Articolo metodologico

Fabbricazione del dispositivo di fissazione dell'elettroagopuntura del topo per il pretrattamento dell'elettroagopuntura nel modello murino della cardiomiopatia diabetica

DOI:

10.3791/67427

⸱

18 aprile 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Acupuncture, Affiliated Hospital of Hubei University of Chinese Medicine, 4Hubei Province Academy of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello murino di cardiomiopatia diabetica e un dispositivo di fissazione dell'elettroagopuntura murina per l'uso dell'elettroagopuntura nei topi, che può fissare i topi più delicatamente durante il trattamento.

Abstract

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La cardiomiopatia diabetica (DCM) è una complicanza del diabete che può progredire fino all'insufficienza cardiaca ed è limitata dall'uso di farmaci. L'elettroagopuntura è un modo efficace come metodo di trattamento esterno della medicina tradizionale cinese per trattare la cardiomiopatia diabetica. Un dispositivo di fissazione per elettroagopuntura per topi può fissare facilmente e delicatamente i topi durante il trattamento di elettroagopuntura ed esporre i punti di agopuntura sull'addome e sugli arti dei topi. Questo articolo descrive i metodi utilizzati per fabbricare il dispositivo di fissazione dell'elettroagopuntura del topo con tutti i passaggi e le precauzioni, stabilendo un modello murino di cardiomiopatia diabetica con misure complete per registrare in modo completo i cambiamenti negli indici biochimici del sangue come la glicemia. L'esperimento è stato condotto con 3 gruppi: un gruppo di controllo, un gruppo modello e un gruppo di pretrattamento, con 10 topi in ciascun gruppo. Il gruppo di pretrattamento è stato trattato con l'elettroagopuntura dei punti di agopuntura di Biaoben una volta a giorni alterni per un totale di 7 sessioni. Dopo l'elettroagopuntura, i topi nel gruppo pretrattamento hanno mostrato una diminuzione della glicemia accompagnata da una riduzione dei sintomi del diabete.

Introduzione

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La cardiomiopatia diabetica (DCM) è una complicanza comune del diabete mellito, caratterizzata da alterazioni della struttura cardiaca e della funzione diastolica e contrattile ventricolare di una lesione specifica, che si sviluppa ulteriormente in insufficienza cardiaca. È una delle principali cause di morte nei pazienti con diabete mellito 1,2 e la sua crescente prevalenza ha attirato un'attenzione diffusa negli ultimi anni3. È stato riscontrato che la patogenesi di questa malattia comprende principalmente insulino-resistenza, risposta infiammatoria, metabolismo lipidico anormale, stress ossidativo, danno mitocondriale 4,5.

Attualmente, il trattamento clinico della cardiomiopatia diabetica si basa principalmente su farmaci orali per il controllo della glicemia e l'alleviamento dei sintomi delle malattie cardiache, ma presenta alcune limitazioni, come le reazioni ai farmaci, gli effetti della funzione renale e la dipendenza da farmaci a lungo termine6. L'agopuntura, come metodo di trattamento esterno della medicina tradizionale cinese, ha un effetto di regolazione migliore sulla glicemia, sui lipidi nel sangue e sulla risposta infiammatoria nei pazienti con cardiomiopatia diabetica e l'efficacia clinica è notevole7. L'agopuntura non ha effetti negativi sulle funzioni gastrointestinali e renali e il trattamento a lungo termine non produce dipendenza. La teoria dei punti di agopuntura di Biaoben è un metodo importante per selezionare e utilizzare i punti di agopuntura nella teoria tradizionale dell'agopuntura8. Definisce i punti di agopuntura che possono migliorare i sintomi delle malattie come punti di agopuntura Biao, e i punti di agopuntura che possono regolare le funzioni di base del corpo legate alle malattie e trattare le cause alla radice delle malattie sono chiamati punti di agopuntura Ben. La stimolazione dei punti di agopuntura Biao e Ben allo stesso tempo con l'agopuntura può raggiungere lo scopo di trattare le malattie, nonché aumentare la resistenza del corpo alle malattie e prevenire l'esacerbazione e la ricorrenza delle malattie9. Può prevenire l'aggravamento e la recidiva della malattia. La ricerca moderna ha dimostrato che l'agopuntura con i punti di agopuntura Biaoben è efficace per il diabete e le sue numerose complicanze, tra cui cardiopatia diabetica, nefropatia diabetica, retinopatia diabetica, piede diabetico e così via10,11. Uno schema di selezione dei punti di agopuntura in linea con la teoria dei punti di agopuntura Biaoben consiste nel selezionare PC6 (Neiguan), che può regolare le funzioni del cuore e migliorare la risposta infiammatoria come il punto di agopunto Biao12, e ST36 (Zusanli), che può migliorare la glicemia e la situazione glicemica, migliorare la resistenza all'insulina e ridurre lo stress ossidativo, come il punto di agopuntoBen 13.

I modelli animali sono uno strumento importante nello studio della cardiomiopatia diabetica perché è stato dimostrato sperimentalmente che i modelli di ratto o di topo imitano bene le anomalie strutturali e i cambiamenti funzionali del cuore causati dalla cardiomiopatia diabetica e forniscono i campioni necessari per gli indici di rilevamento biochimico della cardiomiopatia diabetica14,15. L'uso di mangimi ad alto contenuto di zuccheri e grassi combinati con una soluzione di streptozotocina per indurre i topi può portare alla formazione di modelli diabetici in 4-5 settimane, accorciando efficacemente il tempo di modellazione e migliorando il tasso di successo, e non ci sono requisiti speciali per l'ambiente di allevamento16,17. La cardiomiopatia diabetica è un tipo di cardiomiopatia causata dal danno alla struttura e alla funzione cardiaca causato dall'iperglicemia continua. Con il prolungamento del decorso della malattia, il modello di cardiopatia diabetica può essere sviluppato naturalmente dal modello diabetico in condizioni di iperglicemia a lungo termine 18,19,20. Il pretrattamento dell'agopuntura si riferisce al pretrattamento dei topi dopo la formazione del diabete e prima della formazione di un'evidente lesione miocardica. Tuttavia, dopo ripetute stimolazioni sperimentali, i topi spesso diventano mobili e difficili da immobilizzare, e le tecniche di manipolazione sperimentale violente possono causare lesioni ai topi o renderli maniacali o depressi21. Pertanto, è necessario un metodo adatto per immobilizzare i topi. I metodi comunemente usati per l'immobilizzazione del topo includono l'anestesia e la reggiatura22. Sebbene il metodo dell'anestesia possa esporre meglio i punti di agopuntura, può influenzare la conduzione nervosa e, in ultima analisi, influenzare i risultati sperimentali. Il metodo di reggiatura è un metodo di immobilizzazione fisica e non produce gli stessi effetti fisiologici dell'anestesia, ma i topi legati sperimenteranno una tensione significativa, un aumento del tono muscolare e una maggiore defecazione22,23. Inoltre, l'ago non può raggiungere facilmente la posizione desiderata. Qui, presentiamo un dispositivo di fissazione dell'elettroagopuntura del mouse che può essere utilizzato per garantire che i topi non si muovano e espongano anche i punti di agopuntura durante il trattamento di elettroagopuntura in modo che il trattamento di elettroagopuntura possa essere eseguito in modo conveniente, sicuro, non violento e senza sequele.

Questo articolo descrive in dettaglio la fabbricazione del dispositivo di fissazione dell'elettroagopuntura del topo e la creazione di un modello murino di cardiomiopatia diabetica. Abbiamo trattato la cardiomiopatia diabetica con l'elettroagopuntura dei punti di agopuntura Biaoben pretrattamento, dimostrato come il suo funzionamento è stato realizzato sul dispositivo di fissazione dei topi e valutato l'effetto terapeutico del pretrattamento dell'elettroagopuntura dei punti di agopuntura Biaoben sulla cardiomiopatia diabetica misurando gli indici relativi al metabolismo dei glicolipidi.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono conformi al principio delle 3R dell'etica animale e sono stati esaminati e approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Hubei (numero di autorizzazione etica HUCMS00309300). Qui, 30 topi di grado SPF sono stati ottenuti dal Centro provinciale per il controllo e la prevenzione delle malattie di Hubei (certificato di qualità n. 42010200009690).

1. Fabbricazione del dispositivo di fissazione per elettroagopuntura

  1. Per il montaggio di un dispositivo di fissazione per elettroagopuntura, procurarsi un tubo di plastica cavo in acrilico trasparente e uno strumento per terapia di elettroagopuntura come corpo principale (Figura 1A). Nel tubo mantenere un corpo del tubo e preparare le linguette di chiusura situate nelle aperture a ciascuna estremità. Praticare delle scanalature nel tubo cavo al centro di ciascuna estremità e fissare le linguette di chiusura nelle scanalature a ciascuna estremità utilizzando viti ruotabili manualmente.
  2. Al centro del tubo cavo, praticare tre fori ovali lunghi circa 2 cm e larghi 1 cm distribuiti adiacenti l'uno all'altro. I fori su entrambi i lati vengono utilizzati per estrarre gli arti anteriori del topo per il fissaggio per il trattamento di elettroagopuntura degli arti anteriori e il foro al centro può essere utilizzato per esporre i punti di agopuntura delle regioni toraciche e addominali del topo per il trattamento di elettroagopuntura delle regioni toraciche e addominali.
  3. All'estremità del tubo cavo, praticare un foro ovale distribuito simmetricamente su entrambi i lati della scanalatura centrale, che può essere utilizzato per estrarre gli arti posteriori del topo per il trattamento di elettroagopuntura degli arti posteriori (Figura 1B).
  4. Verificare l'integrità del tubo cavo in plastica e installare le linguette di chiusura. Spostare le linguette di chiusura nel corpo del tubo mentre le viti scorrono nelle scanalature, assicurandosi che possa regolare la lunghezza di fissaggio in base alla lunghezza del mouse.
  5. Accendere lo strumento per la terapia di elettroagopuntura e assicurarsi che sia operativo. Ogni pulsante può essere regolato premendolo una volta (Figura 1C).
  6. Preparare lo strumento per l'elettroagopuntura da posizionare accanto ai tubi di plastica cavi per l'esecuzione di trattamenti di elettroagopuntura sui topi. Lo strumento per la terapia dell'elettroagopuntura è costituito da una macchina per la terapia dell'elettroagopuntura e da diverse coppie di clip energizzanti; Ogni coppia di clip energizzanti può fornire due poli di eccitazione.
  7. Quando si utilizzano le clip per agganciare l'impugnatura dell'ago per eccitare l'ago, utilizzare una clip per fissare l'ago.
  8. La macchina per la terapia dell'elettroagopuntura ha 11 pulsanti. Utilizzare i 5 superiori per impostare la frequenza, il tempo e la forma d'onda dell'elettroagopuntura e vengono utilizzati da sinistra a destra per frequenza, tempo, onda continua, onda rada e densa e onda intermittente. Utilizzare il 6 inferiore per impostare l'intensità di corrente dell'elettroagopuntura. Ognuno di questi pulsanti ha una tacca sotto di esso per il fissaggio di clip energizzanti; Il numero di clip energizzanti può aumentare o diminuire con il numero di topi, fino ad un massimo di 6.

2. Stabilire un modello murino di cardiomiopatia diabetica

  1. Dividi i 30 topi in 3 gruppi con il metodo della tabella dei numeri casuali: un gruppo di controllo, un gruppo modello e un gruppo di pretrattamento, con 10 topi in ogni gruppo. Sottoporre un totale di 20 topi nel gruppo modello e nel gruppo di pretrattamento per stabilire il modello di cardiomiopatia diabetica. Trattare il gruppo di pretrattamento con l'elettroagopuntura dei punti di agopuntura Biaoben.
    NOTA: Il modello è stato costruito in un lungo periodo di tempo e una cardiomiopatia significativa si sviluppa dopo 16 settimane. Il nostro tempo di trattamento va dal giorno 36 al giorno 70 (dalla settimana 6 alla settimana 10). Questo trattamento è stato selezionato dopo l'instaurazione del diabete ma prima di un danno miocardico significativo. Alla fine delle 6 settimane, il cuore del topo è stato rimosso e gli è stata riscontrata una significativa cardiomiopatia diabetica. Pertanto, la selezione del trattamento in questo momento appartiene alla categoria del pretrattamento.
  2. Nutrire i topi del gruppo di controllo con cibo normale per 16 settimane. Nutrire i topi del gruppo modello e del gruppo di pretrattamento con una dieta ricca di grassi e zuccheri per 16 settimane per indurre uno stato metabolico molto simile alla condizione diabetica. La composizione del mangime ad alto contenuto di grassi e zuccheri è il 67,0% di cibo standard, il 10,0% di strutto, il 2,5% di colesterolo, il 20,0% di saccarosio e lo 0,5% di sali biliari.
  3. Iniettare per via intraperitoneale la soluzione di streptozotocina per stabilire un modello di cardiomiopatia diabetica murina.
    1. Preparare la soluzione all'1% di streptozotocina il giorno 29. Sciogliere la streptozotocina in un tampone preparato mescolando acido citrico con citrato trisodico (pH = 4,4).
    2. Fornire solo acqua e niente cibo per 12 ore il giorno 29. Quindi, somministrare a ciascun topo una singola iniezione intraperitoneale di 150 mg/kg di soluzione di streptozotocina come descritto di seguito.
    3. Afferra il mouse per la coda con la mano destra e spostalo fuori dalla gabbia. Posiziona il topo sulla superficie della gabbia e tira delicatamente fuori la coda. Immobilizza il mouse con la mano sinistra e capovolgilo per esporre l'addome.
    4. Iniettare il topo per via intraperitoneale utilizzando la mano destra con una siringa da 1 ml preparata con la quantità appropriata di soluzione di streptozotocina già prelevata.
  4. Eseguire il trattamento di agopuntura con i punti di agopuntura Biaoben.
    1. Seleziona i punti di agopuntura secondo la teoria dei punti di agopunturaBiaoben 13 inclusi PC6 bilaterali e ST36. Per il gruppo di pretrattamento, eseguire l'agopuntura il giorno 36, una volta a giorni alterni per un totale di 18 trattamenti, con il trattamento della durata totale di 5 settimane (dal giorno 36 al giorno 70; Figura 2).
      1. Agopunto Biao: selezionare PC6 bilaterale come agopunto Biao; il PC6 si trova sul lato mediale dell'arto anteriore, tra le suture ulnare-radiali a circa 3 mm dalle articolazioni del polso. Agopunto Ben: selezionare ST36 bilaterale come agopunti Ben; l'ST36 si trova nella parte posteriore-laterale dell'articolazione del ginocchio, circa 2 mm sotto la tuberosità fibulare.
    2. Afferra il topo, pizzica la sua coda e posizionalo sulla superficie della gabbia. Tenere l'imboccatura del tubo di plastica cavo in acrilico ad un angolo di 30° rispetto al piano orizzontale, con il piccolo foro al centro rivolto verso il suolo e l'imboccatura del tubo allineata con la testa del topo.
    3. Posizionare la testa del mouse all'imboccatura del tubo. Ruota lentamente la testa del mouse nel tubo con un movimento volontario e una leggera spinta. Picchiettare delicatamente le natiche del topo in modo che il topo venga spinto autonomamente e completamente nel tubo.
    4. Regolare le linguette di chiusura, sollevare la coda del mouse dalla scanalatura, serrare il dado e utilizzare le linguette di chiusura alle estremità superiore e inferiore per limitare il movimento del mouse. A questo punto, il mouse non può più muoversi liberamente nel corpo del tubo.
    5. Usa le pinzette per estrarre delicatamente i quattro arti del mouse da ciascuno dei quattro piccoli fori su entrambi i lati. Dopo che i quattro arti sono stati estratti dai piccoli fori, fissarli delicatamente all'esterno del corpo del tubo. A questo punto, i quattro arti del topo non potevano più essere spostati.
    6. Tenere il manico dell'ago monouso in acciaio inossidabile (0,3 mm x 13 mm) con il pollice e l'indice della mano destra e tenere il tubo acrilico e i topi immobili con la mano sinistra.
    7. Tocca e individua il punto in cui si trovano PC6 e ST36 con il dito medio della mano destra, quindi pungi delicatamente la pelle del mouse con la punta dell'ago. Inserire rapidamente l'ago iniettato obliquamente di circa 3 mm e rimuovere rapidamente la mano destra.
  5. Eseguire il pretrattamento di elettroagopuntura
    1. Accendere la macchina per la terapia dell'elettroagopuntura e regolare l'onda intermittente, 1 Hz. Per ogni topo, eseguire un trattamento di elettroagopuntura per 15 minuti.
    2. Utilizzare la clip energizzata corrispondente della macchina per terapia di elettroagopuntura per tenere l'impugnatura dell'ago, una clip per l'impugnatura dell'ago.
    3. Regolare la corrente del pulsante con la clip fissata a 1 mA (Figura 3).
    4. Attendere 15 minuti e osservare lo stato dei topi durante il pretrattamento di elettroagopuntura.
    5. Al termine del trattamento, rilasciare la clip e rimuovere l'ago per agopuntura. Regolare le linguette di chiusura e rilasciare i topi dal dispositivo di fissazione dell'elettroagopuntura.
    6. Esamina l'intero corpo dei topi e osserva se i topi sono feriti o presentano anomalie.
  6. Eseguire trattamenti di agopuntura a giorni alterni dopo 7 giorni dall'iniezione di soluzione di streptozotocina per un totale di 18 trattamenti su un dispositivo di elettroagopuntura per topi dal giorno 36 al giorno 70.
  7. Terminare l'esperimento il giorno 112 (fine della settimana 16).
    1. Anestetizzare mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 2% e confermare l'anestesia mediante risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Misurare la funzione cardiaca dei topi utilizzando un'ecocardiografia.
      1. Registrare il diametro telediastolico del ventricolo sinistro (LVEDD), il diametro telesistolico del ventricolo sinistro (LVESD), la frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF) e l'accorciamento frazionario del ventricolo sinistro (LVFS).
    2. Eutanasia i topi per lussazione cervicale. Togliere il cuore, lavare in soluzione fisiologica e immergere in paraformaldeide al 4%.

3. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)

  1. Disidratare, incorporare, affettare, decerare il cuore ed eseguire la colorazione HE secondo la procedura standard.
  2. Osservare i cambiamenti patologici del tessuto cardiaco di topo al microscopio ottico.

4. Osservazioni sui topi

  1. Misurare la glicemia utilizzando un glucometro nei giorni 27, 36 e 49.
  2. Osserva quanto mangiano i topi, quantifica l'assunzione di acqua e il volume di minzione ogni giorno e registra le loro variazioni di peso.

5. Analisi statistica

  1. Raccogli i dati sulla glicemia e utilizza l'ANOVA unidirezionale per identificare la significatività statistica. Stabilire la significatività statistica come p < 0,05.
  2. Quantificare i dati da parte di assistenti che sono ciechi alle condizioni sperimentali. Esprimere i dati come media ± deviazione standard.

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Risultati

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Abbiamo seguito la procedura sopra descritta e abbiamo stabilito un modello murino di cardiomiopatia diabetica. Come si può osservare nelle immagini colorate con HE (Figura 4), i topi del gruppo di controllo avevano una struttura del tessuto miocardico intatta, una disposizione regolare dei cardiomiociti e nessuna lesione evidente. Nel gruppo modello, le cellule miocardiche erano disposte in modo irregolare, alcune cellule miocardiche erano danneggiate e disintegrate (freccia nera) e nell'in...

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Discussione

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In questo studio, i topi che avevano una glicemia alta e mostravano segni di diabete sono stati ottenuti mediante iniezione intraperitoneale della soluzione di streptozotocina, che è un metodo efficace e riconosciuto di modellazione27. PC6 è stato selezionato come punto di Biao e ST36 è stato selezionato come punto di Ben secondo la teoria dei punti di agopuntura di Biaoben28. Tutti questi punti si trovano sugli arti del topo, quindi i tubi...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato da una sovvenzione del progetto congiunto 2022CFD024 della Hubei Natural Science Foundation; Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina, n. 81704142; Hubei University of Traditional Chinese Medicine 2023 progetto di ricerca scientifica speciale chiave di costruzione di prima classe, 2023ZZXT005; Studiare il meccanismo del precondizionamento dell'elettroagopuntura dei punti di agopuntura Biaoben sulla regolazione della ferroptosi delle cellule miocardiche nei ratti con danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI) nell'ambito del progetto chiave dell'Amministrazione provinciale di medicina tradizionale cinese di Hubei, ZY2025D001; Progetto di innovazione della conoscenza dell'Ufficio per la scienza e la tecnologia di Wuhan, n. 2023020201010172; Progetto di ingegneria dei talenti di Hubei Shi Zhen, E Wei Han [2024]256.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
plastica cavaHenan ZhikeZK-GDQ
ago per agopunturaHwato0,3 mm x 13 mm
C57BL / 6  topiHubei Centro provinciale per il controllo e la prevenzione
acido citrico monoidratoSigmaC1909
strumento per terapia di elettroagopunturaHwatoSDZ-V
bilancia elettronicaHenan ZhikeZK-DST
glucometriLifeScanOneTouch VerioVue
striscia reattiva per glucosioLifeScanOneTouch Verio
streptozotocinaSigmaS0130
citrato trisodico diidratoSigmaW302600
pinzetteLabshark130302001
acrilico delle malattie

Riferimenti

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