Isolamento enzimatico delle vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico

Sommario

Questo protocollo mira a isolare e purificare le vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico (SkM-EVs) dai tessuti muscolari dei roditori attraverso il distacco meccanico, la dissociazione enzimatica, la filtrazione e l'ultracentrifugazione differenziale. Dimostra coerenza e affidabilità. Le SkM-EV isolate forniscono informazioni sull'omeostasi muscolare e sulle malattie, con potenziali applicazioni come biomarcatori diagnostici o veicoli terapeutici.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle racchiuse in un doppio strato lipidico rilasciate dalle cellule per trasportare carichi bioattivi, come proteine, RNA e DNA, per la comunicazione intercellulare. Lo studio del crosstalk mediato da EV tra le cellule nell'omeostasi e nelle malattie muscolari offre un potenziale significativo per migliorare la nostra comprensione dello sviluppo, della rigenerazione e dell'atrofia muscolare. Tuttavia, gli attuali protocolli per l'isolamento delle vescicole extracellulari derivate dal muscolo scheletrico (SkM-EV) incontrano sfide per ottenere un'elevata purezza e resa, principalmente a causa delle difficoltà nel rilasciare vescicole extracellulari dai tessuti muscolari senza compromettere le membrane cellulari. Questo articolo presenta un protocollo efficiente per l'isolamento di SkM-EV, che comprende il distacco meccanico, la dissociazione enzimatica, la filtrazione e l'ultracentrifugazione. Questi passaggi sono ottimizzati per migliorare il rilascio di EV dai tessuti muscolari, producendo SkM-EV di elevata purezza. Successivamente, vengono eseguiti la citometria a nanoflusso, il saggio BCA e il saggio Western blot per caratterizzare la quantità e la qualità delle SkM-EV isolate. Questo protocollo è promettente per la creazione di una piattaforma affidabile per ottenere vescicole extracellulari derivate da tessuti per far progredire la ricerca di base, la diagnosi delle malattie e la somministrazione di farmaci.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle di dimensioni nanometriche, legate alla membrana, rilasciate dalle cellule nell'ambiente extracellulare. Queste vescicole extracellulari trasferiscono acidi nucleici, proteine e lipidi per modulare più vie di segnalazione al momento dell'assorbimento da parte delle cellule riceventi. In particolare, le EV isolate dal muscolo scheletrico (SkM-EVs) sono state implicate nella degenerazione, rigenerazione e crescita muscolare trasferendo microRNA regolatori miogenici o fattori di trascrizione 1,2,3,4. Poiché la nostra comprensione delle sottopopolazioni e delle caratteristiche di SkM-EV continua ad evolversi, queste vescicole si mostrano promettenti come biomarcatori per la diagnosi precoce ^5,6 e come bersagli terapeutici per i disturbi neuromuscolari. Questo campo in espansione offre interessanti opportunità sia per l'indagine patologica che per le applicazioni cliniche.

L'attuale ricerca sulle SkM-EV si concentra prevalentemente su quelle ottenute da surnatanti di colture cellulari dopo colture ex vivo ^2,7,8, sollevando preoccupazioni riguardo alla fedeltà delle linee cellulari bersaglio dopo passaggi successivi e alla suscettibilità delle caratteristiche delle EV all'alterazione in ambienti artificiali. Ciò evidenzia la necessità di isolare le SkM-EV direttamente dai tessuti muscolari per evitare influenze di coltura ex vivo e rappresentare meglio le condizioni in vivo. Sebbene siano stati sviluppati diversi approcci per isolare le vescicole extracellulari dai tessuti muscolari ^9,10, gli studi variano ancora in modo significativo nei dettagli del protocollo, influenzando la coerenza e la comparabilità. È urgentemente necessario un protocollo standardizzato per l'isolamento e la caratterizzazione di SkM-EV per garantire l'affidabilità degli studi correlati.

Considerando le caratteristiche fisiologiche del muscolo scheletrico, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare e purificare le SkM-EV da campioni di muscolo scheletrico di roditori utilizzando il distacco meccanico, la dissociazione enzimatica, la filtrazione e l'ultracentrifugazione differenziale. Attraverso un'analisi completa utilizzando la citometria a flusso nanometrico, il saggio BCA e il saggio Western blot, abbiamo scoperto che questo protocollo produce costantemente SkM-EV di elevata purezza e quantità entro un periodo di tempo limitato. Può essere applicato a campioni di muscolo scheletrico in varie condizioni, comprese le lesioni muscolari acute e croniche. Inoltre, con le opportune regolazioni, questo metodo può essere adattato ai tessuti muscolari di pazienti umani o di altri modelli animali. La standardizzazione del processo di isolamento SkM-EV è essenziale per garantire la coerenza della qualità SkM-EV, facilitare il confronto delle caratteristiche delle vescicole extracellulari - come resa, dimensioni, composizione del carico e funzione - e far progredire le loro potenziali applicazioni come biomarcatori diagnostici, oltre a migliorare la nostra comprensione del loro ruolo in vari processi fisiologici e patologici.

Protocollo

Questo protocollo isola le vescicole extracellulari (EV) dal tessuto muscolare scheletrico utilizzando il distacco meccanico, la dissociazione enzimatica, la filtrazione e l'ultracentrifugazione differenziale. Consente l'isolamento delle vescicole extracellulari da gruppi muscolari di roditori singoli o combinati, tra cui il tibiale anteriore (TA), l'estensore lungo delle dita (EDL), il soleo (SOL), il gastrocnemio (GAS) e il quadricipite (QUA). L'uso degli animali è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Georgia e lo studio è conforme alle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali nella ricerca. Gli animali sono stati ospitati nelle strutture per animali all'interno del Dipartimento di Scienze Animali e Latticini dell'Università della Georgia. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi adulti wild-type (C57BL/6J), con tessuto raccolto da topi sacrificati a 3 mesi di età. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Distacco meccanico dei gruppi muscolari dal topo

1. Eutanasia dei topi con CO₂, seguita da lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Radere entrambi gli arti posteriori.
2. Fissare la zampa del mouse in una piastra sterile con il lato anteriore della zampa rivolto verso l'alto (Figura 1A).
3. Praticare una piccola incisione (5 mm) nella pelle sul lato laterale della caviglia del topo usando le forbici da dissezione.
4. Inserire con cautela una lama delle forbici nell'incisione, posizionandola sotto la pelle ma non nel tessuto muscolare sottostante. Quindi, tagliare la pelle verso l'alto verso il ginocchio per estendere la lunghezza dell'incisione.
5. Afferra la pelle lungo l'incisione usando una pinzetta ruvida ed espandi l'apertura fino a quando il muscolo è visibile.
6. Individuare il muscolo TA, che va dal ginocchio alla caviglia sul lato laterale dell'osso della tibia¹¹, e utilizzare una pinzetta affilata per afferrare e staccare il sottile strato di tessuto connettivo che copre il muscolo (Figura 1B).
7. Vicino alla caviglia, identificare i due tendini all'estremità del TA, uno direttamente collegato al muscolo TA e l'altro, il tendine EDL, che è più piccolo e si trova accanto al tendine TA sul lato laterale. Recidere entrambi i tendini usando le forbici da dissezione.
8. Afferra entrambi i tendini con una pinzetta ruvida. Quindi, utilizzare un altro paio di pinzette ruvide o affilate per separare i tendini, separando così il TA dall'EDL (Figura 1C).
9. Sollevare l'AT per il tendine appena reciso con una pinzetta ruvida. Quindi, tagliare il tendine TA vicino al ginocchio usando le forbici da dissezione, rimuovendo così il muscolo. Ripeti questo processo per rimuovere l'EDL e conservare entrambi i muscoli in PBS su ghiaccio.
10. Rilascia la gamba e capovolgi il mouse in modo che la faccia posteriore sia rivolta verso l'alto.
11. Con la pelle della gamba ora parzialmente rimossa, tagliare la pelle vicino alla caviglia usando le forbici da dissezione. Quindi, usa una pinzetta ruvida per afferrare e sbucciare la pelle verso l'alto verso la parte posteriore del ginocchio, esponendo il GAS.
12. Recidere il tendine GAS vicino alla caviglia usando le forbici da dissezione (Figura 1D).
13. Afferrare il tendine GAS con una pinzetta ruvida e sollevarlo verso l'alto per esporre la parte inferiore del GAS.
14. Individuare il piccolo tendine SOL sul lato inferiore del GAS vicino al ginocchio (dove il GAS è ancora collegato). Recidere il tendine SOL usando le forbici da dissezione, provocando la contrazione del SOL verso l'alto (Figura 1E).
15. Afferrare il tendine SOL reciso con una pinzetta affilata e sollevarlo delicatamente, staccando così il SOL dalla parte inferiore del GAS.
16. Recidere l'estremità del SOL dove si attacca all'estremità recisa del GAS usando le forbici da dissezione, separando così i due muscoli. Conserva il SOL in PBS sul ghiaccio.
17. Tagliare l'estremità del GAS vicino al ginocchio e posizionarlo in PBS sul ghiaccio.
18. Dopo aver rimosso i quattro muscoli elencati sotto il ginocchio, capovolgi il mouse in modo che la faccia anteriore sia rivolta verso l'alto.
19. Se necessario, sbucciare ulteriormente la pelle con una pinzetta ruvida per esporre il QUA. Posizionare la gamba del mouse con un angolo di 90° per forzare la flessione del QUA. Recidere il tendine più vicino al ginocchio usando le forbici da dissezione.
    1. Separare il QUA dal femore tagliando tra il muscolo e l'osso fino a quando il QUA non è collegato solo dal tendine prossimale (Figura 1E). Quindi, recidere il tendine prossimale e rimuovere il QUA. Posiziona il QUA in PBS sul ghiaccio.
20. Assicurarsi che dopo il distacco muscolare, la tibia e il perone siano chiaramente esposti (Figura 1F).
21. Sciacquare i muscoli più volte con PBS per rimuovere contaminanti come pelo e sangue (Figura 1G). Quindi, asciugare delicatamente i muscoli con carta assorbente. Utilizzare una bilancia analitica per misurare il peso muscolare, che verrà utilizzata in seguito per calcolare l'EV raccolto per grammo di muscolo.

2. Dissociazione enzimatica di pezzi muscolari staccati

1. Rimuovere delicatamente i tendini muscolari dal campione muscolare utilizzando una pinzetta affilata, una pinzetta per schegge, bisturi o forbici (Figura 2A).
2. Dopo la rimozione del tendine, tagliare il muscolo longitudinalmente lungo le fibre muscolari (da tendine a tendine) in pezzi muscolari spessi 1 mm usando le forbici o un bisturi per aumentare il rapporto superficie/volume (Figura 2B, C).
   NOTA: Cerca di limitare i danni alla miofibra durante il taglio. Per i muscoli più grandi come TA, GAS e QUA, effettuare tagli aggiuntivi rispetto ai muscoli più piccoli come EDL e SOL per garantire un rapporto superficie/volume approssimativamente uguale in tutti i campioni muscolari (Figura 2D).
3. Preparare 10 ml di tampone enzimatico digestivo fresco (DEB) per ogni topo e tenerlo in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   1. Per preparare il DEB, mescolare 2 mg di enzima collagenasi II per 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con una soluzione di penicillina-streptomicina all'1%. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm dopo la miscelazione.
   2. Assicurarsi che il DEB abbia un'attività enzimatica di oltre 250 unità. Agitare il DEB fino a quando la soluzione non è completamente miscelata e la polvere dell'enzima collagenasi II non è più visibile.
4. Separare il tessuto muscolare in aliquote, ciascuna contenente 20 mg di tessuto muscolare. Quindi, aggiungere 1 mL di DEB a ciascuna aliquota per la dissociazione enzimatica.
5. Incubare la miscela di DEB e muscolo su un agitatore nell'incubatore a 37 °C per 12 ore a una velocità di agitazione di 100 rotazioni al minuto (giri/min) (Figura 2E).

3. Filtrazione e centrifugazione a bassa velocità per arricchire SkM-EV

NOTA: Impostare la centrifuga refrigerata a 4 °C e farla funzionare fino a raggiungere la temperatura impostata. Conservare tutte le provette e i campioni necessari sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

1. Seguendo le procedure di digestione enzimatica, assicurarsi che non siano visibili pezzi muscolari distinguibili (Figura 3A). Prima della centrifugazione refrigerata, estrarre 10 μL di soluzione dalla miscela DEB-muscolo e trasferirla in una provetta da 0,2 mL per il test di vitalità cellulare, se necessario.
2. Preparare ed etichettare le nuove provette per microcentrifuga vuote da 1,5 mL. Installare un filtro da 0,45 μm e una siringa da 5 mL rimuovendo lo stantuffo (non gettarlo) e avvitando il mozzo nell'estremità superiore del filtro da 0,45 μm. Posizionare il filtro in modo che l'estremità inferiore sia posizionata in un tubo vuoto appena etichettato (Figura 3D). Filtrare 1x PBS attraverso un filtro da 0,2 μm.
3. Centrifugare la miscela per 10 minuti a 1.000 x g e 4 °C per pellettare eventuali detriti (Figura 3B). Trasferire il surnatante (circa 1 mL) nella siringa utilizzando una micropipetta P200 (Figura 3C,E).
4. Reinserire lo stantuffo della siringa e spingere lentamente il surnatante attraverso il filtro, lasciandolo passare e raccogliersi nella provetta da microcentrifuga da 1,5 ml appena etichettata (Figura 3F).
5. Rimuovere nuovamente lo stantuffo e pipettare circa 200 μL di 1x PBS nella siringa.
6. Reinserire lo stantuffo e spingere lentamente i 200 μl di 1x PBS attraverso il filtro (Figura 3G) per rimuovere l'eventuale surnatante rimanente dal filtro e nella provetta per microcentrifuga da 1,5 mL etichettata.
7. Ripetere il processo di filtrazione per altre provette, utilizzando un nuovo filtro per ogni campione di tessuto.
8. Dopo la filtrazione, assicurarsi che la soluzione sia trasparente e priva di pezzi muscolari residui (Figura 3H).

4. Ultracentrifugazione differenziale per la purificazione SkM-EV

NOTA: Impostare la centrifuga refrigerata a 4 °C e farla funzionare fino a raggiungere la temperatura impostata. Conservare tutte le provette e i campioni necessari su ghiaccio e pronti per l'uso.

1. Trasferire la soluzione filtrata in nuove microprovette da 1,5 mL (adatte per un massimo di 200.000 x g). Bilanciare tutte le microprovette con un ulteriore 1x PBS per garantire lo stesso volume prima di inserirle nella micro-ultracentrifuga.
2. Dopo esservi assicurati che il volume di tutte le provette sia uguale, chiudete le provette e posizionatele nel rotore della micro-ultracentrifuga da bilanciare (Figura 4A).
3. Accendere la micro-ultracentrifuga e impostarla in modo che funzioni per 1 ora a 100.000 x g e 4 °C (Figura 4B).
4. Posizionare il rotore caricato con le provette nella micro-ultracentrifuga, chiudere il coperchio e accendere il vuoto (Figura 4C).
5. Una volta che il vuoto raggiunge il livello 2, premere il pulsante di avvio e attendere il completamento del processo di centrifugazione (Figura 4D).
6. Al termine del ciclo di micro-ultracentrifuga, fare clic sul pulsante del vuoto per ripressurizzare la camera prima di rimuovere il rotore e le provette. Tenere i tubi sul ghiaccio e posizionarli in posizione verticale per evitare di disturbare il pellet.
7. Rimuovere con cautela il surnatante con una micropipetta P200, evitando di disturbare il pellet (Figura 4E).
8. Espellere il puntale, quindi aggiungere 50 μl di 1x PBS nella provetta dopo aver rimosso il surnatante utilizzando una micropipetta P200. Per i campioni GAS e QUA, aggiungere fino a 500 μl di 1x PBS per facilitare la dissoluzione (Figura 4F).
9. Risospendere il pellet pipettandolo delicatamente su e giù con una micropipetta P20 (o micropipetta P200 se sono stati aggiunti 500 μl) fino a quando non è completamente rotto e non più visibile.
10. Chiudere la provetta e conservarla a 4 °C per la conservazione a breve termine (meno di una settimana), a -80 °C per la conservazione a lungo termine, oppure riposizionare la provetta sul ghiaccio se il campione verrà immediatamente caratterizzato utilizzando la citometria a nanoflusso, il Western blot o altri saggi.

Risultati

Seguendo questo protocollo, le vescicole extracellulari del muscolo scheletrico (SkM-EV) sono state estratte con successo da vari gruppi muscolari, tra cui il tibiale anteriore (TA), l'estensore lungo delle dita (EDL), il soleo (SOL), il gastrocnemio (GAS) e il quadricipite (QUA) da topi wild-type. La successiva caratterizzazione di queste SkM-EV è stata condotta attraverso la citometria a nanoflusso, chiarendo le loro caratteristiche distintive come riassunto nella Tabella 1. Sorprendentemente, da un so...

Discussione

Il protocollo inizia con la dissezione dei gruppi muscolari degli arti posteriori dai topi o con l'acquisizione di tessuto muscolare umano post mortem sulla base dei protocolli disponibili¹⁶. Le seguenti procedure di isolamento delle vescicole extracellulari del muscolo scheletrico (SkM-EV) comprendono tre sezioni principali: lieve digestione enzimatica del tessuto per liberare SkM-EV interstiziali, filtrazione e centrifugazione a bassa velocità e ultracentrifugaz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 0,6 mL	ThermoFisher Scientific	05-408-120
microprovetta da 1,5 mL (C)	Eppendorf	5720411009
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	ThermoFisher Scientific	3448	trasparente, graduata, non sterile
	Becton Dickinson	14-827-52	Punta Luer-Lok
Vetrini contacellulare, doppia camera per contatore cellulare	Bio-Rad	145-0011
Centrifuga 5430R	Eppendorf	22620667
Soluzione detergente	NanoFCM Inc.
Collagenasi II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
DPBS (10x) Liquido (-calcio,-magnesio)	Cytiva	SH30378.02	La diluizione finale utilizzata è 1x
DPBS/Modified (1x)	Cytiva	SH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Genesee Scientific	25-500
E-POD Pure Dispenser remoto d'acqua	Millipore Sigma	ZRXSP0D01
FA-45-30-11 Rotore per microcentrifuga	Eppendorf	05-401-503
Fisher Vortex Genie 2	ThermoFisher Scientific	12-812
Flow NanoAnalyzer NanoFCM	Inc.
Heratherm OGS60 Protocollo generale Forno	ThermoFisher Scientific	51028112	convezione gravitazionale, 2,3 piedi cubi 120 V
MemGlow-488	Sonda citoscheletro Inc.	MG01-02
Millipak Millipore Special Millipore	Sigma	TANKMPK02
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15070063
Pipet-Lite LTS Pipetta L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipetta L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipetta L-20XLS+	Rainin	17014392
Puntali per pipette ER LTS 1000µ L F 768G/8	Rainin	30808038
Puntali per pipette ER LTS 20µ L F 960G/10	Rainin	30807966
Puntali per pipette ER LTS 200µ L F 960G/10	Rainin	30807967
perline per il controllo di qualità	NanoFCM Inc.
S110-AT Rotore ad angolo fisso	ThermoFisher Scientific	45539	1,10,000 giri/min
S16 exo 65-155nm perline	NanoFCM Inc.
Forbici	SPI, USA
Sorvall mX 150+ Micro-Ultracentrifuga	ThermoFisher Scientific	50135641
TC 20 contatore di cellule automatizzato	Bio-Rad	1450102
Trypan Blue Solution	Pinzette Corning	25-900-CI
	SPI, USA
Vwr 15mL provette per centrifuga	Avantor	89039-668
Whatman Puradisc 13 Filtri	Cytiva	6782-1304	0.45 µ m dimensione dei pori
Topi Wild-type C57BL/6J	Laboratory	stock #000664