Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Sommario

Il protocollo qui presentato prevede la profilazione polisomiale per isolare il translatoma, gli mRNA associati ai ribosomi, in RNA non polisomiali e polisomiali da Arabidopsis attraverso la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Questo metodo dimostra l'efficienza di traslazione di Arabidopsis stressato dal calore.

Abstract

Il controllo traduzionale di diversi geni sotto stress termico è un passo fondamentale per l'adattamento delle piante all'ambiente. Valutare le attività traduzionali di vari geni può aiutarci a comprendere i meccanismi molecolari alla base della resilienza delle piante, contribuendo allo sviluppo di colture con una maggiore tolleranza allo stress di fronte ai cambiamenti climatici globali. Questo articolo presenta una metodologia dettagliata per valutare l'efficienza di traduzione attraverso la profilazione dei polisomi in impianti esposti a stress termico. La procedura è suddivisa in tre parti: trattamento da stress termico per l'Arabidopsis, test dell'efficienza di traduzione utilizzando profili polisomici e calcolo dell'efficienza di traduzione isolando l'RNA non polisomiale e polisomiale in base al profilo. Nella prima parte, le piante di Arabidopsis sono sottoposte a condizioni di stress termico controllato per imitare le sfide ambientali. Il trattamento prevede l'esposizione delle piante ad alte temperature per periodi determinati, garantendo un'induzione dello stress costante e riproducibile. Questo passaggio è fondamentale per studiare le risposte fisiologiche e molecolari della pianta allo stress da calore. La seconda parte prevede il test di efficienza traslazionale mediante profilazione polisomiale. I polisomi vengono estratti attraverso la centrifugazione in gradiente di saccarosio, che separa gli mRNA in base al carico ribosomiale. Ciò consente l'esame dell'occupazione dei ribosomi sugli mRNA, fornendo informazioni sui meccanismi di controllo traduzionale in condizioni di stress. Nella terza parte, l'RNA viene isolato sia da frazioni polisomiali che non polisomiali. L'RNA spike-in viene utilizzato per misurare con precisione la quantità di RNA in ciascuna frazione. Il calcolo dell'efficienza di traduzione viene eseguito confrontando la distribuzione degli mRNA tra queste frazioni in condizioni normali e di stress termico. Le attività di traduzione di geni specifici sono ulteriormente valutate eseguendo la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) con RNA associato ai ribosomi e RNA totale. Questa metodologia si concentra esclusivamente sugli effetti dello stress termico, fornendo un protocollo dettagliato per l'analisi della regolazione traslazionale nelle piante.

Introduzione

La traduzione è fondamentale per gli organismi per sintetizzare proteine funzionali dall'mRNA, supportando funzioni cellulari essenziali e processi biologici come il metabolismo e la segnalazione e consentendo risposte allo stress. Senza traduzione, le cellule non possono produrre proteine vitali, influenzando la loro struttura, funzione e regolazione, influenzando così il sostentamento della vita e promuovendo la diversità biologica ^1,2. Pertanto, studiare l'efficienza traslazionale delle piante è fondamentale. La traduzione prevede diversi passaggi essenziali. In primo luogo, l'inizio avviene quando l'mRNA si lega a un ribosoma, facilitato da fattori di inizio come gli eIF negli eucarioti, che identificano il codone di inizio, tipicamente AUG. Successivamente, l'allungamento procede quando le molecole di RNA di trasferimento (tRNA), ciascuna delle quali trasporta amminoacidi specifici, si legano in sequenza al ribosoma. I legami peptidici si formano tra gli amminoacidi adiacenti, allungando la catena polipeptidica secondo la sequenza dell'mRNA. Infine, la terminazione viene avviata quando si incontra un codone di stop (UAA, UAG o UGA), riconosciuto dai fattori di rilascio che spingono il ribosoma a rilasciare la proteina appena sintetizzata. Durante la traduzione, vari fattori di iniziazione eucariotici (eIF), fattori di allungamento e RNA ribosomiali lavorano insieme per garantire accuratezza ed efficienza ^3,4.

Studi precedenti hanno indicato che le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo critico nella regolazione delle interazioni tra gli eIF e quindi influenzano l'efficienza della traduzione. La ricerca in vitro ha rivelato che la caseina chinasi 2 (CK2) fosforila eIF3c, eIF5 ed eIF2β per aumentare le loro interazioni tra loro e con eIF1 ^5,6. Al buio, la E3 ligasi CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGENICA 1 (COP1) reprime la traduzione inibendo la fosforilazione di S6K-RPS6 mediata da TOR. L'RPS6 non fosforilato non è in grado di formare ribosomi funzionali, interrompendo così la traduzione⁷. Al contrario, in condizioni di luce, la chinasi SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) fosforila eIF2α per facilitare l'assemblaggio del complesso eIF2 e promuovere l'inizio della traduzione⁸. Questi risultati evidenziano i complessi meccanismi di controllo che regolano la traduzione in risposta ai segnali ambientali.

Stimoli ambientali moderati possono promuovere efficacemente i processi traduzionali per facilitare la crescita, come la fotomorfogenesi ^8,9. Tuttavia, quando i fattori ambientali sono eccessivi, le piante immobili devono sviluppare meccanismi di regolazione adeguati per mitigare i danni causati dallo stress ambientale¹⁰. In studi precedenti relativi alle risposte allo stress delle piante, la maggior parte si è concentrata sulla regolazione a livello metabolico, ormonale e trascrizionale 11,12,13,14. Tuttavia, recenti ricerche hanno iniziato a evidenziare l'influenza della regolazione traslazionale sulla tolleranza allo stress delle piante 15,16,17. Le piante possono aumentare la loro tolleranza allo stress riducendo l'efficienza traslazionale, riducendo così al minimo il consumo di energia non necessario. A causa della formazione di granuli di stress non membranosi nelle cellule vegetali, l'mRNA non tradotto e le proteine associate si aggregano al loro interno per ridurre l'efficienza traduzionale¹⁸. Uno degli stress ambientali comuni che le piante incontrano spesso è lo stress da calore, che è stato segnalato per indurre la formazione di granuli di stress all'interno delle cellule vegetali^19,20. L'aumento globale delle temperature medie dovuto al riscaldamento globale incide gravemente sui raccolti²¹. Pertanto, studiare la regolazione fisiologica delle piante sotto stress termico è fondamentale. Uno studio precedente ha dimostrato che il trattamento termico del grano ha provocato una diminuzione dell'mRNA legato ai polisomi. Tuttavia, gli mRNA immagazzinati nei granuli di stress sono stati rilasciati e rilegati ai ribosomi, facilitando la traduzione dopo il recupero²². Inoltre, ricerche precedenti hanno confrontato l'espressione genica tra l'mRNA totale e l'mRNA legato ai polisomi nelle piante sommerse¹⁶. I risultati hanno indicato che i livelli di mRNA allo stato stazionario associati all'acido abscissico e alle risposte allo stress abiotico sono leggermente aumentati dopo l'immersione. Inoltre, la quantità di mRNA legati ai polisomi è aumentata in modo significativo. Questi risultati suggeriscono che la regolazione della traduzione potrebbe svolgere un ruolo più critico nel controllo della tolleranza allo stress nelle piante. Pertanto, un metodo efficace di isolamento dell'RNA polisomiale è fondamentale per studiare il translatoma di campioni trattati sotto stress.

In questo protocollo, abbiamo modificato il metodo di isolamento dell'RNA dall'estrazione fenolo/cloroformio ad alto rischio e voluminoso con il metodo di precipitazione LiCl al metodo di estrazione fenolo/tiocianato di guanidinio su piccola scala, che richiede meno volume. Il primo metodo prevede la miscelazione diretta con frazioni polisomiali, ottenendo un rifiuto sperimentale più grande ^9,15,23. Al contrario, questo approccio modificato utilizza principi di densità differenziale: l'RNA polisomiale viene prima miscelato con una soluzione ad alto contenuto di sale e senza zucchero e poi precipitato mediante ultracentrifugazione. Successivamente, l'estrazione dell'RNA viene eseguita utilizzando un piccolo volume di reagente fenolo/guanidinio tiocianato. Questo metodo riduce efficacemente la produzione di rifiuti organici, rendendo il nostro esperimento più rispettoso dell'ambiente. Inoltre, i solventi organici utilizzati hanno una tossicità inferiore. Questi motivi ci hanno portato ad adeguare e migliorare di conseguenza le procedure sperimentali. Inoltre, i metodi precedenti non fornivano un protocollo completo per il calcolo dell'efficienza di traduzione utilizzando la normalizzazione spike-in, essenziale per analisi translatomiche più approfondite.

Qui, descriviamo il profilo dei polisomi e il protocollo di isolamento dell'RNA polisomiale per studiare l'efficienza della traduzione e le analisi translatomiche in Arabidopsis sotto stress da shock termico. Questo protocollo è stato impiegato per valutare l'efficienza della traduzione nel wild type Col-0 in condizioni normali, shock termico e post-recupero. I risultati del profilo dei polisomi e la percentuale di RNA polisomiale hanno rivelato alterazioni nell'efficienza della traduzione dopo il trattamento con stress termico nelle piantine di Arabidopsis .

Protocollo

1. Preparazione del campione di piantina di Arabidopsis trattata termicamente

1. Piastra 250 semi per ogni replica e ogni condizione con un contagocce sulla carta da filtro posta sulla piastra di agar del terreno basale Murashige e Skoog (MS) senza saccarosio (pH 5,6) integrata con fitoagar all'1,2%.
   NOTA: Per piantare piantine su piastre MS, sulla piastra viene posizionata della carta da filtro sterile per evitare che le radici delle piantine penetrino in profondità nel terreno, facilitando il campionamento. I semi vengono quindi piantati sopra la carta da filtro. Per escludere l'influenza degli zuccheri sulla crescita delle piante e sui risultati sperimentali, si consiglia di utilizzare un terreno MS che non contenga saccarosio per la coltivazione.
2. Avvolgere la piastra MS contenente i semi piantati con un foglio di alluminio per bloccare la luce e incubarla a 4 °C per 2 giorni per indurre la vernalizzazione.
3. Trasferire i semi vernalizzati in una camera di crescita da coltivare in un fotoperiodo chiaro-scuro di 16 h:8 h, a 22 °C con un'intensità luminosa di 100 μmol/m²/s.
4. Per i campioni di stress termico, sigillare le piastre medie MS contenenti piantine di 5 giorni con nastro adesivo impermeabile e metterle in un bagno d'acqua a 40 °C per 1 ora.
5. Per i campioni che si riprendono dopo il trattamento termico, raffreddare le piastre immediatamente dopo il trattamento termico. Successivamente, metterli in una camera di crescita a 22 °C per 2 h.
6. Raccogli 250 piantine trattate o non trattate in provette da microcentrifuga da 1,5 ml per ogni replica e congela immediatamente i campioni in azoto liquido.
   NOTA: Per ogni condizione sono stati preparati due gruppi di campioni. Uno è per le analisi di profilazione dei polisomi e l'altro è per l'estrazione di RNA non polisomiale e polisomale.

2. Preparazione del gradiente di saccarosio

1. Preparare la soluzione a gradiente contenente le seguenti concentrazioni di saccarosio: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. La composizione della soluzione comprende 50 mM di Tris-HCl, 25 mM di KCl, 10 mM di MgCl₂, 100 μg/mL di eparina e 50 μg/mL di cicloesimide (CHX).
2. Caricare le soluzioni a gradiente da alta a bassa concentrazione, partendo dal basso e salendo verso l'alto. Dopo aver aggiunto ogni concentrazione di soluzione a gradiente, congelare la soluzione allo stato solido prima di aggiungere la concentrazione successiva. Per ogni concentrazione di gradiente di saccarosio, aggiungere 2,2 ml. Questo processo si tradurrà in un gradiente discontinuo di densità del saccarosio.
3. Conservare temporaneamente il gradiente di saccarosio preparato a -80 °C e scongelare per una notte a 4 °C prima dell'uso.

3. Preparazione del campione per il profilo dei polisomi

1. Macinare 250 piantine di Col-0 di 5 giorni, stressate dal calore o non trattate, precedentemente congelate in polvere utilizzando un omogeneizzatore a una frequenza di 30 cicli/s per 1 minuto.
   NOTA: Quando il numero di piante con lo stesso background è uguale, hanno la stessa resa di estrazione dell'RNA. Tuttavia, quando si confrontano piante transgeniche o mutanti che sovraesprimono background diversi, la quantità di piante utilizzate dovrebbe essere regolata in base alle condizioni della pianta.
2. Per ottenere una soluzione di estrazione contenente RNA non polisomiale e polisomiale, aggiungere 500 μL di tampone di estrazione dei polisomi (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg/mL cicloesimide, 100 μg/mL di eparina, 2% PTE, 10% DOC, 400 U/mL di inibitore della ribonucleasi) a ciascuna provetta e mescolare i campioni invertendo e vorticando. Assicurarsi che i campioni siano mantenuti a 4 °C durante tutto il processo.
3. Centrifugare la soluzione di estrazione a 4 °C, 12.000 x g per 10 min. Quindi, filtrare il surnatante attraverso un filtro cellulare da 100 μm per ottenere una soluzione di estrazione limpida e priva di particelle.
   NOTA: Le particelle presenti nella soluzione di estrazione possono sedimentare durante l'ultracentrifugazione, formando potenzialmente un pellet che potrebbe influire sull'accuratezza delle misure di profilazione dei polisomi.
4. Caricare il surnatante filtrato su un gradiente di saccarosio pre-preparato e assicurarsi che raggiunga l'equilibrio.
   NOTA: A causa dell'elevata velocità di rotazione dell'ultracentrifuga, è essenziale garantire sia la sicurezza che il corretto funzionamento dell'ultracentrifuga. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario confermare che i pesi del campione siano identici prima della rotazione. Pertanto, utilizziamo una bilancia di precisione per verificare che i pesi dei gradienti siano completamente uniformi.
5. Centrifugare il gradiente di saccarosio caricato con campioni a 4 °C, 210.000 x g per 3,5 ore utilizzando un rotore a secchiello oscillante per ultracentrifuga. Impostare i tassi di accelerazione e decelerazione al massimo. Dopo l'ultracentrifugazione, l'RNA non polisomiale e polisomiale vengono distribuiti in base alla loro densità nella corrispondente soluzione a gradiente di saccarosio.
   NOTA: Nel gradiente di saccarosio, l'RNA non polisomiale con densità inferiore si distribuisce nello strato superiore, mentre l'RNA polisomiale, caratterizzato da una densità più elevata dovuta alla presenza di numerosi ribosomi impegnati nella traduzione attiva sull'mRNA, si distribuisce nello strato inferiore. Successivamente, il profilo dei polisomi può essere misurato utilizzando un frazionatore a gradiente di densità.

4. Analisi del profilo dei polisomi

NOTA: Per misurare la profilazione dei polisomi viene utilizzato un frazionatore a gradiente di densità con una pompa a siringa per microvolumi.

1. Preparare la soluzione chase (70% saccarosio, 10% glicerolo e 0,02% blu di bromofenolo) per la pompa a siringa per microvolumi.
2. Usa il software per controllare il frazionatore del gradiente di densità. Calibrare la macchina utilizzando acqua deionizzata. Dopo la calibrazione, utilizzarlo per eseguire la profilazione dei polisomi.
   1. Per eseguire la regolazione della linea di base, accendere l'UV/VISDettor fino a quando la luce non cambia da rossa a verde. Regolare la manopola Offset registratore per allineare la linea di marcatura, quindi ruotare la manopola di regolazione della linea di base sulla posizione di apertura minima. Impostare la manopola Sensibilità sul rivelatore UV/VIS sul livello 2.0 e premere il pulsante Auto Baseline . Infine, utilizzare la manopola Recorder Offset per regolare la linea di base desiderata su 20. Il processo calibrato varia a seconda della marca del meccanismo e dei diversi campioni.
3. Dopo l'ultracentrifugazione, posizionare le provette con i campioni sul frazionatore a gradiente di densità utilizzando il sistema di perforazione delle provette in modo che la provetta possa essere collegata alla pompa a siringa con la soluzione di inseguimento e il rivelatore UV.
4. Impostare il frazionatore del gradiente di densità in modalità di controllo software (REMOTE) e impostare la portata di iniezione della pompa a siringa per microvolumi su 3 ml/min.
5. Avviare le impostazioni del software per iniziare e ottenere il grafico del profilo del polisoma utilizzando il frazionatore misurando OD₂₅₄.

5. Isolamento di RNA non polisomiale e polisomiale

NOTA: Per questa parte del protocollo, è stato utilizzato un gruppo diverso di campioni dello stesso lotto dopo aver eseguito l'ultracentrifugazione seguendo gli stessi passaggi descritti in precedenza.

1. Sulla base dei risultati della misurazione del profilo dei polisomi, raccogliere separatamente le frazioni di RNA non polisomiale e polisomiale. Calcolare i volumi di soluzione sia per le frazioni non polisomiali che per quelle polisomiali e raccogliere la frazione non polisomiale (parte superiore).
   NOTA: Secondo i profili, la frazione con più di due ribosomi è definita come frazione polisomica, mentre la frazione con i picchi di rRNA 40S, 60S e 80S è definita come frazione non polisomiale .
2. Miscelare accuratamente le frazioni target di RNA con una soluzione pre-fredda 2x ad alto contenuto di sale (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. Aggiungere 8 μL di stock diluito di poli-A eucariotico RNA Control dal kit.
   NOTA: Per la normalizzazione spike-in necessaria per il settimo passaggio. Il kit di controllo dell'RNA Poly-A eucariotico include come geni di riferimento i geni di B. subtilis , come il gene DAP che non sono presenti nelle piante. Per determinare la percentuale di perdita del gene di riferimento durante la reazione dopo l'estrazione, aggiungere una quantità uguale di reagente contenente un campione di RNA del gene DAP a provette diverse con RNA non polisomiale o polisomiale prima dell'estrazione. Ciò consente di determinare la proporzione di perdita del gene di riferimento durante la reazione dopo l'estrazione e può essere utilizzato a scopo di normalizzazione.
4. Centrifugare l'RNA miscelato in soluzione ad alto contenuto di sale a 4 °C, 450.000 x g, per 5 ore utilizzando un rotore a secchiello oscillante per ultracentrifuga.
5. Dopo l'ultracentrifugazione, l'RNA precipiterà sul fondo della provetta da centrifuga. Versare con cura il surnatante dall'alto per preservare il pellet di RNA sul fondo.
6. Lavare rapidamente il pellet di RNA con 500 μl di acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) pre-freddo, ripetendo questo passaggio 3 volte.
   NOTA: Per evitare che l'acqua trattata con DEPC dissolva nuovamente l'RNA durante il processo di lavaggio, è necessario pre-raffreddare l'acqua trattata con DEPC prima dell'uso per ridurne la solubilità. Inoltre, il tempo di contatto tra l'acqua trattata con DEPC e il pellet di RNA durante il lavaggio dovrebbe essere ridotto al minimo.

6. Estrazione di RNA non polisomiale e polisomiale

1. Aggiungere 500 μl di reagente per l'estrazione dell'RNA e mescolare con il campione di RNA da estrarre. Incubare per 10 min.
2. Aggiungere 100 μl di cloroformio, mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti per la separazione di fase.
3. Centrifugare la miscela di reazione a 4 °C, 12.000 x g per 10 minuti. Trasferire lo strato acquoso chiaro superiore contenente RNA in una nuova provetta, mescolarlo delicatamente con un volume uguale di isopropanolo e incubare a -20 °C per 2 ore per la precipitazione dell'RNA.
4. Dopo la precipitazione, centrifugare a 4 °C, 12.000 x g per 10 min. Scartare con cura il surnatante e conservare il pellet di RNA sul fondo.
5. Lavare il pellet di RNA con 1 mL di etanolo pre-freddo al 75%. Centrifugare a 4 °C, 12.000 x g per 10 minuti, scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.
6. Una volta essiccato il pellet di RNA, risospendere il pellet di RNA in 30 μL di acqua trattata con DEPC e misurare la concentrazione di RNA (OD₂₆₀) utilizzando uno spettrofotometro a spettro completo (220 nm-750 nm).

7. Normalizzazione dei picchi

1. Utilizzare 1000 ng di RNA estratto per la trascrizione inversa eseguita utilizzando un kit qPCR seguendo le istruzioni del produttore. Sia l'RNA non polisomiale che quello polisomiale devono essere trascritti inversamente in cDNA.
2. Mescolare 1 μL di cDNA con i primer del gene DAP e utilizzare il tampone SYBR per misurare il livello di espressione del gene bersaglio secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, utilizzare la PCR in tempo reale per rilevare l'espressione genica DAP .
   NOTA: Le sequenze dei primer del gene DAP sono le seguenti:
   Innesco in avanti = 5'-ATA, AAA, GAA, TTC, AGC, TAA, CGC, TTC, C-3'
   Innesco inverso = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Confrontare i livelli di espressione dei geni DAP nei gruppi di RNA non polisomiali e polisomiali misurati e stimare il contenuto di RNA in condizioni di perdita proporzionale. Utilizzando il contenuto di RNA normalizzato, calcolare il rapporto di RNA nei polisomi.

Risultati

Il tipo selvatico di Arabidopsis, Col-0, è stato coltivato su terreno MS in un fotoperiodo leggero di 16 h:8 h. Per il controllo, sono state utilizzate piantine di 5 giorni senza trattamento da stress termico. Il gruppo di stress termico è stato sottoposto a 1 ora di trattamento termico a 40 °C in un bagno d'acqua preriscaldato, mentre il gruppo di recupero è stato posto a 22 °C per 2 ore subito dopo il trattamento termico. Utilizzando diverse condizioni di trattamento termico e condizioni di recupero, possiamo utilizzare i passaggi successivi per misurare la loro efficienza traslazionale.

Prima dell'estrazione dell'RNA, il gradiente di saccarosio deve essere preparato per primo. Per separare l'RNA non polisomiale e polisomiale in base alla loro differenza di densità, abbiamo preparato una soluzione a gradiente con concentrazioni di saccarosio del 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. Abbiamo quindi caricato le soluzioni del gradiente da alta a bassa concentrazione, partendo dal basso (Figura 1A). Successivamente, possiamo utilizzare questo gradiente per separare l'RNA non polisomiale a bassa densità nello strato superiore, mentre l'RNA polisomiale a densità più elevata sarà distribuito nello strato inferiore con concentrazioni di saccarosio più elevate. L'RNA non polisomiale e polisomiale è stato estratto dal Col-0 trattato o non trattato. Per evitare che le particelle nella soluzione influenzino i risultati dell'analisi del profilo dei polisomi, la soluzione contenente RNA deve essere filtrata attraverso un filtro cellulare per ottenere una soluzione di estrazione priva di particelle. Il surnatante filtrato è stato caricato su un gradiente di saccarosio pre-preparato ed equilibrato. Dopo l'ultracentrifugazione di campioni caricati con gradiente di saccarosio, l'RNA non polisomiale e polisomiale sono stati distribuiti in base alla densità all'interno del gradiente di saccarosio. Successivamente, la profilazione dei polisomi è stata eseguita utilizzando un frazionatore a gradiente di densità (Figura 1B). Il frazionatore a gradiente di densità è controllato utilizzando un software inizialmente calibrato con acqua deionizzata. Dopo la calibrazione, i campioni vengono caricati sul frazionatore dopo l'ultracentrifugazione. Operando in modalità di controllo software, la pompa a siringa per microvolumi inietta nel gradiente una soluzione di saccarosio con concentrazioni superiori al gradiente di saccarosio, spingendo il campione. Ciò consente di iniziare la misurazione dalla parte superiore del gradiente di saccarosio, dove la densità è inferiore, e procedere verso il basso, dove la densità è maggiore. Successivamente, vengono attivate le impostazioni del software per avviare l'acquisizione dei dati, generando il grafico del profilo dei polisomi attraverso la misurazione OD₂₅₄ (Figura 1B). Quando osserviamo una maggiore intensità del segnale nella frazione polisomiale, indica che il campione mostra una maggiore efficienza di traslazione.

I grafici del profilo dei polisomi per piantine Col-0 di 5 giorni sottoposti a diversi trattamenti sono mostrati nella Figura 2. I risultati del gruppo di controllo dimostrano una netta separazione tra la frazione non polisomiale e la frazione polisomiale (Figura 2A). Tuttavia, dopo 1 ora di stress termico a 40 °C, l'intensità del segnale della frazione polisomiale è diminuita significativamente (Figura 2B). Quando le piantine trattate termicamente sono state lasciate recuperare a 22 °C per 2 ore, l'intensità del segnale della frazione polisomiale è tornata a un livello simile al gruppo di controllo (Figura 2C). I nostri risultati hanno dimostrato che il trattamento di stress termico di 1 ora ha ridotto significativamente l'efficienza di traslazione delle piantine di Arabidopsis. Tuttavia, le piante hanno richiesto 2 ore di recupero per ripristinare l'efficienza di traslazione a livelli paragonabili a quelli delle piantine che non soffrono di stress termico.

Per raccogliere ulteriori prove che confrontino l'efficienza di traduzione delle piantine Col-0 in diverse condizioni di trattamento, abbiamo isolato ed estratto le frazioni di RNA non polisomiale e polisomiale. La raccolta di frazioni di RNA non polisomiali e polisomiali è stata guidata dai risultati delle misurazioni del profilo dei polisomi. Per l'estrazione di RNA non polisomiale e polisomiale, utilizziamo il reagente fenolo/guanidinio tiocianato per estrarre i campioni di RNA isolati non polisomiali e polisomiali. Con il metodo di estrazione dell'RNA che abbiamo utilizzato, possiamo ottenere un RNA stabile e di alta qualità per le nostre analisi successive (Tabella 1). Successivamente, normalizzare l'RNA estratto con il kit di controllo dell'RNA Poly-A eucariotico GeneChip per mitigare gli errori causati dalle diverse perdite di estrazione. Successivamente, è stata utilizzata la PCR in tempo reale per quantificare l'espressione dei geni DAP , che sono inclusi nei geni di B. subtilis aggiunti al kit. L'analisi comparativa dei livelli di espressione genica DAP tra gruppi di RNA non polisomiali e polisomiali è stata condotta per stimare il contenuto di RNA in condizioni di perdita proporzionale (Figura 3A). Abbiamo calcolato il rapporto tra l'RNA polisomiale normalizzato e l'RNA totale per chiarire l'efficienza di traduzione tra di loro (Figura 3B). Infine, il rapporto di RNA nei polisomi è stato calcolato utilizzando il contenuto di RNA normalizzato (Figura 3C). I risultati del rapporto RNA nei polisomi sottoposti a diversi trattamenti di Col-0 hanno mostrato un pattern coerente con i risultati del profilo dei polisomi mostrati nella Figura 2A. Entrambi i risultati indicano che lo stress da calore riduce significativamente il rapporto RNA nella frazione polisomiale e questo effetto può essere invertito dopo un recupero di 2 ore a 22 °C (Tabella 1).

Da questo metodo, possiamo ottenere l'intera frazione di RNA non polisomiale o polisomiale con alta qualità piuttosto che separare l'RNA in frazioni aggiuntive²³. I nostri risultati dimostrano anche che sia i profili dei polisomi che la percentuale di RNA nei polisomi possono riflettere efficacemente l'efficienza della traduzione in Arabidopsis con diverse condizioni trattate.

Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro per la profilazione dei polisomi. (A) Illustrazione schematica della preparazione del gradiente di saccarosio in una provetta da centrifuga da 13 mL. (B) Il diagramma di flusso illustra il processo sperimentale di profilazione dei polisomi. In primo luogo, viene estratto il translatoma. Successivamente, l'RNA non polisomiale e polisomiale vengono separati in base alle loro differenze di densità utilizzando l'ultracentrifugazione in gradienti di saccarosio di densità variabili. OD₂₅₄ viene misurato utilizzando un frazionatore a gradiente di densità per ottenere il grafico dei risultati del profilo dei polisomi sottostante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Profilazione polisomica di Col-0 in diverse condizioni. (A, B, C) I risultati del profilo dei polisomi di Col-0 in condizioni di (A) nessun trattamento termico (controllo), (B) trattamento termico a 40 °C per 1 ora e (C) recupero a 22 °C per 1 ora dopo il trattamento termico. L'RNA non polisomiale e polisomiale sono stati frazionati utilizzando un gradiente di saccarosio del 12,5%-60%. Le posizioni dell'RNA non polisomiale (NP) e polisomiale (PL) sono indicate sui profili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Diagramma del flusso di lavoro dell'estrazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale. (A) Un'illustrazione della normalizzazione dell'RNA mediante spike in. (B) Un'illustrazione della separazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale e il calcolo della percentuale di RNA polisomiale. (C) La percentuale di RNA polisomiale in Col-0 trattato con diverse condizioni. Le barre di errore indicano la media ± SD (n=3 ripetizioni biologiche). *valore p < 0,01, test t di Student. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

		Contenuto (ng)	260/280	260/230
Controllo	RNANP	758.3	2.19	2.16
	RNAPL	302.3	2.21	2.13
Stress da calore	RNANP	821.5	2.2	2.15
	RNAPL	174.3	2.19	2.21
Guarigione	RNANP	797.2	2.17	2.16
	RNAPL	300.9	2.19	2.18

Tabella 1: Contenuti e qualità dell'RNA non polisomiale e polisomiale. Questa tabella ha mostrato il contenuto e le qualità dell'RNA analizzati. Il contenuto di RNA è stato normalizzato dopo l'estrazione utilizzando metodi modificati.

Discussione

Questo protocollo delinea un metodo semplice e standardizzato per misurare l'efficienza di traslazione delle piantine di Arabidopsis. Le fasi critiche di questo protocollo sono garantire la stabilità dell'RNA con la centrifugazione secondaria e l'estrazione del reagente per l'estrazione dell'RNA, nonché la preparazione meticolosa del gradiente di saccarosio. Inoltre, forniamo passaggi critici per la normalizzazione e la quantificazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale con il metodo di normalizzazione spike-in. È molto importante che tutte le procedure siano condotte su ghiaccio utilizzando tamponi e strumenti privi di RNasi. Inoltre, garantire la preparazione accurata della concentrazione di saccarosio e ridurre al minimo l'agitazione per ridurne l'impatto sul gradiente. Negli studi precedenti 24,25,26, la ricerca sulle risposte allo stress si è concentrata prevalentemente sulle analisi trascrizionali e fenotipiche. Con l'analisi del profilo dei polisomi, possiamo approfondire la regolazione dei processi traslazionali in piante sotto stress o altri stimoli ambientali.

La comprensione dei processi traduzionali comporta non solo la conduzione di esperimenti di profilazione dei polisomi, ma anche il loro completamento con esperimenti di marcatura con azidoomoalanina (AHA). La marcatura AHA viene impiegata per studiare la sintesi proteica e l'attività traduzionale²⁷. Il metodo sostituisce i residui di metionina nelle proteine di nuova sintesi con AHA, un analogo della metionina contenente un gruppo azidico. Le cellule integrano l'AHA nelle proteine di nuova sintesi durante la traduzione. Successivamente, utilizzando tecniche basate sulla chimica azidica come la click chemistry, le proteine contenenti AHA possono essere marcate e rilevate in modo selettivo, consentendo l'analisi quantitativa e la visualizzazione delle proteine che traducono attivamente²⁸. Combinando la marcatura AHA con la profilazione dei polisomi, i ricercatori possono ottenere informazioni più approfondite sulle dinamiche della sintesi proteica all'interno delle cellule vegetali⁸.

Con questo metodo di isolamento dell'RNA polisomiale e normalizzazione spike-in, possiamo anche utilizzare l'RNA estratto per l'analisi del sequenziamento dell'RNA. Analizzando l'mRNA legato ai polisomi, possiamo determinare quali mRNA sono attivamente sottoposti a traduzione. Inoltre, il confronto tra l'mRNA allo stato stazionario e l'mRNA legato ai polisomi ci permette di identificare i geni che sono sovraespressi a livello di traduzione o trascrizione. Il livello di espressione dell'mRNA allo stato stazionario riflette l'attività trascrizionale, mentre l'mRNA legato ai polisomi indica geni attivamente sottoposti a traduzione. L'efficienza traduttiva è influenzata da stimoli ambientali e modificazioni post-traduzionali 7,8,9,16. Pertanto, questo metodo fornisce una comprensione completa del fatto che la proteina bersaglio di interesse sia tradotta in modo efficace. Tuttavia, il limite di questo metodo è che ci sarà comunque una perdita di RNA durante la procedura di estrazione. Anche l'espressione relativa dell'RNA spike-in ottenuto attraverso la qRT-PCR può causare lievi errori di misurazione. Sono necessarie ulteriori ricerche e validazioni mediante proteomica o Western blot per studiare gli aspetti funzionali della proteina bersaglio.

In sintesi, questo protocollo rappresenta un metodo semplice che fornisce un approccio diretto con risultati chiari per la valutazione dell'efficienza della traduzione. È importante sottolineare che la sua applicabilità si estende oltre le piantine trattate con stress termico per comprendere piantine esposte a vari altri stimoli ambientali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta eppendorf da 1,5 mL	Labcon	3012-870-000-9	Estrazione dell'RNA
Provetta da centrifuga da 13,2 mL	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugazione
Blu di bromofenolo	Honeywell	32712	Profilo polisomiale
Cloroformio	Honeywell	32211	Estrazione dell'RNA
Cicloesimide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Profilo polisomico
Dietilpirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Estrazione dell'RNA
Etanolo	Sigma-Aldrich	32221	Estrazione dell'RNA
GeneChip, Kit di controllo dell'RNA poli-A eucariotico	Invitrogen	900433	Normalizzazione,
Glicerolo	Honeywell	15523	Normalizzazione,
Eparina	, Sigma-Aldrich	SI-H3149	Profilo polisomiale
HiScript III RT SuperMix per kit qPCR	Vazyme	R323-01	Normalizzazione
KCl	J.T.Baker	3040-01	Profilo polisomatico
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Profilo polisomico
MS terreno basale	Phyto	M524
Grafico dei picchi delle piante Pompa a siringa	Brandel	SYN4007LS	Profilo polisomico
Poliossietilene-10-Tridecil-Etere (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Profilo
polisomaticoRNasin	Promega	N251B	Profilo polisomiale
Sodio desossicolato (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Profilo polisomico
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S5391	Profilo polisomatico
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalizzazione
TRI reagente	MRC	TR118	Estrazione dell'RNA
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Profilo polisomiale
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugazione
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Profilo polisoma