In particolare, non abbiamo legami con aziende farmaceutiche, istituti di ricerca o altre entità che potrebbero beneficiare dei risultati qui riportati. Infine, affermiamo che i nostri risultati e le nostre conclusioni si basano esclusivamente sui dati e sulle analisi presentate in questo documento e non sono influenzati da fattori esterni. Rimaniamo impegnati a rispettare i più alti standard di integrità accademica e condotta etica in tutte le nostre attività di ricerca.
Ringraziamenti
Desideriamo esprimere la nostra profonda gratitudine al Laboratorio di Chimica Farmaceutica dell'Università di Medicina Cinese di Pechino per aver fornito la piattaforma sperimentale. Il loro supporto e le loro risorse sono stati inestimabili nella conduzione delle nostre ricerche e dei nostri esperimenti. Apprezziamo profondamente la loro dedizione all'eccellenza scientifica e il loro impegno nel promuovere lo sviluppo dei giovani ricercatori.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-Naftol | MACKLIN | C16245764 | |
| Acido acetico | MACKLIN | C12662811 | |
| Acetonitrile | MACKLIN | C16129374 | |
| Cloruro di alluminio | MACKLIN | C16485922 | |
| Acido citrico | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20230306 | |
| Etanolo | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20250102 | |
| Acetato di etil | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Pechino Tongrentang | 10092026329782 | |
| Acido formico | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20150402 | |
| MestReNova | Ricerca Mestrelab | / | |
| Metanolo | innochem | C16365684 | |
| Gel di silice 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Ottaidrato di cloruro di zircone | MACKLIN | C15350627 |
Riferimenti
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