Articolo metodologico

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione

DOI:

10.3791/67436

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1 novembre 2024

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1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I periciti retinici sono essenziali per lo sviluppo vascolare e la stabilità della retina, svolgendo un ruolo chiave nel mantenimento dell'integrità del sistema vascolare retinico. Per fornire una visione dettagliata delle caratteristiche morfologiche dei periciti, questo studio ha descritto un nuovo approccio che combina l'iniezione retro-orbitale di un agente fluorescente, la colorazione immunofluorescente e il trattamento di pulizia dei tessuti. In primo luogo, la lectina fluorescente di pomodoro è stata iniettata nel seno retro-orbitale del topo vivo per marcare la vascolarizzazione retinica. Dopo 5 minuti, il topo è stato sacrificato e la sua retina intatta è stata accuratamente rimossa dalla coppa retinica e colorata in immunofluorescenza con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine per rivelare i periciti. Inoltre, la retina colorata è stata trattata con un reagente per la pulizia dei tessuti e l'intero è stato montato sul vetrino del microscopio. Attraverso questi approcci, la vascolarizzazione retinica e i periciti sono stati chiaramente osservati nella retina trasparente. Sotto un microscopio confocale, abbiamo ottenuto maggiori opportunità di acquisire immagini ad alta risoluzione per ricostruire e analizzare ulteriormente le caratteristiche morfologiche dei periciti lungo l'albero vascolare retinico in una vista tridimensionale. Metodologicamente, questo protocollo offre un approccio efficace per la visualizzazione dei periciti all'interno del sistema vascolare retinico, fornendo preziose informazioni sul loro ruolo sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Introduzione

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I periciti retinici sono incorporati all'interno della membrana basale lungo il lato abluminale delle cellule endoteliali vascolari, mostrando un modello a rete di processi a corto raggio avvolti attorno ai vasi sanguigni retinici1. Questo intimo contatto tra i periciti e il sistema vascolare retinico contribuisce a mantenere l'omeostasi ambientale della retina2. Sebbene numerosi studi abbiano fornito prove morfologiche della presenza di periciti nel sistema vascolare retinico, la maggior parte della nostra comprensione delle caratteristiche morfologiche dei periciti retinici proviene da tecniche istologiche convenzionali3.

In linea con questi studi, abbiamo progettato questo studio per mostrare efficacemente più dettagli morfologici dei periciti nella microvascolarizzazione retinica combinando le tecniche istologiche tradizionali con i moderni metodi scientifici all'avanguardia. L'approccio qui integra tre tecniche chiave: iniezione retro-orbitale di lectina di pomodoro fluorescente in topi vivi, colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR-β) e la strategia di pulizia dei tessuti a base di solvente. L'iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro si è dimostrata efficace e affidabile per l'osservazione della vascolarizzazione retinica di topo sia in vivo che in vitro 4,5. Il PDGFR-β funge da biomarcatore comunemente usato per la colorazione immunofluorescente dei periciti6. Per acquisire immagini ad alta risoluzione dei periciti all'interno delle retine più spesse e a montatura intera, la strategia di pulizia dei tessuti migliora la trasparenza istologica 2,7,8.

Sebbene ciascuna di queste tecniche sia stata applicata individualmente negli studi sulla retina, la loro compatibilità combinata per lo studio dei periciti nel sistema vascolare retinico del topo rimane incerta. Poiché lo spessore medio della retina del topo è di circa 180-220 μm9, la marcatura degli anticorpi e l'imaging confocale in questo tessuto spesso senza trattamento di eliminazione spesso provocano segnali di fondo elevati, complicando l'osservazione della relazione spaziale tra periciti e vasi sanguigni10. Attraverso gli approcci qui descritti, miriamo a fornire un metodo semplice per visualizzare i periciti all'interno del sistema vascolare retinico in una vista tridimensionale (3D) al microscopio confocale. Questa maggiore informazione cellulare proveniente dai periciti nel sistema vascolare retinico potrebbe migliorare la nostra comprensione dell'omeostasi ambientale retinica e sottolineare le potenziali strategie per la protezione vascolare, migliorando così i risultati funzionali nei disturbi vascolari retinici.

Protocollo

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Per questo studio, sono stati utilizzati tre giovani topi maschi adulti C57BL/6 (8-10 settimane, del peso di 20-25 g). Sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 ore con temperatura e umidità controllate e hanno avuto libero accesso al cibo e all'acqua. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (approvazione n. 2023-03-14-04) e condotto in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

1. Iniezione retro-orbitale in vivo di lectina fluorescente di pomodoro

  1. Iniettare 50 mg/kg di pentobarbital per via intraperitoneale per anestetizzare il topo. Valutare la profondità dell'anestesia valutando l'assenza di una risposta a uno stimolo di pizzicamento delle dita dei piedi.
  2. Posizionare il mouse nella posizione sdraiata laterale destra con la testa rivolta a sinistra.
  3. Premere delicatamente due dita sull'area periorbitale per esporre l'occhio sinistro del topo per consentire la somministrazione più semplice dell'iniezione nel seno retroorbitale sinistro dell'animale11.
  4. Utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago da 27 G per perforare delicatamente circa 2-3 mm nel seno venoso orbitale del topo con lo smusso dell'ago rivolto in avanti con un angolo di 45°.
  5. Iniettare 0,1 mL (1 mg/mL) di lectina fluorescente di pomodoro nel seno venoso orbitale del topo.

2. Perfusione ed enucleazione degli occhi

  1. A 5 minuti dall'iniezione retro-orbitale, iniettare una soluzione di tribromoetanolo (250 mg/kg) per via intraperitoneale per anestetizzare profondamente il topo. Successivamente, sopprimere l'animale tramite dissanguamento e perfusione cardiaca. Una volta interrotta la respirazione, aprire la cavità toracica con le forbici chirurgiche12.
  2. Una volta interrotta la respirazione, aprire la cavità toracica con le forbici chirurgiche. Sterilizzare preventivamente gli strumenti chirurgici e operare in cappa aspirante. Utilizzare un ago da 24 G e inserirlo per 2 mm nel ventricolo cardiaco sinistro attraverso l'apice ventricolare sinistro. Eseguire la perfusione a una velocità di 3 mL/min con 20 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% seguiti da 20 mL di formaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
  3. Posiziona il topo sacrificato su un fianco e rimuovi la pelle coprendo gli occhi con le forbici. Enuclea gli occhi con forbici e pinze.
  4. Tagliare il nervo ottico e i tessuti circostanti, quindi sollevare l'occhio e trasferirlo su una piastra a 12 pozzetti per la post-fissazione in formaldeide al 4% in 0,1 M PB per 2 ore.
  5. Crioproteggere il tessuto con saccarosio al 25% in 0,1 M PB (pH 7,4) a 4 °C fino a quando non affonda sul fondo della soluzione.
    NOTA: Poiché il tessuto oculare si disidrata bene in una soluzione di saccarosio, la retina può essere staccata più facilmente e completamente, facilitando successivi studi completi.

3. Dissezione delle retine

  1. Trasferire gli occhi in una capsula di Petri contenente 0,1 M PB (pH 7,4) utilizzando una pipetta di plastica Pasteur.
  2. Forare il bordo della cornea con forbici affilate, tagliare intorno alla cornea e all'iride e gettare.
  3. Usa il forcipe per rimuovere il cristallino e l'umor vitreo. Quindi, allontanare la retina a forma di coppa dal centro dell'occhio con una pinza fine. Sciacquare la retina con 0,1 M PB (pH 7,4) in una capsula di Petri pulita.

4. Colorazione immunofluorescente e pulizia tissutale della retina

  1. Rimuovere con cautela la retina a forma di coppa e incubarla in una soluzione di Triton X-100 al 2% in 0,1 M PB (pH 7,4) per una notte a 4 °C.
  2. Trasferire la retina nella soluzione bloccante (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% sodio azide + 10% siero d'asino normale) e ruotare a 72 giri/min sullo shaker per una notte a 4 °C.
  3. Trasferire la retina nella soluzione contenente gli anticorpi primari di capra anti-PDGFR-β (10 μg/mL) in tampone di diluizione (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% sodio azide + 1% siero d'asino normale) in una provetta da microcentrifuga e ruotare sullo shaker per 2 giorni a 4 °C.
  4. Lavare la retina 2 volte con un tampone di lavaggio (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) a temperatura ambiente, quindi conservarla nel tampone di lavaggio per una notte a 4 °C sullo shaker.
  5. Il giorno successivo, trasferire la retina nella soluzione miscelata contenente l'anticorpo secondario 1 mg/mL di asino anti-capra 488 e 0,2 ng/mL di nucleare fluorescente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in una provetta da microcentrifuga e ruotare a 72 giri/min sull'agitatore per 5 ore a 4 °C.
  6. Lavare la retina in una piastra a 6 pozzetti con tampone di lavaggio per 1 ora, 2x, a temperatura ambiente. Tenere la retina nel tampone di lavaggio sullo shaker per una notte a 4 °C. Eseguire l'imaging e l'analisi come indicato al passaggio 5 per ottenere le viste prima della pulizia dei tessuti.
  7. Trasferire la retina nel reagente per la pulizia dei tessuti e ruotarla delicatamente a 60 giri/min sull'agitatore per 1 ora a 37 °C.
  8. Dopo il trattamento di pulizia dei tessuti, sciacquare la retina a forma di coppa con 0,1 M PB (pH 7,4) in una capsula di Petri pulita.
  9. Praticare 4 incisioni radiali raggiungendo circa 2/3 del raggio della retina utilizzando le forbici a molla per creare una forma a petalo.
  10. Appiattire e montare la retina su un vetrino da microscopio, quindi rimuovere il PB in eccesso con un piccolo pezzo di carta assorbente. Tenere l'interno della retina rivolto verso l'alto sul vetrino.
  11. Circondare la retina montata con uno spaziatore e riempire lo spazio vuoto con un reagente fresco per la pulizia dei tessuti e un vetrino coprioggetti.

5. Imaging e analisi

  1. Ottenere le viste esterne della retina prima (dopo aver completato il passaggio 4.6) e dopo il trattamento di pulizia dei tessuti.
  2. Scansiona le viste di montaggio della retina etichettata con lo scanner panoramico per fette di tessuto. Utilizzare una lente obiettivo 2x con NA di 0,08.
  3. Scatta le immagini con ingrandimento più elevato con il sistema di imaging confocale dotato dei seguenti obiettivi: obiettivo 10x con NA di 0,40 e obiettivo 40x con NA di 0,95. Impostare il foro stenopeico confocale a 152 μm (obiettivo 10x) e 105 μm (obiettivo 40x). Impostare la risoluzione spaziale dell'acquisizione delle immagini su 1024 x 1024 pixel (obiettivo 10x) e 640 x 640 pixel (obiettivo 40x).
  4. Cattura 50 immagini (Z-stack) in fotogrammi da 2 μm dalla retina etichettata. Integra tutte le immagini in un unico in-focus in modalità proiezione/topografia. Per la configurazione, fare clic su Imposta piano focale iniziale > Imposta piano focale finale > Imposta dimensione passo > Scegli modello di profondità > Acquisizione immagine > serie Z.
  5. Acquisizione di immagini utilizzando le seguenti lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per diversi segnali di fluorescenza: segnali di fluorescenza verde a 499 nm e 519 nm; segnali di fluorescenza rossa a 591 nm e 618 nm; e segnali di fluorescenza blu a 401 nm e 421 nm.
  6. Ricostruisci le immagini nel modello tridimensionale importando immagini confocali Z-stack in un software di analisi selezionando Aggiungi nuove superfici > Scegli impostazioni volume > Scegli canale sorgente > Regola visualizzazione > Regola angolo superficie > Istantanea.

Risultati

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Dalle viste esterne della retina a montaggio intero, la trasparenza tissutale della retina a montaggio intero è stata aumentata utilizzando il trattamento di pulizia dei tessuti rispetto a quella della retina senza pulizia dei tessuti (Figura 1).

Per l'esame istologico sulla retina a montatura intera, il sistema vascolare retinico è stato marcato in rosso con lectina fluorescente di pomodoro attraverso l'iniezione retro-orbitale e i periciti retinici sono mostrati in verde con PDGFR-β (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Sebbene questa marcatura possa essere osservata sul campione prima e dopo la pulizia dei tessuti, a titolo di confronto, il rumore di fondo del campione retinico è stato ridotto dal trattamento di pulizia dei tessuti (Figura 2). Il trattamento ha anche reso più chiari i periciti retinici marcati e la vascolarizzazione sotto lo scanner panoramico a fette di tessuto (Figura 2) e il microscopio confocale a scansione laser (Figura 3).

La distribuzione gradazionale dei periciti retinici è dimostrata anche qui lungo l'albero vascolare retinico (Figura 3). Dalla parte centrale della retina alla sua regione periferica, i periciti si trovano sulla membrana basale del sistema vascolare retinico, compresi il tronco vascolare e i rami e i capillari (Figura 3).

Sulla base dell'osservazione di cui sopra, la correlazione spaziale dei periciti e della vascolarizzazione retinica è stata ulteriormente valutata con le immagini Z-stack ingrandite più elevate dal campione retinico cancellato (Figura 4). Con l'aiuto del sistema di elaborazione delle immagini, abbiamo ulteriormente fornito le viste 3D per dimostrare che i periciti erano strettamente avvolti attorno al sistema vascolare retinico in diversi diametri (Figura 4). La Figura 4A0-D0 rappresenta la ramificazione gerarchica dei vasi retinici dal più alto al più basso. Poiché i periciti sono distribuiti più abbondantemente nei capillari, la colorazione PDGFRβ nella Figura 4D0 mostra un'intensità e un segnale più forti rispetto alla Figura 4A0-C0.

A differenza della retina di topo senza trattamento di pulizia dei tessuti (Figura 1A, Figura 2A, Figura 3A0-D0), l'attuale approccio ha ridotto efficacemente i segnali di fondo retinici per dimostrare la relazione spaziale tra periciti e vasi sanguigni dalla retina a montaggio intero (Figura 1B, Figura 2B, Figura 3A1-D1).

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Figura 1: Confronto della trasparenza ottica dell'intera retina mount senza e con il trattamento di pulizia dei tessuti. (A, B) Le viste esterne dell'intera retina mount prima (A) e dopo (B) il trattamento di pulizia dei tessuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Confronto delle caratteristiche di marcatura dei periciti retinici e della vascolarizzazione dell'intera retina montabile senza e con trattamento di pulizia tissutale. (A, B) Le viste di montaggio rappresentative dell'intera retina montatura prima (A) e dopo (B) il trattamento di pulizia dei tessuti sono state effettuate con il sistema di vetrini virtuali. La vascolarizzazione è in rosso (lectina di pomodoro fluorescente), i periciti sono in verde (PDGFR-β) e il nucleo cellulare è in blu (DAPI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Confronto della risoluzione di imaging dei periciti retinici gradazionalmente lungo l'albero vascolare retinico prima e dopo il trattamento di pulizia dei tessuti. (A-D) Le immagini rappresentative della retina marcata prima del trattamento di pulizia dei tessuti (A0-D0) e dopo il trattamento di pulizia dei tessuti (A1-D1) mostrano la distribuzione dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico nell'ordine del tronco vascolare (A0, A1), i rami del primo ordine (B0, B1), i rami del secondo ordine (C0, C1) e il capillare (D0, D1). La vascolarizzazione è in rosso (lectina di pomodoro fluorescente), i periciti sono in verde (PDGFR-β) e il nucleo cellulare è in blu (DAPI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Correlazione spaziale dei periciti con la vascolarizzazione retinica in diversi diametri. (A-D) Immagini rappresentative ad alta risoluzione dalla retina marcata lungo l'albero vascolare retinico che mostrano la distribuzione dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico in diversi diametri, tra cui il tronco vascolare (A0, A1), i rami del primo ordine (B0, B1), i rami del secondo ordine (C0, C1) e il capillare (D0, D1). A1-D1: Le immagini corrispondenti dei pannelli A0-D0 sono state ricostruite per mostrare la correlazione spaziale dei periciti con la vascolarizzazione retinica in diversi diametri nelle viste tridimensionali e dimostrare ulteriormente le viste ingrandite delle regioni locali nei pannelli A1-D1 (frecce) con inserti. La vascolarizzazione è in rosso (lectina di pomodoro fluorescente), i periciti sono in verde (PDGFR-β) e il nucleo cellulare è in blu (DAPI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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In questo studio, abbiamo dettagliato il processo tecnico per dimostrare la morfologia dei periciti nel sistema vascolare retinico utilizzando l'iniezione retro-orbitale di lectina di pomodoro fluorescente, l'esame immunofluorescente con PDGFR-β e la pulizia dei tessuti a base di solvente. I risultati mostrano che queste tecniche sono altamente compatibili per evidenziare i periciti nella retina a montatura intera. La combinazione di queste metodologie offre un approccio efficace per visualizzare le caratteristiche morfologiche dei periciti nel sistema vascolare retinico da una prospettiva 3D dettagliata.

Una delle tecniche chiave, l'iniezione retro-orbitale nei topi, si è dimostrata un metodo semplice e ottimale per la somministrazione di agenti di marcatura vascolare, superando i metodi di iniezione della vena caudale e intraperitoneale per l'osservazione della vascolarizzazione retinica del topo13,14. Sebbene il principio e il meccanismo alla base della marcatura vascolare attraverso l'iniezione retro-orbitale non siano completamente compresi, è evidente che questo metodo marcare in modo robusto la vascolarizzazione retinica con lectina di pomodoro fluorescente. La marcatura fluorescente rimane stabile sia attraverso il trattamento istochimico che attraverso la pulizia dei tessuti. Pertanto, oltre al suo utilizzo nell'imaging in vivo, l'iniezione retro-orbitale con lectina fluorescente di pomodoro etichetta efficacemente il lume dei vasi sanguigni, offrendo una visione chiara della vascolarizzazione retinica per l'esame istologico in vitro ed ex vivo.

Per marcare i periciti retinici, abbiamo utilizzato la colorazione immunofluorescente con PDGFR-β15. Considerando che la retina colorata è stata sottoposta a un ulteriore trattamento con reagente per la pulizia dei tessuti per ridurre la dispersione della luce tissutale all'esame morfologico microscopico, la retina è stata incubata nella soluzione colorante per un tempo più lungo per migliorare la penetrazione dell'anticorpo16,17.

La retina a montaggio intero è relativamente trasparente, consentendo una panoramica della vascolarizzazione retinica18. Tuttavia, a causa della diffusione della luce con il suo spessore, limita la penetrazione della luce e l'imaging ad alta risoluzione19. Con l'aiuto di tecniche di pulizia dei tessuti, è diventato possibile visualizzare i periciti nella retina a montatura intera da una prospettiva ad alta risoluzione19,20. Tuttavia, questi metodi non sono ancora stati ampiamente applicati allo studio dei periciti retinici di topo. In questo studio, l'approccio di pulizia dei tessuti a base di solvente ha migliorato significativamente la nostra capacità di visualizzare i periciti nel sistema vascolare retinico, consentendoci di ottenere immagini Z-stack ad alta risoluzione utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.

I periciti, distribuiti lungo l'albero microvascolare, svolgono un ruolo essenziale nella complessa distribuzione spaziale e temporale del sangue all'interno della rete capillare retinica22. La loro morfologia altamente plastica e le capacità contrattili adattative rendono i periciti ideali per regolare il flusso sanguigno capillare in risposta all'attività neuronale locale in condizioni fisiologiche e patologiche23. In qualità di attore chiave della barriera emato-retina o dell'accoppiamento neurovascolare retinico, i periciti retinici sono anche oggetto di attenzione nel mantenimento della neovascolarizzazione, dell'angiogenesi e della trasmigrazione leucocitaria24.

Come limitazione tecnica, va tenuto presente che, oltre al PDGFR-β, sono stati utilizzati anche altri marcatori come NG-2 e CD13 per identificare i periciti 22,24,25. Pertanto, la selezione di un marcatore specifico per periciti appropriato per dimostrare i periciti in modo inequivocabile è ancora una sfida. Questo studio fornisce ulteriori prove che il PDGFR-β è un candidato migliore per rivelare le caratteristiche morfologiche dei periciti.

In sintesi, abbiamo dimostrato che la combinazione di iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro, colorazione immunofluorescente e pulizia dei tessuti ha permesso l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione, rivelando la morfologia dettagliata dei periciti nel sistema vascolare retinico del topo in condizioni fisiologiche. Questi risultati suggeriscono che questo metodo potrebbe essere prezioso per future indagini sulle alterazioni dei periciti retinici in condizioni patologiche.

Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (n. 7244480), dal CACMS Innovation Fund (n. CI2021A03407), la National Natural Science Foundation of China (n. 82004492) e i fondi di ricerca di base per gli istituti centrali di ricerca sul benessere pubblico (n. ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Proteggere dalla luce
Alexa Fluor 488 asino anti-capra IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Proteggere dalla luce
C57BL/6 mouseBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
Sistema di imaging confocaleOlympusFV1200
Capra anti-PDGFR-βRicerca e SviluppoAF104225 &5; g 
Software ImarisOxford Instrumentsv.9.0.1
Lycopersicon esculentum (pomodoro) lectina, DyLight594Thermo Fisher ScientificL324711 mg
Provetta per microcentrifugaAxygenMCT-150-C1,5 mL
Siero d'asino normaleJackson ImmunoResearch017-000-12110 mL
Scanner panoramico per fette di tessutoOlympusVS120-S6-W
Photoshop e  IllustrazioneAdobeCS6
RapiClear 1.52 SoluzioneSunJin LabRC15200110 ml
Piastra a sei pozzettiCostar3335
Forbici a molla Fine Science Tools15003-08
Vetrino per microscopio Superfrost PlusThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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