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Articolo metodologico

Istituzione di modelli di ratto che imitano le terapie ormonali per l'affermazione del genere

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DOI:

10.3791/67470

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10 gennaio 2025

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1Center for Gender-Specific Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 2Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”, 3Centre Animal Research and Walfare, Istituto Superiore di Sanità

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il protocollo descrive lo sviluppo di due modelli di roditori che imitano le terapie ormonali di affermazione di genere attraverso la somministrazione sottocutanea di testosterone o estradiolo più ciproterone acetato (utilizzato nelle terapie umane per le persone transgender): impostazione delle dosi, identificazione di biomarcatori rilevanti e valutazione degli effetti.

Abstract

Le persone transgender (TG) sono individui la cui identità di genere e il sesso assegnato alla nascita non corrispondono. Spesso si sottopongono alla terapia ormonale di affermazione del genere (GAHT), un intervento medico che consente l'acquisizione di caratteristiche sessuali secondarie più allineate con la loro identità di genere individuale, fornendo risultati costanti nel miglioramento di numerose variabili socio-psicologiche. Tuttavia, il GAHT si rivolge a diversi sistemi corporei e vengono registrati alcuni effetti collaterali, anche se non ancora completamente identificati e caratterizzati. Pertanto, le persone TG sottoposte a GAHT possono essere considerate come un sottogruppo di popolazione suscettibile e un'attenzione specifica dovrebbe essere prestata nel quadro della valutazione del rischio, ad esempio attraverso l'uso di modelli animali mirati. Il presente lavoro descrive le procedure impostate per implementare due modelli di ratto che imitano il GAHT: il modello demascolinizzante-femminilizzante (dMF) che imita il GAHT per le donne TG e il modello defeminizzante-mascolinizzante (dFM) che imita il GAHT per gli uomini TG. I modelli sono stati implementati attraverso la somministrazione degli stessi ormoni utilizzati per il GAHT umano, vale a dire, β-estradiolo più ciproterone acetato per dMF e testosterone per dFM, attraverso le stesse vie di esposizione per un periodo di 2 settimane. I ratti vengono controllati quotidianamente durante il trattamento per valutare lo stato di salute e i comportamenti potenzialmente aggressivi. Al momento del sacrificio, il sangue e i tessuti bersaglio sono stati campionati e conservati per analisi biochimiche, molecolari e istopatologiche. Sono stati valutati anche i parametri specifici del sesso, vale a dire il numero di spermatozoi e le dimensioni del clitoride. Inoltre, le isoforme del CYP450, espresse esclusivamente e/o preferenzialmente nel fegato di ratto maschio e femmina, sono state identificate e caratterizzate come nuovi biomarcatori per verificare il successo del GAHT e per impostare il modello. Anche il coinvolgimento della tiroide è stato esplorato come bersaglio chiave nel sistema endocrino.

Introduzione

La percezione psicologica dell'individuo di essere maschio, femmina, nessuno dei due, entrambi o da qualche parte nel mezzo1 è chiamata identità di genere. Può corrispondere al sesso biologico (cisgender) o può essere diverso (transgender - TG). Un uomo TG è un individuo nato come femmina ma che si identifica come uomo. Una donna TG nasce come maschio ma si identifica come donna2. Si stima che, attualmente, ci siano 25 milioni di persone TG in tutto il mondo3, la maggior parte delle quali affette da disforia di genere, una condizione psicologica caratterizzata da incongruenza tra il loro genere e quello che è stato loro assegnato alla nascita4, che può comportare discriminazioni sociali e difficoltà sul lavoro e in famiglia, spesso portando alla depressione, Ansia e stress5. Per tali motivi, le persone TG spesso si sottopongono a terapia ormonale per l'affermazione del genere (GAHT) e/o alla chirurgia per l'affermazione del genere. La GAHT per gli uomini TG è caratterizzata dalla somministrazione di testosterone (T) (Tabella 1) e per le donne TG di estrogeni (E2) più antiandrogeni (Tabella 2)6.

Il GAHT di solito dura per tutta la vita dell'individuo, agendo continuamente sul sistema endocrino 7,8. Quindi, è importante analizzare l'impatto del GAHT sulla salute delle persone TG e i suoi potenziali effetti a lungo termine. Inoltre, le persone TG sono esposte, come la popolazione generale, a contaminanti chimici - in particolare, gli interferenti endocrini (ED) - che prendono di mira il sistema endocrino come GAHT, con conseguente sovrastimolazione9.

La disfunzione erettile è un gruppo di sostanze chimiche che influenzano gli organismi e/o la loro progenie alterando diversi processi ormonali e metabolici, come la secrezione, l'attivazione, la sintesi, il rilascio e il legame di ormoni naturali. Poiché gli ED sono diffusi nell'ambiente, negli alimenti e nei prodotti di uso quotidiano (ad esempio, bottiglie e contenitori di plastica, rivestimenti di lattine di metallo per alimenti, detersivi, ritardanti di fiamma, alimenti, giocattoli, cosmetici e pesticidi, ecc.) la popolazione generale è continuamente esposta durante l'intera vita10. Inoltre, anche l'esposizione a basse dosi di PS può portare a danni ai tessuti e agli organi e un fenomeno comune associato all'esposizione alla DE è il verificarsi di effetti specifici del sesso sia negli animali da laboratorio che nell'uomo11. Ad esempio, l'esposizione al materiale a contatto con gli alimenti, il bisfenolo A (BPA), è collegata a rischi per la salute come l'endometriosi e la sindrome dell'ovaio policistico nelle donne, nonché a una ridotta fertilità, a causa dei suoi effetti estrogenici12. Negli uomini, il BPA può abbassare i livelli e diminuire la qualità dello sperma13. Inoltre, i pesticidi sono associati a un rischio più elevato di cancro al seno nelle donne e a significativi problemi di fertilità negli uomini13. Finora, non sono disponibili strumenti specifici per studiare gli effetti tossicologici dei contaminanti ambientali, compresa la disfunzione erettile, nelle persone TG9.

Il presente studio si propone di descrivere i metodi e i parametri selezionati per lo sviluppo di due modelli animali di TG: un modello demascolinizzante-femminizzante (dMF) e un modello defeminizzante-mascolinizzante (dFM). In particolare, vengono valutati la selezione dei livelli di dose adeguati, il tempo e il modo di somministrazione degli ormoni sulla base delle attuali terapie umane14. Inoltre, vengono identificati e caratterizzati i biomarcatori tissutali e funzionali che definiscono i modelli in modo univoco. Inoltre, l'efficacia e la tollerabilità della terapia negli animali, nonché la selezione dei marcatori più appropriati per l'uso in studi a lungo termine, sono descritti in dettaglio insieme alle tecniche utilizzate a tali scopi.

Al fine di caratterizzare i modelli, vengono analizzati i seguenti endpoint: livello sierico di testosterone (T) (il miglior biomarcatore per valutare il successo di GAHT in entrambi i modelli 9,15); livello sierico di estradiolo (E2) (entrambi i modelli); ormone stimolante la tiroide (TSH) e tiroxina (T4) (modello dMF); conta degli spermatozoi (modello dMF); dimensione del clitoride (modello dFM); Analisi istopatologica degli organi riproduttivi, del fegato e della tiroide (per entrambi i modelli). Inoltre, viene analizzata anche l'espressione genica delle seguenti isoforme del citocromo P450 epatico sesso-specifico (CYP450s, per entrambi i modelli)16,17: CYP2C11 (specificamente espresso nel fegato maschile), CYP3A18 (espresso 25 volte di più nel fegato maschile che in quello femminile), CYP2C12 (specificamente espresso nel fegato femminile) e CYP2C6 (espresso prevalentemente nel fegato femminile, ma presente a livelli inferiori, anche nel maschio).

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Protocollo

Gli studi sono condotti in conformità alla Direttiva 2010/63/UE, al Decreto Legislativo n. 26 del 4 marzo 2014 e ai Principi di Buona Pratica di Laboratorio (BPL) dell'OCSE. Il protocollo di studio è stato approvato dal Ministero della Salute italiano (autorizzazione n. 806/2021-PR). Qui, 16 giovani ratti Sprague-Dawley sessualmente maturi di entrambi i sessi (304 ± 13 g di ratti maschi e 190 ± 7 g di ratti femmine, di 8-9 settimane) vengono acquistati e alloggiati in due/gabbia in condizioni standard di laboratorio (22 ± 0,5 °C, 50%-60% di umidità relativa, 12 ore di alternanza buio-luce con 12-14 ricambi d'aria all'ora) con acqua e cibo disponibili ad libitum. In tutte le gabbie, per l'arricchimento ambientale di ogni animale, inserire blocchi di legno da rosicchiare e sostituirli settimanalmente.

NOTA: Gli animali di età compresa tra 8 e 9 settimane sono stati scelti poiché il GAHT può iniziare durante l'adolescenza (stadi di Tanner da 2 a 3), corrispondenti a 8-9 settimane nei roditori, e dura a lungo, potenzialmente per tutta la vita dei pazienti TG9.

1. Dimensionamento del gruppo e cura degli animali

  1. Utilizzare giovani ratti adulti maschi e femmine di Sprague-Dawley (8-9 settimane di età) come modello poiché il ratto è la specie preferita indicata dall'OCSE (ad esempio, la linea guida 421 Test di screening della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo) e l'unica specie di roditore proposta e considerata nella linea guida OCSE 407 (studio di tossicità orale di 28 giorni a dose ripetuta nei roditori, aggiornato con i parametri per il rilevamento delle EI).
  2. Utilizzare il software G*Power per il dimensionamento del gruppo. Sia per il modello dFM che per il modello dMF, selezionare quattro gruppi di test: un gruppo di controllo (C) e tre gruppi di animali trattati con dosi diverse di GAHT. Eseguire il dimensionamento con riferimento al confronto tra due gruppi (dose di trattamento rispetto a C) con il test di Mann-Whitney, un livello di significatività a due code alfa = 0,0167 (corrispondente ad alfa = 0,05 con la correzione di Bonferroni applicata ai 3 confronti tra ciascuna dose di trattamento e la C) e potenza 1-beta = 0,80.
    1. Il numero calcolato di ratti/gruppi è il seguente:
      per il modello dFM, animali/gruppo n=4, secondo Kinnear et al.18 indicando dopo 2 settimane di trattamento, i seguenti livelli: nel gruppo di controllo: 0,2 ± 0,3 ng/mL, nel gruppo di terapia ormonale: 16 ± 5 ng/mL (media ± deviazione standard), corrispondente a una dimensione dell'effetto misurata con d di Cohen = 4,46 (effetto molto grande).
      per il modello dMF: animali/gruppo n=3, secondo Gómez et al.19 indicando dopo 2 settimane di trattamento, i seguenti livelli: gruppo di controllo: 1,901 ± 0,413 ng/mL e gruppo di terapia ormonale: 0,043 ± 0,023 ng/mL (errore medio ± standard) corrispondente a una dimensione dell'effetto misurata con d di Cohen = 6,35 (effetto molto grande).
    2. Per allineare i due modelli, scegli n=4 animali per sesso/gruppo, per un totale di N = 32 animali.
  3. Dopo 1 settimana di acclimatazione, dividere i ratti per sesso in due gruppi sperimentali (dMF e dFM, 4 ratti/gruppo), ciascuno composto da un C (maschio di controllo, CM e femmina di controllo, CF) e tre gruppi di trattamento del GAHT selezionato.
  4. Monitorare tutti i ratti 2 volte al giorno (alle 8:30 e alle 16:00) per verificare le condizioni generali di salute e la potenziale aggressività dovuta alla somministrazione di GAHT. Registra il peso corporeo (p.c.) e il consumo di mangime 2 volte a settimana, utilizzando una bilancia analitica con la funzione di ponderazione dinamica ottimale per il peso degli animali da laboratorio.
  5. Nel modello sperimentale dFM, misurare il diametro del clitoride di tutti i ratti immediatamente prima dell'inizio del trattamento (punto 0) e alla fine del trattamento (punto 13), utilizzando un misuratore digitale per letture di precisione.
  6. Pesare tutti gli animali prima del sacrificio e, nel modello dMF, subito dopo il sacrificio rimuovere l'epididimo per eseguire il conteggio degli spermatozoi.

2. Selezione e preparazione della dose

  1. Utilizzare le seguenti tre dosi di ormoni da somministrare ai ratti dFM: 5, 10,5 e 22,5 mg/kg a settimana, per il modello dMF, utilizzare i seguenti tre livelli di dose selezionati (DL): DL1 E2 0,045 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg, DL2 E2 0,09 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg e DL3 E2 0,18 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg.
    NOTA: Tutte le dosi sono selezionate tenendo conto delle principali linee guida cliniche umane utilizzate per le persone TG15 e dei limitati dati disponibili in letteratura.
  2. Preparare settimanalmente tutte le soluzioni madre utilizzando una cappa di sicurezza chimica. Mescolare correttamente tutte le sostanze nell'olio di sesamo come veicolo, assicurandone la completa solubilizzazione.
    NOTA: Per entrambi i modelli, utilizzare un calcolatore di conversione della dose (https://dosecal.cftri.res.in/) per inserire la dose da convertire, la specie per la quale è stata impostata la dose, la specie animale e il peso per il quale convertire la dose. Per il modello dFM (Tabella 3), terapia ormonale umana, una dose massima di 100 mg di T alla settimana20. La dose calcolata nei ratti è di 10,5 mg/kg di T alla settimana. La seconda dose è di 22,5 mg/kg a settimana nei ratti18. La terza dose è di 5 mg/kg a settimana, identificata mantenendo il fattore di 2,1 tra le due dosi calcolate. Per il modello dMF vedere la Tabella 4, i dosaggi si basano sui regimi raccomandati per l'uomo21 e sui dati disponibili attraverso studi in vivo 14,19,22.

3. Trattamento degli animali

  1. Eseguire la somministrazione sottocutanea di T (per il modello dFM) ed E2 più CPA (per il modello dMF) pizzicando e sollevando la pelle nel sito di iniezione, formando una sorta di tenda. Quindi, inserire l'ago di una siringa da 1 ml parallelamente alla schiena dell'animale. Una volta all'interno, iniettare lentamente il volume richiesto (100 μL per T; 200 μL per E2+CPA)23.
    1. Trattare gli animali come segue: per il modello dFM, somministrare T enantato disciolto in olio di sesamo (veicolo) 2 volte alla settimana per 2 settimane (100 μl per ogni iniezione sottocutanea di T). Per il modello dMF, somministrare E2 più CPA acetato disciolto in olio di sesamo (veicolo) 5 volte a settimana per 2 settimane (200 μL per ogni iniezione sottocutanea). Trattare i ratti del gruppo C allo stesso modo solo con il veicolo (olio di sesamo).

4. Prelievo di sangue, sacrificio e prelievo di tessuti

  1. Dopo 2 settimane di trattamento, poco prima del sacrificio, utilizzare un sistema di anestesia gassosa e anestetizzare tutti gli animali. Indurre l'anestesia con una dose variabile dal 2% al 3,5% di isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di 1,5 L/min fino alla perdita dei riflessi in una camera di induzione trasparente in polistirene. Posizionare il ratto in posizione prona sul termoforo e regolare la dose di isoflurano a una dose di mantenimento variabile dall'1,5% al 3,5% somministrata da una maschera nasale di ratto standard durante la procedura di prelievo di sangue intracardiaco.
  2. Preparare una siringa da 5 ml con un ago da 21G, eliminando il vuoto. Sondando il cuore con le dita, inserire con cautela l'ago nella parete toracica laterale perpendicolare al corpo all'incirca nel punto dei gomiti flessi, tra le costole 5 e 6. Una volta all'interno del ventricolo cardiaco, il sangue entra nella siringa per capillarità. Ritrarre il pistone della siringa lentamente e continuamente fino a quando il sangue non fuoriesce.
  3. Dopo il prelievo di sangue, posizionare i ratti nella camera di CO2 per eseguire l'eutanasia utilizzando l'asfissia di CO2 con un tasso di riempimento del 30%-70% di spostamento del volume della camera al minuto. Dopo 2-3 minuti, verificare la morte degli animali monitorando la respirazione e il battito cardiaco24.
  4. Dopo il sacrificio, posizionare ogni animale sul tavolo di dissezione in posizione supina, con le zampe anteriori rivolte verso l'alto e le zampe posteriori rivolte verso il basso, e fissarli con degli spilli. Cospargere l'addome dell'animale con una soluzione disinfettante.
  5. Asportare i seguenti organi: testicoli, epididimo, utero, ovaie, fegato e tiroide. Pesarli e conservarli in provette da 50 mL con 35 mL di formalina tamponata al 10% (tutti gli organi) o soluzione di Bouin (solo testicolo) o raccoglierli in provette criogeniche (un organo/provetta) e congelarli immediatamente in azoto liquido (per la conservazione a -80 °C).
    1. Per prima cosa, taglia la pelle con le forbici sulla linea mediana, dal pube alla parte superiore dell'addome. Fai due tagli laterali sulla gabbia toracica e rifletti la pelle su entrambi i lati dell'incisione per esporre i visceri toracici.
    2. Rimuovere prima gli organi riproduttivi; Nei ratti maschi, rimuovere i testicoli, organi accoppiati di forma ovale situati nella cavità addominale, in posizione intra-addominale (sacco scrotale). Tagliare e premere il sacco scrotale per assicurarsi che i testicoli sporgano, quindi afferrarli delicatamente. Trattieni il grasso viscerale con una pinza, quindi taglia i testicoli lontano dai visceri. Dopo l'escissione, pesare e conservare i testicoli nella soluzione di Bouin per l'analisi istopatologica.
    3. Nelle femmine di ratto, prima afferrare delicatamente l'utero, quindi tagliare le ovaie (che si trovano all'estremità di entrambe le corna uterine) dal tessuto adiposo viscerale. Dopo l'escissione, pesare le ovaie.
    4. Sia nei ratti femmine che in quelli maschi, passare al lato destro della cavità addominale, dove si trova il fegato. Il fegato è un organo multilobato ed è possibile identificare molte parti: mediale sinistra (più piccola), laterale sinistra (maggiore), mediale destra (più piccola), laterale destra (maggiore), caudato e lobo quadrato25. Afferra il fegato con il forcipe, facendo attenzione a non romperlo. Afferrare il processo xifoideo con una pinza e tagliare completamente il diaframma con le forbici.
    5. Usa una pinza per sollevare il processo xifoideo ed estrarre il fegato dalla cavità addominale. Separare il fegato dal diaframma con le forbici. Dopodiché, pesa il fegato e conservalo.
    6. Per l'estrazione della tiroide, con l'aiuto delle forbici, tagliare perpendicolarmente lungo il collo dell'animale, rimuovere la pelle e la muscolatura e tagliare delicatamente le estremità della trachea, in cui si trova la ghiandola tiroidea. Conservare la tiroide per ulteriori analisi26.
  6. Eseguire il conteggio degli spermatozoi come descritto di seguito.
    1. Dopo la rimozione del testicolo, afferrare l'epididimo, che è attaccato al margine posteriore del rispettivo testicolo e contenuto nello scroto.
    2. In questo esperimento, i campioni di sperma vengono prelevati dalla coda dell'epididimo destro. Al momento della raccolta, pulire la coda dal grasso e dal tessuto connettivo con le forbici, separarla dalla parte rimanente e metterla in una piastra di Petri (35 mm x 10 mm) contenente 1 mL di DMEM. Tagliare con le forbici e far scorrere con una pipetta Pasteur per facilitare il rilascio del contenuto.
    3. Trasferire tutto il liquido ottenuto in una provetta da 15 mL e portare il volume a 10 mL con DMEM (fattore di diluizione 1:10=0,1). Pipettare il contenuto per omogeneizzare e creare una sospensione. Dopo una leggera agitazione, prelevare 10 μl di sospensione per caricare la camera Neubauer. Caricare la fotocamera e dopo 3 minuti di caricamento della fotocamera, iniziare il conteggio.

5. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

  1. Raccogliere campioni di sangue (circa 2-5 ml per animale) in provette da 2 ml e lasciarli coagulare a temperatura ambiente per 1 ora. Centrifugare tutti i campioni di sangue in una centrifuga 2 volte per 15 minuti a 4 °C e 3000 x g.
  2. Il sangue centrifugato ha un aspetto multistrato con tre strati di colori diversi. Lo strato superiore è costituito da plasma (solitamente giallo o trasparente), la parte liquida del sangue; lo strato sotto il plasma può avere una colorazione biancastra o grigia ed è il mantello di Buffy. Lo strato più basso contiene globuli rossi e il colore può apparire rosso scuro o rosso vivo. Per determinare i livelli di ormoni sessuali, raccogliere il siero di tutti i campioni con una pipetta (senza toccare il buffy coat o gli strati eritrocitari), dividerli in aliquote (500 μL) e conservarli a -80 °C.
  3. In entrambi i modelli, eseguire il test ELISA per rilevare e/o misurare la presenza di proteine, anticorpi o antigeni nel campione per la determinazione degli ormoni sessuali. Usa il metodo diretto e segui le istruzioni di ogni kit ELISA. In questo studio, sono stati determinati i livelli sierici dei seguenti ormoni nei ratti: E2, ELISA di estradiolo di ratto; T, Testosterone di topo/ratto Elisa; TSH, kit ELISA per ratti e T4, kit ELISA per ratti.

6. Analisi istopatologica

  1. Preparare vetrini istologici di tessuti secondo le seguenti procedure.
  2. Fissare i campioni dell'utero, dell'ovaio, della tiroide e del fegato al momento dell'estrazione in formalina tamponata al 10% per almeno 48 ore.
    ATTENZIONE: Lavorare sotto una cappa chimica. Non inalare la sostanza/miscela. Evitare di generare vapore/aerosol.
  3. Lavare i campioni sotto l'acqua corrente per 1 ora e quindi conservare in alcol etilico all'80% (C2H5OH) fino alla lavorazione, per preservare la struttura protoplasmatica dalle alterazioni derivanti dalla morte cellulare.
  4. Fissare il testicolo nella soluzione di Bouin composta da 15 mL di soluzione satura di acido picrico, 5 mL di formalina concentrata (33%-40%) e 1 mL di acido acetico glaciale per 48 ore. Lavare i campioni con alcool etilico all'80%.
    ATTENZIONE: Lavorare sotto una cappa chimica.
  5. Eseguire l'inclusione in paraffina solida utilizzando un processatore automatico di tessuti. Al termine del processo di inclusione, porre i campioni in piccoli contenitori metallici in cui è stata versata la paraffina fusa e raffreddare su una piastra congelata, formando i blocchi per il taglio. Orientarli in base alla sezione di taglio desiderata.
  6. Successivamente, tagliare i campioni utilizzando un microtomo rotante. Raccogliere sezioni da 5-6 μm con piccoli pennelli, stenderle in acqua a 37 °C per alcuni secondi e posizionarle su vetrini da microscopio. Lasciare scolare perpendicolarmente i vetrini per qualche minuto e asciugarli in forno a 36 °C per almeno 1 h.
  7. Eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina come descritto di seguito.
    1. Deparaffinare i vetrini immergendoli in un agente chiarificante di origine terpenica (sostituto dello xilene) per 5 min.
    2. Reidratare i vetrini immergendoli nella seguente serie di etanolo graduato. Per ogni soluzione, 2 minuti per immersione: 100% etanolo, 95% etanolo, 80% etanolo, 50% etanolo e acqua distillata.
      NOTA: Può essere un punto di arresto per il protocollo e gli scivoli possono essere lasciati a RT in acqua per diverse ore. Opzionalmente, gli scivoli possono anche essere conservati a 4 °C in acqua.
    3. Posizionare i vetrini nell'ematossilina di Mayer per 5 minuti. Ritrasferirli immediatamente nel contenitore con acqua del rubinetto per 5 minuti. Far scorrere l'acqua del rubinetto nell'angolo posteriore del contenitore più lontano dalle sezioni. Svuotare periodicamente il contenitore fino a quando il colorante viola nell'acqua non è più presente.
      NOTA: Per evitare che le sezioni si stacchino dagli scivoli, non far scorrere l'acqua direttamente sugli scivoli.
    4. Posizionare i vetrini nella soluzione acquosa di eosina Y all'1% per 2 minuti. Trasferire i vetrini in acqua distillata per 15 s. Disidratare i vetrini immergendoli nella seguente serie di etanolo graduato. Per ogni soluzione, 15 s per immersione: 50% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo.
    5. Mettere i vetrini in etanolo al 100% per 1 minuto e cambiarlo con etanolo fresco al 100% per un altro 1 minuto. Mettere i vetrini in un agente di pulizia di origine terpenica (sostituto dello xilene) per 2 minuti e sostituirlo con un agente di pulizia fresco di origine terpenica (sostituto dello xilene) per altri 2 minuti. Rimuovere un vetrino alla volta e posizionare un vetrino coprioggetti.
    6. Coprire le sezioni con un mezzo di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti sul fondo del vetrino.
      NOTA: Assicurarsi che il supporto di montaggio tiri la guida in posizione. Se il vetrino coprioggetti non è piatto, picchiettarlo delicatamente in posizione. Tamponare il supporto di montaggio in eccesso con un tovagliolo di carta.
    7. Immergere una salvietta detergente nell'agente schiarente di origine terpenica (sostituto dello xilene) e strofinare il retro del vetrino per rimuovere il mezzo gocciolato. Posiziona la diapositiva su una superficie solida mobile, come un pezzo di cartone. Aggiungere il vetrino coprioggetti a tutti i vetrini rimanenti come descritto nel passaggio 6.7.6. Lasciare asciugare le guide e indurire il mezzo di montaggio a RT nella cappa.
      ATTENZIONE: Lavorare sotto una cappa chimica.
  8. Dopo la colorazione, coprire i campioni con un vetrino coprioggetti e valutarli al microscopio ottico. Le alterazioni istopatologiche sono state descritte in base alla distribuzione, alla gravità e alle caratteristiche morfologiche.
  9. Eseguire il punteggio degli infortuni in modo semi-quantitativo, utilizzando una scala di valutazione a 5 punti (da 0 a 4), considerando la gravità delle modifiche in base ai criteri spiegati da Shackelford et al.27 e riassunti come segue:
    Grado 0: nessuna modifica
    Grado 1: variazione minima. L'effetto è appena visibile sul tessuto; piccolo e poco frequente. Interessa una porzione di tessuto inferiore o uguale al 10%.
    Grado 2: cambio di luce. Rappresenta una piccola modifica istologica. Questo grado viene utilizzato quando il tessuto, o la sua struttura, ha mostrato una variazione di volume compresa tra l'11% e il 20%.
    Grado 3: cambiamento moderato. Il cambiamento è evidente nel tessuto. Il grado indica la presenza di variazioni tra il 21% e il 40% del tessuto o della sua struttura
    Grado 4: netto cambiamento. Cambiamento istologico travolgente del tessuto o della sua struttura. Le variazioni interessano il 41%-100% del tessuto.
  10. Eseguire analisi istomorfometriche quantitative su utero, ovaio, testicolo e tiroide. Esaminare le sezioni di tessuto utilizzando un sistema di analisi delle immagini applicato a un microscopio ottico e seguire i passaggi descritti di seguito.
    1. Utero: utilizzando un obiettivo 2x misurare l'area totale di ciascuna sezione trasversale del corno uterino destro, il miometrio esterno e interno e il lume uterino. Calcola l'area dell'endometrio e del miometrio e il rapporto tra l'area dell'endometrio e il miometrio28.
    2. Ovaio: utilizzare una delle sezioni intere nella posizione centrale dell'ovaio per rivelare i follicoli nelle varie fasi di sviluppo; contare i follicoli primario, secondario, del corpo luteo, di Graaf e atresico utilizzando un obiettivo 4x. Eseguire la classificazione dei follicoli secondo Fortune29. Inoltre, misurare l'area dell'ovaio per ciascun campione e la sua densità follicolare (numero di follicoli/area dell'ovaio x 100)30.
    3. Testicolo: Utilizzando l'obiettivo 10x, misurare 20 tubuli/campione; Inoltre, misurare l'area totale del lume, l'area totale, il diametro longitudinale e il diametro trasversale28.
    4. Tiroide: Misurare i seguenti parametri: densità follicolare (rapporto tra il numero di follicoli e una data area, obiettivo 10x); altezza delle cellule follicolari indirette (rapporto medio tra area follicolare e area colloidale in cinque follicoli selezionati casualmente/campione obiettivo 40x); il rapporto medio tra le aree dell'epitelio follicolare e il numero dei nuclei (nello stesso follicolo per accertare la maturazione follicolare); Altezza delle cellule follicolari (media di cinque altezze cellulari in cinque follicoli selezionati casualmente/campione, obiettivo 64x)31.

7. Espressione genica

  1. Per entrambi i modelli, eseguire l'analisi dell'espressione genica utilizzando campioni di fegato conservati a -80 °C. Seguire il protocollo di purificazione dell'RNA totale utilizzando un kit, partendo da un lisato di tessuto animale.
    1. Per ottenere il lisato epatico, macinare il campione di tessuto (10 mg) con un minipinner, aggiungere 600 μL di RL BUFFER (fornito con il kit) al campione di tessuto e continuare a macinare fino a quando il campione non è stato omogeneizzato.
  2. Subito dopo l'estrazione, quantificare l'RNA ottenuto e valutarne la qualità (per la denaturazione o la presenza di eventuali residui proteici) utilizzando un fluorospettrometro. Eseguire letture spettrofotometriche dell'assorbanza a lunghezze d'onda di 260 nm e 280 nm, dove assorbono rispettivamente acidi nucleici e proteine.
  3. Dopo la valutazione della concentrazione di RNA totale, utilizzando un kit di sintesi di cDNA seguendo le istruzioni del produttore, trascrivere il volume appropriato contenente 1 μg di RNA totale da ciascun campione al cDNA.
  4. Analizzare il cDNA ottenuto mediante RT-PCR.
    1. Per analizzare le espressioni geniche dei geni di interesse, sono stati progettati specifici primer diretti e inversi per ciascun gene bersaglio, nonché per il gene di riferimento costitutivamente espresso gliceraldeide fosfato deidrogenasi (GAPDH). Utilizza l'applicazione web Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) per scegliere i migliori primer che garantiscano la specificità dell'accoppiamento solo al gene di interesse e ottenere gli oligonucleotidi sintetizzati da un fornitore commerciale. Le sequenze delle coppie di primer utilizzate sono riportate nella Tabella 5.
    2. Risospendere i primer liofilizzati con acqua distillata priva di RNAsi a una concentrazione finale di 100 mM. Utilizzare un kit dedicato per eseguire l'analisi qPCR. Eseguire le reazioni in un volume finale di 20 μl, diluendo il cDNA ricotto 1:40. Caricare ogni campione in duplicato in piastre PCR a 96 pozzetti.
    3. Eseguire le esecuzioni qPCR sul termociclatore seguendo questo programma: 1 ciclo a 95 °C per 10 minuti; 40 cicli a 95 °C per 15 s, 58 °C per 30 s e 72 °C per 1 min. Al termine, eseguire un ciclo di dissociazione da 55° C a 95° C (30 s/°C) per verificare la specificità del prodotto amplificato. Utilizzando il software dedicato della macchina, ottenere i valori di ciclo di soglia (Soglia di ciclo, Ct) per ogni campione. Esprimere i risultati come ΔΔ Ct (delta delta Ct) secondo la formula di Pfaffl32:
      Gene bersaglio ΔCt = Controllo Ct - Trattato con Ct
      Gene di riferimento ΔCt = Controllo Ct - Trattato con Ct
      ΔCt = Gene bersaglio ΔCt - Gene di riferimento ΔCt

8. Analisi dei dati

  1. Esegui la gestione dei dati utilizzando un foglio di calcolo. Esegui analisi utilizzando un software di analisi statistica. Progetta la grafica utilizzando software specifici.
  2. Rappresenta l'aumento di peso corporeo, il consumo di mangime, il peso assoluto e relativo degli organi, i livelli sierici ormonali, i dati morfometrici tissutali e i dati di espressione genica come media ± deviazione standard. Eseguire un'analisi di Kruskal-Wallis non parametrica, seguita da confronti a coppie post-hoc (test di Mann-Whitney).
  3. Analizzare i dati istologici utilizzando un test esatto di Fisher a 2 vie per identificare differenze significative rispetto al gruppo di controllo, compresi i campioni assegnati a una categoria senza alcun riferimento alle gradazioni di gravità (incidenza totale dei reperti). Utilizzare il test di tendenza Cochran-Armitage per identificare l'andamento dose-risposta. Considera le differenze tra i gruppi come significative se il valore p è < 0,05.

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Risultati

Come dimostrato da Tassinari et al.14 e da Tammaro et al.33, i seguenti risultati hanno mostrato il successo del GAHT sui ratti e l'appropriatezza dei modelli.

Non sono stati registrati decessi o comportamenti anomali, come l'aggressività, e non sono stati osservati segni clinici di tossicità o sofferenza (ad esempio, diminuzione dell'attività, piloerezione e un aspetto non curato)14.

Le concent...

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Discussione

L'implementazione di modelli di roditori che imitano la GAHT è fondamentale per studiare la potenziale suscettibilità e vulnerabilità specifica delle persone TG e gli esiti a lungo termine delle terapie, che di solito durano per tutta la vita.

Dato lo scarso numero di studi simili presenti in letteratura, il punto critico di questo esperimento è la selezione delle dosi per impostare i modelli; Tali dosi devono essere sufficientemente basse da essere compatibil...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcun rapporto commerciale o finanziario che potesse potenzialmente creare un conflitto di interessi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bilancia analitica ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrifuga 5415 REppendorfPer eppendorf
Cyproterone AcetatoSigma-AldrichC3412
D-MEM mediumGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Soluzione di formalina, tampone neutro, 10%Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism versione 5.0  per WindowsSoftware
GraphPad HematoxylinBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Software di imagingNikonNIS-BR
Software statistico JMP 10SAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopiaNikon Microphot FX
Testosterone per topo / rattoELISA BiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 SpettrofotometroThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Bilance portatili SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesProgettato da PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH (ormone stimolante la tiroide) Kit ELISABiotechnology ELK BiotechnologyELK228396T
Rat TSH (ormone stimolante la tiroide)ELK BiotechnologyELK228396T
Kit di sintesi SensiFASTcDNABiolineBIO-6505350 reazioni
Olio di SesamACROSAC241000010
ratti Sprague Dawley  maschio e femminaEnvigo8/9  settimane di età
Diete standardMucedola4RF18
T4 (Tiroxina) ELISA KitELK BiotecnologiaELK871696T
Testosterone enantatoSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Elaboratore di tessutiShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
KIT per la purificazione dell'RNA totaleNorgen17200
Lettore multilabel Victor 3 a 50 colonne Perkin Elmer
β-Estradiolo 17-valeratoSigma-AldrichE1631

Riferimenti

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