Articolo metodologico

Modello di biofilm aggregato per fibrosi cistica per studiare l'espressione genica rilevante per l'infezione

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DOI:

10.3791/67477

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18 aprile 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio delinea un quadro per lo sviluppo di un modello di biofilm polimicrobico aggregato e l'ottimizzazione di un protocollo di estrazione dell'RNA per valutare l'espressione genica di Pseudomonas aeruginosa che riflette l'ambiente polmonare della fibrosi cistica. Le applicazioni includono la valutazione degli effetti antimicrobici e lo studio di alternative antibiotiche in condizioni rilevanti per la fibrosi cistica.

Abstract

I metodi standard di test preclinici per nuove terapie antimicrobiche utilizzate per trattare le infezioni polmonari croniche nelle persone con fibrosi cistica non riflettono le condizioni ambientali della nicchia polmonare ostile. Le attuali condizioni di test riduzionistiche possono portare alla progressione di composti lungo una pipeline preclinica senza evidenza della loro attività in condizioni di fibrosi polmonare cistica appropriate alla nicchia. Diversi approcci utilizzati per studiare gli antimicrobici tradizionali potrebbero non essere adatti per le alternative antibiotiche, comprese le terapie anti-virulenza come gli agenti anti-quorum sensing e gli inibitori dei siderofori. Questo protocollo documenta un modello di biofilm aggregato di Pseudomonas aeruginosa per confrontare la resistenza e l'espressione genica rilevante per l'infezione in colture monospecie e multispecie (Staphylococcus aureus e Candida albicans), esaminando le riduzioni delle unità formanti colonie (CFU) e i cambiamenti nell'espressione genica, utilizzando algD come esempio. Il modello è stato ottimizzato per piccoli volumi statici di colture batteriche per consentire lo studio di nuovi composti nella fase di scoperta della pipeline di sviluppo del farmaco, dove le quantità di composti possono essere limitate. I biofilm di P. aeruginosa di singole specie sono stati formati nel terreno di fibrosi cistica sintetica 2 (SCFM2) per 24 ore prima del trattamento con meropenem a diverse concentrazioni (1, 16 e 256 μg/mL) per ulteriori 24 ore. I biofilm polimicrobici sono stati stabiliti coltivando Staphylococcus aureus e Candida albicans insieme in SCFM2, quindi inoculando con P. aeruginosa per ulteriori 24 ore e trattando con meropenem. La mancanza di una connessione diretta tra le misure di efficacia dei composti nei test preclinici e i risultati degli studi clinici ha messo in dubbio l'applicabilità degli attuali strumenti di screening di laboratorio. Questo modello ci permette di comprendere l'impatto di fattori rilevanti sull'espressione genica di P. aeruginosa, compresi i geni che contribuiscono alla resistenza e alla virulenza, colmando così questo divario.

Introduzione

La fibrosi cistica (FC) è la malattia autosomica recessiva più comune nelle popolazioni caucasiche1. Le mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) provocano una serie di sintomi clinici, tra cui la sovrapproduzione di muco all'interno del tratto respiratorio. L'alterato trasporto di ioni provoca la disidratazione di questa mucosa, di conseguenza della quale non viene adeguatamente eliminata dal sistema mucociliare, aumentando la suscettibilità alle infezioni polmonari croniche1. La microbiologia del polmone FC è costituita da un gruppo distinto di patogeni opportunisti, con Haemophilus influenzae e Staphylococcus aureus considerati organismi primari che infettano i polmoni di neonati e bambini con FC, seguiti da un declino di questi organismi e dalla successiva colonizzazione con Burkholderia spp., o Pseudomonas aeruginosa durante l'età adulta1,2,3,4. Oltre alle specie batteriche, anche i microrganismi fungini sono comuni nell'ambiente polmonare FC, con Candida spp e Aspergillus spp che sono tra le specie fungine più comunemente isolate3,4,5. Sebbene questi organismi svolgano un ruolo importante nelle infezioni polmonari da FC, i progressi nelle tecniche di coltura e nei metodi indipendenti dalla coltura hanno dimostrato che le infezioni polmonari da FC sono raramente limitate a una singola specie batterica, evidenziando così la natura complessa e polimicrobica del polmone FC1,6.

Nonostante questa conoscenza, gli attuali metodi in vitro e in vivo per lo sviluppo e la sperimentazione di antibiotici da utilizzare nelle infezioni polmonari croniche non hanno una completa somiglianza con la nicchia polmonare FC7, con l'attenzione rivolta alla determinazione della concentrazione inibitoria minima (MIC) del farmaco contro colture di singole specie. Ciò fornisce una considerazione limitata del microambiente infettivo, che è una componente chiave della patologia polmonare FC8. Pertanto, i metodi in genere comportano la crescita di batteri come colture planctoniche, uno stato di crescita che probabilmente non riflette quello dei batteri all'interno del polmone FC. Ciò è particolarmente importante per P. aeruginosa, che tipicamente si presenta come aggregati di biofilm che spesso contengono anche altre specie batteriche e fungine9. Tali fattori presentano sfide quando si testano gli antibiotici per le infezioni polmonari croniche ed evidenziano una disparità tra i metodi di test di suscettibilità agli antibiotici e l'attività antimicrobica all'interno dell'ambiente polmonare FC9,10. Queste sfide sono esacerbate durante lo screening di alternative antibiotiche, come le terapie anti-virulenza, in cui i test MIC non sono un indicatore di attività e non forniscono una comprensione delle interazioni ospite-patogeno11.

L'alginato, un polisaccaride extracellulare, è un componente chiave dei biofilm di P. aeruginosa all'interno della nicchia polmonare e aumenta la tolleranza batterica agli antibiotici e agli agenti immunitari, oltre a migliorare l'adesione superficiale12. L'alginato è un bersaglio interessante per lo sviluppo di terapie anti-virulenza e sono state sviluppate diverse terapie mirate alla biosintesi dell'alginato, come quelle mirate all'algD, un gene chiave nella biosintesi dell'alginato13,14. Tali terapie potrebbero essere utilizzate in combinazione con terapie antibiotiche nelle persone con FC per interrompere i biofilm di P. aeruginosa, convertendo i batteri in uno stato planctonico. Ciò aumenta l'efficacia dell'antibiotico, poiché la rottura della matrice extracellulare del biofilm consente una maggiore capacità dell'antibiotico di raggiungere il bersaglio batterico15. Tuttavia, nonostante l'evidenza di attività in vitro, l'azione di queste terapie all'interno della nicchia polmonare FC rimane poco chiara.

Il modello di biofilm aggregato qui presentato agisce per affrontare questi problemi attraverso l'aggiunta di S. aureus e C. albicans, che sono comuni co-colonizzatori con P. aeruginosa all'interno del polmone FC. Permette anche a P. aeruginosa di crescere in aggregati di biofilm, come si vede nell'ambiente respiratorio. L'uso del mezzo che imita l'espettorato Synthetic Cystic Fibrosis Media 2 (SCFM2) come ambiente nutrizionale per la crescita consente l'aggiunta di influenze dell'ospite, tra cui mucina, (e)DNA extracellulare e un profilo aminoacidico che replica quello osservato all'interno del polmone CF class="xref"<>16.

Per comprendere ulteriormente le condizioni del polmone FC, i biofilm sono esposti al meropenem, un antibiotico che viene spesso prescritto alle persone affette da FC durante i periodi di esacerbazione polmonare. L'uso di un antibiotico all'interno di questo modello è raccomandato come mezzo per replicare le condizioni cliniche in cui un agente anti-virulenza può essere prescritto, ad esempio, come terapia di combinazione accoppiata con un trattamento antibiotico per gestire i sintomi respiratori durante l'esacerbazione. Inoltre, l'inclusione di meropenem consente di valutare la risposta trascrizionale di P. aeruginosa all'esposizione agli antibiotici in condizioni rilevanti per l'infezione. Questo modello potrebbe essere utilizzato per fornire informazioni su quali fattori sarebbero bersagli farmacologici appropriati all'interno del polmone FC. Il modello potrebbe anche essere modificato per includere altri antibiotici rilevanti, come la tobramicina, e per valutare l'espressione di altri geni di interesse.

Qui, questo modello polimicrobico aggregato viene utilizzato per valutare gli effetti della presenza di Staphylococcus aureus e Candida albicans e concentrazioni variabili di meropenem (1, 16 e 256 μg/mL) sull'espressione di algD da parte di P. aeruginosa. Meropenem è prescritto per trattare principalmente le infezioni polmonari da P. aeruginosa e non ha alcun effetto diretto su S. aureus o C. albicans, dove la MIC per entrambe queste specie conviventi è di >256 μg/mL.

Questo lavoro aumenterà la comprensione di come fattori rilevanti, come i fattori dell'ospite all'interno di SCFM2 e i microrganismi co-colonizzanti, possono influenzare l'espressione dei geni rilevanti per l'infezione da P. aeruginosa e fornirà le basi per lo sviluppo e la sperimentazione di terapie anti-virulenza da utilizzare nelle infezioni respiratorie croniche da FC.

Protocollo

1. Preparazione di biofilm di singole specie

  1. Ravvivare P. aeruginosa PAO1 da colture di perle congelate strizzando una singola perlina sull'agar del brodo di lisogenesi (LB) e incubando per 24 ore a 37 °C.
  2. Preparare colture notturne di PAO1 prelevando una singola colonia dalla piastra di striature e aggiungendola a 5 ml di terreno di coltura per libbra. Incubare per una notte (18 ore), quindi diluire a OD600 di 0,05 (equivalente a 1 x 108 CFU/mL) e diluire ulteriormente 1:100 in SCFM2 preparato secondo Palmer, et al.16.
  3. Aggiungere 180 μl di inoculo ai pozzetti di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti a fondo tondo. Preparare biofilm in triplicato biologico per l'enumerazione da parte delle unità formanti colonie (CFU). Un totale di 3 repliche per replicato biologico vengono eseguite solo per la qPCR. A 3 pozzetti separati, aggiungere 180 μL di SCFM2 sterile da utilizzare per i controlli dei terreni.
    NOTA: Le piastre a fondo tondo sono state selezionate rispetto alle tradizionali piastre a fondo piatto grazie alla loro superiorità nel consentire un'esposizione omogenea dell'intero biofilm al terreno di crescita circostante17.
  4. Lasciare che i biofilm si formino per 24 ore, incubando a 37 °C e agitando a 75 giri/min.

2. Preparazione di biofilm multispecie

  1. Ravvivare P. aeruginosa PAO1 e S. aureus SH1000 da colture di perline congelate come descritto sopra. Ravvivare C. albicans CAF2.1 da colture di perle congelate strisciando una singola perlina sull'agar destrosio Saboraud e incubando per 24 ore a 37 °C.
  2. Preparare colture notturne di SH1000 e CAF2.1 prelevando una singola colonia dalla piastra di striatura e aggiungendo 5 ml di LB (colture notturne separate per ciascun organismo). Incubare per una notte per 18 ore. Standardizzare le colture notturne di S. aureus SH1000 e C. albicans CAF2.1 in valori da LB a OD600 di 0,1, che equivalgono a 1 x 109 e 1,2 x 107 CFU/mL, rispettivamente17,18.
  3. Diluire S. aureus e C. albicans per formare un unico inoculo contenente entrambe le specie a concentrazioni di 1 x 106 e 1 x 105 CFU/mL, rispettivamente, in SCFM2.
  4. Aggiungere 162 μl di inoculo ai pozzetti di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Inoculare i biofilm in triplicato biologico per l'enumerazione in base alle unità formanti colonie (CFU). Un totale di 3 repliche per replicato biologico vengono eseguite solo per la qPCR. A 3 pozzetti separati, aggiungere 180 μl di SCFM2 sterile da utilizzare per i controlli dei terreni.
  5. Lasciare formare i biofilm per 24 ore, incubando a 37 °C e agitando a 75 giri/min.
  6. Preparare una coltura notturna di PAO1 prelevando una singola colonia dalla piastra di striature e aggiungendola a 5 ml di terreno LB. Incubare per una notte (18 ore), quindi aggiungere a OD600 di 0,05 (equivalente a 1 x 108 CFU/mL) e diluire ulteriormente a 1 x 105 CFU/mL in SCFM2.
  7. Aggiungere 14,2 μl dell'inoculo PAO1 ai pozzetti della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti, ottenendo che l'inoculo finale del PAO1 sia 1 x 104 CFU/mL.
    NOTA: Questa variazione nella concentrazione dell'inoculo tra le diverse specie serve a garantire che S. aureus e C. albicans non siano superati dal P. aeruginosa e che tutti siano recuperabili mediante placcatura a punti dal biofilm delle 24 ore in cui non sono presenti antibiotici.
  8. Lasciare che i biofilm polimicrobici si formino per 24 ore, incubando a 37 °C e agitando a 75 giri/min.

3. DNasi e trattamento antibiotico di biofilm monospecie e multispecie

  1. Aggiungere 2 μL di DNasi I direttamente ai pozzetti contenenti i biofilm a una concentrazione finale di 50 μg/mL, incubare per 1 ora a 37 °C e agitare a 75 giri/min.
    NOTA: Questo viene aggiunto per fluidificare i biofilm viscosi per consentire una migliore penetrazione degli antimicrobici, riflettendo il dosaggio di rhDNasi (DNasi umana ricombinante) che viene assunto da molte persone con fibrosi cistica come strategia di gestione per le esacerbazioni polmonari.
  2. Preparare una dose di antibiotico di meropenem a 2,56 mg/mL, utilizzando acqua distillata come diluente. Diluire in serie di un fattore 2 per ottenere concentrazioni da 0,01 mg/mL a 2,56 mg/mL.
  3. Aggiungere 20 μl di ciascuna diluizione di meropenem ai biofilm per ottenere un intervallo di dosaggio compreso tra 1 μg/mL e 256 μg/mL. Aggiungere 20 μl di acqua distillata ai biofilm di controllo negativo al posto dell'antibiotico.
  4. Sigillare la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti con una pellicola trasparente e incubare a 37 °C per 24 ore, agitando a 75 giri/min.

4. Enumerazione delle cellule vitali e dell'attività metabolica

NOTA: I seguenti passaggi sono solo per i biofilm destinati alla quantificazione UFC.

  1. Aggiungere 10 μL di cellulasi (100 mg/mL, tampone citrato 0,05 M) ai biofilm e incubare a 37 °C per 1 ora, agitando a 140 giri/min. La cellulasi viene regolarmente utilizzata per distruggere gli scheletri di cellulosa all'interno dei biofilm19,20,21. Interrompere ulteriormente i biofilm pipettando su e giù, se necessario, fino a quando non sono presenti grumi visibili.
  2. Aggiungere 10 μl di soluzione di resazurina allo 0,02% per valutare l'attività metabolica dei biofilm di prova e controllare i biofilm e incubare a 37 °C per 1 ora, agitando a 140 giri/min.
  3. Misurare la fluorescenza di ciascun pozzetto utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm nel lettore di micropiastre.
  4. Correggere la fluorescenza di fondo sottraendo i valori di fluorescenza dai campioni di terreno bianco e calcolare la percentuale di riduzione come (media deibiofilm trattati con antibiotici F/media delcontrollo F negativo) x 100 %.
  5. Enumerare il contenuto dei pozzetti, contenenti sia i biofilm interrotti che le cellule planctoniche, diluendo in serie e piastrata su agar selettivo come segue:
    Pseudomonas agar selettivo integrato con glicerolo all'1% e integratore CN per l'enumerazione di P. aeruginosa
    Agar sale di mannitolo per l'enumerazione di S. aureus|
    Lievito Peptone Destrosio agar integrato con penicillina (250 U/mL), streptomicina (250 μg/mL), gentamicina solfato (30 μg/mL) e vancomicina (3 μg/mL) per l'enumerazione di C. albicans.
    NOTA: L'intero contenuto dei pozzetti è enumerato a causa delle sfide di separazione del biofilm aggregato fluttuante dalle cellule planctoniche. Tuttavia, questo approccio riflette in modo più accurato le condizioni presenti nel polmone della fibrosi cistica. Dopo l'incubazione può essere presente della condensa sul coperchio. Per garantire l'assenza di contaminazione tra i pozzetti, posizionare i controlli sterili su agar selettivo.
  6. Dopo la placcatura a punti sull'agar selettivo, incubare le piastre per 24 ore a 37 °C prima del conteggio.

5. Preparazione di biofilm per l'estrazione dell'RNA

NOTA: Tutti i passaggi da questo punto in poi sono per biofilm destinati solo all'analisi RT-qPCR.

  1. Rimuovere la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti contenente i biofilm dall'incubatore a 37 °C e trasferirli in una provetta per microcentrifuga da 1 mL. Durante il trasferimento, assicurarsi che le repliche del biofilm siano raggruppate per ogni ripetizione biologica eseguita. Ciò garantisce che ci sia abbastanza biomassa per l'estrazione dell'RNA.
  2. Centrifugare le provette da 1,5 mL contenenti i biofilm a 16.000 x g per 5 minuti. Se si esegue l'estrazione dell'RNA lo stesso giorno, procedere al passaggio 6.2.1. Se l'estrazione dell'RNA non viene eseguita lo stesso giorno, rimuovere il surnatante e conservare il pellet in 250 μL di soluzione di stabilizzazione dell'RNA a -20 °C. Questa soluzione è stata utilizzata per conservare pellet batterici in diversi studi22,23.

6. Estrazione dell'RNA

  1. Estrarre biofilm di RNA batterico monospecie e multispecie utilizzando un kit commerciale. Preparare i tamponi come indicato nelle linee guida del produttore.
  2. Rimuovere il surnatante del terreno di coltura ed eliminarlo. Se il pellet è stato conservato in una soluzione stabilizzante, scongelarlo a temperatura ambiente e centrifugare a 16.000 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet in 600 μL di reagente per l'estrazione dell'RNA, quindi disinnescarlo manualmente utilizzando un ago da 0,2 mm collegato a una siringa da 2 mL (aspirare 5x-10x o fino a quando il pellet non è completamente distrutto).
  3. Eseguire le fasi di purificazione dell'RNA come indicato nelle linee guida del produttore.
  4. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettroscopio UV, un kit di analisi RNA BR e provette. I limiti rilevabili dell'RNA utilizzando il kit del saggio sono 10 - 1200 ng/μL, quindi la resa minima accettabile di RNA per questo protocollo è di 10 ng/μL.
    1. Impostare il numero richiesto di provette per campioni e standard (sono necessari 2 standard).
    2. Preparare la soluzione di lavoro aggiungendo 199 μL di tampone e 1 μL di reagente per numero di campioni (+ 2 standard e 2 per errore).
    3. Aggiungere 190 μl di soluzione di lavoro e 10 μl di Standard 1 e Standard 2 in provette separate.
    4. Aggiungere 199 μL di soluzione di lavoro e 1 μL di campione di RNA in provette separate. Agitare per 30 s e poi conservare in un luogo buio per 5 min.
    5. Sul fluorimetro, selezionare RNA > Broad range RNA e seguire le istruzioni.
    6. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro. Inserire lo spettrofotometro pipettando 1 μL di acqua priva di DNasi/RNasi sullo spettrofotometro. Asciugare l'acqua con un panno privo di lanugine e impostare il rapporto di assorbanza su 260/280 nM. Pipettare 1 μL di RNA sullo spettrofotometro. Se l'RNA è puro, si osserverà un singolo picco tra 260 e 280 nM e verrà mostrato un rapporto di ~ 2,0.
  5. Converti l'RNA estratto in DNA complementare (cDNA) utilizzando un kit di sintesi del cDNA. Per tutti i campioni di RNA superiori a 50 ng/μL, diluire prima a 50 ng/μL utilizzando acqua priva di DNasi/RNasi.
    1. Utilizzando le provette, preparare la miscela di reazione del cDNA secondo la Tabella 1.
    2. Posizionare le provette in un termociclatore utilizzando le seguenti condizioni: 25 °C per 5 minuti, 42 °C per 30 minuti, 85 °C per 5 minuti. Utilizzare immediatamente il cDNA o conservarlo congelato a -20 °C.

7. qPCR

  1. Eseguire la qPCR utilizzando una qPCR Master Mix. Utilizzare i seguenti primer algD e gene housekeeping (16S) (Tabella 2).
    NOTA: I primer sono stati progettati utilizzando lo strumento online NCBI-primer Blast con riferimento all'intera sequenza del genoma di P. aeruginosa, e poi sintetizzati attraverso un fornitore commerciale. I primer sono stati convalidati per la specificità nei biofilm polimicrobici attraverso la corrispondenza delle sequenze utilizzando lo strumento NCBI-primer Blast.
  2. Diluire i primer a 4 μM (4 pm/μL) diluendo 20 μL di primer in 480 μL di acqua priva di DNasi/RNasi. Questi possono essere congelati per molteplici usi.
  3. Preparare la soluzione di lavoro della master mix qPCR secondo le istruzioni riportate nella Tabella 3.
    NOTA: La soluzione di lavoro algD contiene una soluzione sufficiente per 3 ripetizioni biologiche e 3 ripetizioni tecniche per concentrazione di meropenem, 6 controlli negativi e 2 volte errore. Le soluzioni di lavoro 16S contengono una soluzione sufficiente per 2x standard di concentrazione di RNA nota e 2x errore.
  4. Aggiungere 18 μl di soluzione di lavoro algD alle provette di reazione qPCR appropriate. Ciò includerà un totale di 36 provette per l'analisi dell'espressione algD e 6 provette per i controlli negativi.
  5. Aggiungere 2 μL di RNA a ciascuna delle provette di reazione qPCR o 2 μL di DNasi/Acqua senza RNasi ai controlli negativi.
  6. Aggiungere 18 μl di soluzione di lavoro 16S alle provette di reazione qPCR appropriate. Ciò includerà un totale di 2 tubi. Aggiungere 2 μL di RNA di concentrazione nota alle provette di reazione qPCR.
  7. Eseguire la qPCR secondo le seguenti condizioni: 2 min a 95 °C, 15 s a 95 °C (40 cicli), 1 min a 60 °C.
  8. Analizza i risultati della qPCR utilizzando il metodo 2-ΔΔCt, come descritto in precedenza24. Quando si analizza l'espressione di algD, utilizzare l'espressione di algD a 0 μg/mL come controllo per le rispettive composizioni di biofilm e considerare l'espressione del fold change rilevante per le colture non trattate

Risultati

I risultati mostrati nella Figura 1A evidenziano la resistenza dei biofilm monocellulari di Pseudomonas al trattamento con meropenem, poiché non è stata osservata alcuna diminuzione significativa a nessuna delle concentrazioni testate. Il controllo negativo, non esposto al meropenem, ha mostrato un recupero di 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL, mentre la riduzione maggiore di cellule vitali si è verificata a 16 µg/mL, con un recupero di 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL. Tuttavia, questo livello di resistenza è atteso, poiché la letteratura riporta che i biofilm di P. aeruginosa sono molto più resistenti al meropenem rispetto alle loro controparti planctoniche, richiedendo una concentrazione >256 µg/mL per essere battericida nei confronti dei biofilm25,26, rispetto alle cellule planctoniche, che presentano una MIC di 2 µg/mL.

Figura 1B mostra la riduzione percentuale media dell'attività metabolica dei biofilm monocellulari di P. aeruginosa a ciascuna concentrazione di antibiotico, rispetto al biofilm di controllo, non esposto a meropenem. Una riduzione della fluorescenza corrisponde a una minore attività metabolica, considerata un indicatore di riduzione delle cellule vitali. Le colture trattate con meropenem hanno mostrato un aumento dell'attività metabolica (indicato da una riduzione percentuale negativa), suggerendo l'assenza (o una limitatissima) attività battericida.

L'aumentata attività metabolica senza un corrispondente incremento nel recupero di UFC potrebbe indicare la risposta metabolica dei batteri all'esposizione all'antibiotico. Tra i biofilm monospecifici e quelli polispecifici (Figura 2), la crescita complessiva di P. aeruginosa differiva solo leggermente, con il recupero di cellule vitali dal biofilm monospecifico che risultava essere 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL più alto rispetto a quello osservato nel biofilm polimicrobico in assenza di antibiotico. S. aureus è stato recuperato dal biofilm polimicrobico a 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL, mentre C. albicans è stato recuperato a 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL. C. albicans, tuttavia, è presente soltanto dove non è stata aggiunta meropenem e non è stato recuperato in alcun biofilm a cui era stato somministrato l'antibiotico. Poiché la meropenem non ha alcun effetto diretto su Candida, come dimostrato in precedenti saggi di MIC condotti in laboratorio su colture pure di C. albicans, nei quali il valore di MIC della meropenem era >256 µg/mL, è probabile che sia la risposta allo stress batterico delle altre specie conviventi, S. aureus e P. aeruginosa, all'esposizione all'antibiotico a creare condizioni sfavorevoli per il fungo.

Poiché i biofilm di P. aeruginosa, sia in coltura pura che in presenza di patogeni co-colonizzanti, non mostrano una riduzione nel recupero di cellule vitali anche in concentrazioni di meropenem fino a 256 µg/mL, ciò evidenzia la necessità di terapie alternative, come le terapie anti-virulenza, per combattere queste infezioni croniche in ambito clinico, che potrebbero agire in sinergia con gli antimicrobici per ridurre efficacemente il carico batterico.

algD espressione in P. aeruginosa Biofilm a specie singola di PAO1
L'espressione di algD in P. aeruginosa PAO1 esposto a diverse concentrazioni di meropenem (1, 16 e 256 µg/mL) coltivati in SCFM2 è stata valutata mediante RT-qPCR con SYBR-Green. L'espressione è stata quindi analizzata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt, con 16S utilizzato come gene di controllo (Figura 3). L'espressione di algD non ha mostrato differenze significative tra le concentrazioni di meropenem utilizzate, suggerendo che, quando cresciuto come biofilm a singola specie, PAO1 algD l'espressione non è fortemente influenzata dalla presenza di meropenem.

algD espressione in biofilm multispécie di P. aeruginosa PAO1
L'espressione di algD è stata inoltre valutata in P. aeruginosa PAO1 coltivato in biofilm costituiti da S. aureus SH100 e C. albicans CAF2.1, per verificare se la presenza di organismi co-colonizzanti influenzasse l'espressione di algD o la risposta al meropenem in PAO1. Nessuna differenza significativa nell'espressione di algD è stata osservata tra 0-16 µg/mL di esposizione al meropenem. Tuttavia, a 256 µg/mL, l'espressione di algD è risultata significativamente più elevata rispetto alle altre concentrazioni di antibiotico (0 µg/mL versus 256 µg/mL p = 0.0075, 1 µg/mL versus 256 µg/mL p = 0.035, 16 µg/mL versus 256 µg/mL p = 0.0048), con un aumento di circa 7 volte rispetto alla condizione di controllo (Figura 4). Questo evidenzia che, quando cresce in presenza di S. aureus e C. albicans, si verifica un aumento dell'espressione di algD alla concentrazione più elevata di meropenem, rispetto alla crescita di P. aeruginosa in monocultura, suggerendo un incremento della produzione di alginato in contesto polimicrobico. Nonostante siano state osservate differenze nell'espressione di algD tra biofilm mono e multispécie, non è chiaro se questo aumento sia determinato dalla presenza di una specie specifica (S. aureus o C. albicans) o se siano le interazioni tra entrambi i microrganismi a indurre tale variazione nell'espressione genica.

Questi risultati evidenziano l'importanza di comprendere l'impatto dei trattamenti terapeutici e dell'ambiente sull'espressione genica, in particolare nel contesto dei futuri test di terapie mirate alla virulenza.

Grafici a barre dell'inibizione della crescita batterica per P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans in funzione della concentrazione.
Figura 1: Biofilm monocellulari costituiti da Pseudomonas aeruginosa PAO1. I biofilm sono stati coltivati per 24 h in SCFM2, trattati con 50 µg/mL di DNasi I per 1 h e successivamente trattati con meropenem a diverse concentrazioni per ulteriori 24 h. (A) Valore medio di Log10CFU/mL. La linea tratteggiata indica una riduzione di 2 log (equivalente a una riduzione del 99 %) nel recupero di P. aeruginosa rispetto al controllo negativo. (B) Percentuale di riduzione delle unità di fluorescenza relative. La linea tratteggiata indica una riduzione del 50% della fluorescenza, il primo punto al di sopra del quale è considerato il valore di MIC50. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Concentrazione di meropenem rispetto alla crescita batterica (A) e riduzione della fluorescenza (B) nei grafici.
Figura 2: Biofilm multi-specie costituiti da Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 e Candida albicans CAF2.1. I biofilm sono stati coltivati per 24 h in SCFM2, trattati con 50 µg/mL di DNasi I per 1 h e successivamente trattati con meropenem a diverse concentrazioni per ulteriori 24 h. La linea tratteggiata indica una riduzione di 2 log (equivalente a una riduzione del 99 %) nel recupero di P. aeruginosa rispetto al controllo negativo. La significatività è stata determinata mediante ANOVA a due vie, dove **** p < 0,0001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre dell'espressione relativa rispetto alla concentrazione (µg/ml), che mostra il risultato dell'analisi statistica (ns).
Figura 3: Espressione di algD estratta da un singolo ceppo costituito da P. aeruginosa PAO1. I biofilm sono stati coltivati per 24 h in SCFM2, trattati con 50 µg/mL di DNase I per 1 h ed esposti a diverse concentrazioni di meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL). L'espressione genica è stata analizzata mediante il metodo 2-ΔΔCt. Nel calcolo è stato utilizzato il gene di controllo 16S. La significatività è stata determinata tramite il test di confronto multiplo di Tukey. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre dell'espressione relativa rispetto alla concentrazione; significatività statistica; analisi dell'espressione genica.
Figura 4: Espressione di algD estratta da biofilm multi-specie costituiti da P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 e C. albicans CAF2.1. I biofilm sono stati coltivati in SCFM2, trattati con 50 µg/mL di DNasi I per 1 h e successivamente trattati con meropenem a diverse concentrazioni (0, 1, 16, 256 µg/mL) per ulteriori 24 h. L'espressione genica è stata analizzata mediante il metodo 2-ΔΔCt. Nel calcolo è stato utilizzato il gene di controllo 16S. **p < 0,01 determinato mediante il test di confronto multiplo di Tukey. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Volume per reazione di cDNA (μL)
5X iscript Reaction mix4
iscript Reverse Transcriptase1
Acqua priva di DNasi/RNasi14
2,5 ng di RNA1
Volume totale della reazione20

Tabella 1: Soluzioni di lavoro del master mix per cDNA. Componenti e volumi necessari per ogni reazione di sintesi del cDNA.

GenePrimer direttoPrimer inverso
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

Tabella 2: algD e 16S primers qPCR forward e reverse

Volume per reazione (µL)Volume operativo di algD (µL)Volume operativo di 16S (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
Primer diretto1444
Primer inverso1444
Acqua priva di DNasi/RNasi626424
Totale 1879272

Tabella 3: Soluzioni di lavoro del master mix per qPCR. Componenti e volumi necessari per le soluzioni di master mix per qPCR di algD e 16S.

Figura supplementare 1: Biofilm multispécie costituiti da Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 e Candida albicans CAF2.1. I biofilm sono stati coltivati per 24 h (n = 3) in SCFM2, trattati con 50 µg/mL di DNasi I per 1 h e successivamente trattati con meropenem a diverse concentrazioni per ulteriori 24 h. La linea tratteggiata indica una riduzione di 2 log (equivalente a una riduzione del 99%) nel recupero di P. aeruginosa rispetto al controllo negativo. L'analisi statistica è stata eseguita mediante ANOVA a due vie. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001. Cliccare qui per scaricare questa figura.

Discussione

Questi risultati mostrano che, nonostante il suo uso frequente nella gestione delle esacerbazioni polmonari nelle persone con FC, il meropenem non ha influenzato significativamente la crescita di P. aeruginosa nel modello di biofilm monospecie o multispecie. Un leggero aumento del recupero di P. aeruginosa è stato osservato in entrambi i modelli dopo il trattamento con 128 μg/mL e 256 μg/mL di meropenem, come osservato anche per S. aureus nel biofilm multispecie; Tuttavia, questi aumenti sono stati insignificanti. La diminuzione di C. albicans quando sottoposto a meropenem può essere dovuta a condizioni ostili per il fungo creato dai batteri in risposta allo stress dell'antimicrobico. Non sono state osservate differenze significative nell'espressione di algD tra le concentrazioni di meropenem quando P. aeruginosa è stata coltivata come biofilm di una singola specie. Tuttavia, l'espressione di algD era significativamente più alta nei biofilm multispecie quando trattati con 256 μg/mL di meropenem, suggerendo che la produzione di alginato potrebbe essere aumentata in queste condizioni. Le differenze nell'espressione di algD osservate tra le composizioni del biofilm e le concentrazioni di meropenem mostrano come la presenza di fattori rilevanti possa influenzare l'espressione genica rilevante per l'infezione e sottolineano l'importanza di considerare l'uso di antimicrobici e lo stato di infezione polimicrobica quando si sviluppano e si testano alternative antibiotiche.

Nonostante l'utilità dei modelli, ci sono diverse considerazioni per garantire un'applicazione di successo. L'insediamento di S. aureus e C. albicans all'interno dei biofilm è essenziale prima dell'infezione da P. aeruginosa, a causa dei rischi che S. aureus e C. albicans vengano superati dai Gram negativi. In questo modello di biofilm, C. albicans sembra essere un partner scarso a causa dei suoi tassi di sopravvivenza significativamente più bassi rispetto a S. aureus e P. aeruginosa, anche in assenza di antibiotici. Ciò suggerisce che il lievito è superato in competizione per le risorse o è influenzato negativamente dalle interazioni interspecie all'interno del biofilm27,28. L'assenza di C. albicans in presenza di meropenem, nonostante l'antibiotico non abbia attività antifungina diretta, supporta l'idea che la risposta allo stress di S. aureus al meropenem possa creare un ambiente inospitale per C. albicans29,30. Tuttavia, è importante notare che la scelta del ceppo può avere un effetto sulla quantità di C. albicans che può essere recuperata dal modello di biofilm polimicrobico. Tendenze diverse si osservano quando si utilizza P. aeruginosa LESB58 invece di PAO1 (Figura supplementare 1). Con LESB58, C. albicans è recuperabile a tutte le concentrazioni di meropenem e mostra effettivamente un leggero aumento man mano che la concentrazione di P. aeruginosa diminuisce a causa dell'antimicrobico, consentendo alla composizione della comunità di cambiare. Tuttavia, nonostante queste differenze, PAO1 viene utilizzato in questo modello perché è un ceppo di riferimento di laboratorio, che fornisce una linea di base coerente e ben caratterizzata per gli studi comparativi. Questa coerenza è fondamentale per la riproducibilità e per trarre conclusioni affidabili sulle interazioni all'interno del biofilm.

Può essere difficile estrarre elevate quantità di RNA dai batteri cresciuti in SCFM2, a causa della natura viscosa del terreno. Pertanto, la rottura del biofilm con aghi da 0,2 mm prima dell'estrazione dell'RNA è un passo importante per aumentare la resa dell'RNA e garantire l'estrazione di concentrazioni sufficienti (≥10 ng/μL) per la RT-qPCR. L'RNA è altamente suscettibile alla degradazione31, quindi dopo l'estrazione, assicurarsi che tutte le attività a valle che utilizzano l'RNA vengano eseguite su ghiaccio. Il regolare congelamento-scongelamento di RNA, cDNA e primer qPCR può aumentare la probabilità di degradazione del prodotto. Pertanto, dovrebbe essere limitato il più possibile. Un'altra sfida comune nell'applicazione di questi modelli è il rischio di contaminazione durante l'estrazione dell'RNA o il test qPCR. Questo rischio può essere ridotto al minimo spruzzando l'attrezzatura con una soluzione di degradazione del DNA prima dell'estrazione dell'RNA e utilizzando puntali per pipette privi di DNasi/RNasi durante tutta la procedura. La sostituzione regolare di acqua priva di DNasi/RNasi contribuirà anche a ridurre il rischio di contaminazione all'interno del test qPCR.

Questo protocollo ha scelto di concentrarsi sull'algD come gene di interesse a causa della sua necessità nella produzione di alginato, che è descritto come un fattore chiave di virulenza di P. aeruginosa durante le infezioni acute e croniche32. Pertanto, l'alginato è sempre più studiato come bersaglio per le terapie anti-virulenza33,34. Sebbene questo modello sia stato utilizzato per valutare l'espressione di algD, può essere applicato per valutare l'espressione di altri geni di P. aeruginosa per diversi bersagli farmacologici anti-virulenza. Il meropenem è stato utilizzato in questo studio a causa di prove che suggeriscono che l'antibiotico influenza l'espressione dei geni della biosintesi dell'alginato, in particolare quando P. aeruginosa viene coltivato in presenza di C. albicans35. Inoltre, il meropenem è spesso prescritto clinicamente per trattare e gestire le infezioni respiratorie da P. aeruginosa, evidenziando il suo impiego rilevante all'interno di questo modello36. Tuttavia, con questi modelli è possibile anche l'aggiunta di diversi antibiotici, o addirittura un doppio trattamento. L'incorporazione di antibiotici all'interno di questo modello consentirebbe anche di utilizzare questo modello per studiare i cambiamenti evolutivi nei meccanismi di resistenza batterica, come lo sviluppo di resistenza mediata da porine da parte di P. aeruginosa ai carbapenemi37. Questo modello di biofilm polimicrobico potrebbe essere adattato per includere altre specie rilevanti, ad esempio batteri commensali come Rothia sp. e Streptococcus sp. o sostituito con altri microbi che causano infezioni come Aspergillus sp. per riflettere i requisiti del farmaco candidato in esame.

I modelli di biofilm polimicrobico che imitano il polmone FC sono stati sviluppati in precedenza38. Il modello qui descritto si basa su lavori precedenti al fine di aumentare la produttività utilizzando una configurazione adatta a colture microbiche di piccolo volume. Questo è vantaggioso per testare nuovi composti in cui il materiale disponibile può essere limitato. Poiché il modello è statico e su piccola scala, è possibile far crescere i biofilm in diverse disponibilità di ossigeno per riflettere più da vicino l'ambiente microaerofilo nei polmoni39,40. Per facilitare la riproducibilità e per motivi di costo-efficacia, i biofilm riportati in questo studio sono stati coltivati aerobicamente.

Nonostante le preziose informazioni ottenute da questo studio, è necessario riconoscere diversi limiti. In primo luogo, l'assenza di cellule ospiti ne limita l'utilità per lo studio dei fattori di virulenza che hanno un bersaglio cellulare diretto nei mammiferi. Questo delinea le sfide legate alla creazione di modelli in vitro adatti allo studio dei fattori di virulenza e sottolinea la necessità di un ulteriore sviluppo di modelli che replichino l'ambiente ostile delle infezioni croniche. Inoltre, sebbene considerato un fattore di virulenza, l'alginato è una caratteristica chiave dei biofilm ed è prodotto da P. aeruginosa sia in laboratorio che nell'ambiente. L'utilizzo di modelli in vitro per studiare gli agenti antibiofilm può essere meno impegnativo rispetto all'utilizzo dei modelli per studiare altre terapie anti-virulenza, come gli agenti anti-esotossina, in cui il bersaglio ha un'azione diretta sulle cellule eucariotiche41.

Sebbene la scelta del ceppo di PAO1 di P. aeruginosa sia adatta per la riproducibilità e la standardizzazione del modello in vitro , potrebbe essere auspicabile includere isolati da infezione cronica. La sperimentazione futura con questo modello con un ceppo isolato da campioni di pazienti deve essere condotta per osservare l'effetto degli antimicrobici su ceppi adattati alla nicchia respiratoria.

L'uso di SCFM2 come imitatore dell'espettorato in questo modello in vitro consente un'osservazione standardizzata e replicabile dei cambiamenti comportamentali di biofilm aggregati coltivati in un ambiente rilevante per le vie aeree durante il corso del trattamento antibiotico. SCFM2 è stato scelto rispetto alla versione originale di SCFM a causa dell'inclusione di DNA extracellulare (eDNA) e mucina, che sono fattori importanti nel supportare la formazione di biofilm. Tuttavia, è importante notare che sono disponibili anche altre varianti dell'espettorato medio, come SCFM3, che contiene acido p-aminobenzoico, NAD+, adenina, guanina, xantina e ipoxantina42, e SCFM4, che è una versione carente di ferro. Inoltre, l'uso di terreni sintetici per l'espettorato, come il mezzo polmonare per fibrosi cistica (CFLM) e il mezzo per fibrosi cistica sinusale (CFSM), sviluppati da Ruhluel e colleghi43, consentirebbe la compartimentazione delle vie aeree per visualizzare il comportamento e l'effetto delle terapie anti-virulenza sui biofilm polimicrobici in diversi ambienti.

Sebbene l'AlgD sia un enzima chiave nella via biosintetica dell'alginato, il suo livello di espressione da solo non deve essere considerato un'indicazione della produzione di alginato. Altri fattori, come le modifiche post-trascrizionali e post-traduzionali, nonché i meccanismi regolatori, possono influenzare la quantità di alginato prodotta, portando a una riduzione della formazione di biofilm, a una maggiore suscettibilità allo stress ambientale e a una maggiore sensibilità agli antibiotici in cui la produzione di alginato è ridotta12,14. Esistono diverse terapie anti-virulenza in fase di sviluppo che hanno come bersaglio la proteina dell'alginato per le quali questo modello non sarebbe appropriato per determinarne l'efficacia e per le quali sarebbe più vantaggioso misurare direttamente la produzione di alginato o una lettura funzionale44. Inoltre, alcune terapie anti-virulenza possono mirare a diversi stadi della biosintesi o della regolazione dell'alginato, quindi la misurazione della produzione di alginato cattura direttamente l'effetto netto della terapia sul fattore di virulenza44. Tuttavia, molte delle terapie anti-virulenza negli studi attuali hanno come bersaglio geni chiave dell'alginato e modelli di espressione genica come questi sarebbero appropriati per studiare gli effetti di tali terapie13,14. Tecniche come questa possono anche essere facilmente adattate per lo screening ad alto rendimento, consentendo la valutazione rapida di più campioni o condizioni, il che è vantaggioso negli studi su larga scala che coinvolgono lo screening iniziale di potenziali composti anti-virulenza.

Nel complesso, i modelli di biofilm monospecie e multispecie rappresentano strumenti preziosi per studiare l'espressione di geni rilevanti per l'infezione di P. aeruginosa in condizioni appropriate per la fibrosi cistica. L'introduzione su larga scala della terapia modulante ha rivoluzionato il panorama dell'assistenza sanitaria per la fibrosi cistica. Tuttavia, nonostante la serie di benefici clinici dei modulatori della FC, gli studi hanno dimostrato che le linee clonali di Pseudomonas sono ancorain circolazione, evidenziando che sono ancora necessarie nuove terapie per gestire le infezioni polmonari da P. aeruginosa 45,46. Nonostante le limitazioni discusse, l'applicazione di questi modelli potrebbe essere utile nella fase di scoperta della pipeline di sviluppo dei farmaci per valutare l'efficacia dei composti all'interno della nicchia polmonare FC e le interazioni di nuovi composti anti-virulenza con antibiotici noti in questo ambiente.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

HL, DN e JF hanno ricevuto un sostegno finanziario per il Centro di Ricerca Strategica (SRC) Un quadro preclinico basato sull'evidenza per lo sviluppo di terapie antimicrobiche nella fibrosi cistica (PIPE-CF; Progetto n. SRC 022) del Cystic Fibrosis Trust del Regno Unito e della Cystic Fibrosis Foundation degli Stati Uniti. TH è supportato da una borsa di studio di dottorato MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership. Ringraziamo il CF Trust e la CF Foundation (SRC022) e lo schema MRC DiMEN DTP per il finanziamento

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Membrana di tenuta traspirante per piastre multipozzetto Sigma Aldrich 
bruciatore
Cellulasi (100 mg/mL)Cambridge Bioscience Integratore di HY-B2220-5g
CN Sigma Aldrich 1.07624
Kit Miniprep RNA Direct-zolZymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
Acqua priva di DNasi/RNASIVWRJ60610.
Gentamycin solfato (30 µ g/mL)Sigma Aldrich G3632
Glicerolo (1 %)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6101
Kit di sintesi iScript Cdna Bio-Rad1708890
Penicillina (250 U/mL)Forniture da laboratorio scientificheP3032-10MU
Qubit 4 FluorimetroThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Assay Kit Thermo Fisher ScientificQ10210
Provette QubitThermo Fisher ScientificQ32856
Soluzione di resazurina (0,02 %)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Streptomicina (250 µ g/mL)Sigma Aldrich S9137
Termociclatore (abbiamo usato il termociclatore T100)Biorad1861096
Reagente TRIzol Invitrogen15596026
vancomicina (3 µ g/mL)Sigma Aldrich 
Z763624BunsenXC1709007

Riferimenti

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