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Articolo metodologico

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

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DOI:

10.3791/67479

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7 febbraio 2025

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1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

In questo articolo

Sommario

Qui, proponiamo un semplice protocollo che combina l'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici, la chimica dei clic e la microscopia ad espansione che consente il bioimaging di N-glicoproteine sialilate intracellulari con una migliore risoluzione utilizzando apparecchiature di microscopia di routine.

Abstract

Le tecniche di marcatura metabolica consentono l'incorporazione di reporter bioortogonali nei glicani, consentendo la bioconiugazione mirata di coloranti molecolari all'interno delle cellule attraverso la chimica a clic e bioortogonale. L'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici (MOE) ha suscitato un notevole interesse a causa del ruolo essenziale della glicosilazione in numerosi processi biologici che coinvolgono il riconoscimento molecolare e il suo impatto su patologie che vanno dal cancro alle malattie genetiche alle infezioni virali e batteriche.

Sebbene la MOE sia meglio conosciuta per la rilevazione di glicoconiugati di superficie cellulare, è anche una metodologia molto importante per lo studio dei glicani intracellulari in contesti fisiologici e patologici. Tali studi traggono grande beneficio dall'alta risoluzione spaziale. Tuttavia, la microscopia a super-risoluzione non è prontamente disponibile nella maggior parte dei laboratori e pone sfide per l'implementazione quotidiana. La microscopia ad espansione è un'alternativa recente che migliora la risoluzione della microscopia ingrandendo fisicamente i campioni biologici marcati con marcatori fluorescenti. Incorporando il campione in un gel rigonfiabile e provocandone l'espansione isotropica attraverso un trattamento chimico, le strutture subcellulari possono essere visualizzate con maggiore precisione e risoluzione senza la necessità di tecniche di super-risoluzione.

In questo lavoro, illustriamo la capacità della microscopia ad espansione di visualizzare glicani sialilati intracellulari attraverso l'uso combinato di MOE e click chemistry. In particolare, proponiamo una procedura per la marcatura bioortogonale e la microscopia ad espansione che impiega un reporter mirato alla sialilazione, che può essere associata all'immunofluorescenza per studi di co-localizzazione. Questo protocollo consente studi di localizzazione della biosintesi del sialoconiugato, del traffico intracellulare e del riciclaggio.

Introduzione

La microscopia a fluorescenza, sebbene ampiamente utilizzata per l'etichettatura e la visualizzazione di molecole specifiche all'interno delle cellule, è intrinsecamente limitata nella risoluzione dal limite di diffrazione di Abbe della luce1, che limita la capacità di distinguere tra oggetti più vicini di circa 200-250 nm. Questa limitazione deriva dalla natura ondulatoria della luce e dall'apertura numerica della lente dell'obiettivo del microscopio, introducendo una sfida nell'imaging delle strutture subcellulari. Il superamento di queste limitazioni fornisce una migliore comprensione di alcuni processi biologici su scala nanometrica.

Per superare il limite di diffrazione della luce, sono state sviluppate tecniche di microscopia a super-risoluzione come STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) e STED (Stimulated Emission Depletion) 2,3. STORM si basa sull'attivazione stocastica dei fluorofori, consentendo di visualizzare solo un sottoinsieme sparso in un dato momento. Ciò consente la localizzazione precisa dei singoli fluorofori, che consente la ricostruzione di un'immagine ad alta risoluzione. STED, d'altra parte, migliora la risoluzione utilizzando un laser di deplezione per estinguere selettivamente la fluorescenza attorno alla periferia del punto di eccitazione, restringendo efficacemente la funzione di diffusione del punto.

Questi approcci contrastano con la microscopia a campo largo o confocale, in cui tutti i fluorofori vengono rilevati simultaneamente, ottenendo un'immagine che combina tutti i modelli di diffrazione e impedisce la distinzione tra singoli fluorofori vicini, portando a una perdita di risoluzione. Tuttavia, questi metodi di super-risoluzione richiedono sorgenti luminose, apparecchiature, preparazione dei campioni e/o fluorofori molto specifici, rendendo queste tecnologie costose, di difficile accesso nella maggior parte dei laboratori e difficili da implementare negli esperimenti di routine. Questi vincoli hanno portato la comunità scientifica a cercare soluzioni alternative per ottenere una risoluzione più elevata, che fossero compatibili con le apparecchiature di microscopia prontamente disponibili e i protocolli di colorazione di routine. Nel 2015, Boyden e collaboratori hanno sviluppato un metodo per aggirare i limiti della microscopia ottica espandendo fisicamente il campione, chiamato Expansion Microscopy (ExM)4.

ExM è un metodo in tre fasi che fornisce dettagli su scala nanometrica di campioni biologici senza superare il limite di diffrazione della luce (Figura 1). Invece, utilizza microscopi convenzionali a diffrazione limitata per visualizzare campioni che sono stati fisicamente ingranditi in modo isotropo. La prima fase, chiamata gelificazione, consiste nell'incorporare il campione biologico, tipicamente cellule o tessuti fissati, in un idrogel polielettrolitico rigonfiabile a base di acrilato di sodio e acrilammide. Il campione biologico viene quindi sottoposto a un trattamento enzimatico per degradare parzialmente alcuni componenti come proteine o membrane e abbattere le strutture cellulari dense per garantire che le cellule possano espandersi in modo uniforme. Questa fase, chiamata digestione, aiuta a raggiungere questo obiettivo omogeneizzando i componenti strutturali del campione per quanto riguarda le proprietà meccaniche, prevenendo l'espansione differenziale che potrebbe portare alla distorsione del campione. Infine, nell'ultima fase, chiamata espansione, il campione incorporato e digerito in idrogel viene posto in acqua deionizzata, provocandone il rigonfiamento. Questa tecnologia fa sì che il campione si espanda di un fattore di ingrandimento lineare di circa 4-5x in ogni dimensione, consentendo la visualizzazione di dettagli cellulari fini utilizzando tecniche di microscopia standard. Data la natura isotropa dell'espansione, il campione biologico ingrandito all'interno della matrice di gel conserva i suoi dettagli geometrici tridimensionali e le relazioni spaziali tra i suoi vari componenti strutturali. Le informazioni spaziali vengono quindi preservate in caso di rigonfiamento, mentre la distanza tra le etichette fluorescenti ancorate al gel o le biomolecole aumenta uniformemente in tutte le direzioni. Ciò consente una migliore separazione dei segnali, con conseguente maggiore risoluzione.

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Figura 1: Panoramica del protocollo ExM. (a) Gelificazione: il campione biologico è ancorato e incorporato all'interno di un idrogel di polielettrolita rigonfiabile. (b) Digestione: le proprietà meccaniche del campione vengono omogeneizzate attraverso l'uso di enzimi e detergenti, scomponendo le proteine e le membrane lipidiche che altrimenti limiterebbero l'espansione e creerebbero distorsioni. (c) Espansione: l'idrogel viene immerso in acqua deionizzata, provocandone l'espansione isotropica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dal 2015, ExM ha visto significativi miglioramenti tecnologici nella conservazione delle informazioni spaziali. In particolare, sono stati progettati vari ancoranti molecolari per legare covalentemente le biomolecole direttamente all'idrogel rigonfiabile 5,6. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la N-acrilossisuccinimide (NAS), che reagisce con i gruppi amminici liberi delle biomolecole (tipicamente, residui di lisina o posizioni N-terminali delle proteine) per bioconiugare un gruppo acriloil alle proteine della cellula, comprese le glicoproteine. Questo gruppo acriloil reagisce quindi con altri monomeri attraverso reazioni di reticolazione durante la gelificazione, ancorando queste biomolecole direttamente al polimero.

ExM è compatibile con un'ampia gamma di metodi di marcatura, tra cui l'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici (MOE). Il MOE è un potente strumento che consente la marcatura dei glicani incorporando analoghi di precursori metabolici dotati di una maniglia chimica bioortogonale7. Questi analoghi, noti come reporter chimici, si integrano nelle vie metaboliche senza causare tossicità. Nell'approccio MOE, i monosaccaridi reporter vengono trasformati metabolicamente in zuccheri nucleotidici attivati e quindi trasferiti ai glicoconiugati nascenti. Il nostro obiettivo principale è lo studio della sialilazione, in particolare della dinamica intracellulare e del traffico di N-glicoproteine sialilate, che è cruciale nel contesto della salute e della malattia grazie al suo ruolo nelle interazioni cellula-cellula, nella regolazione immunitaria e nello sviluppo. La sialilazione anomala è implicata in malattie come il cancro 8,9,10,11, le malattie infettive 12 e le malattie genetiche 13,14,15, rendendola un obiettivo chiave per lo sviluppo terapeutico e la scoperta di biomarcatori. La comprensione della sialilazione migliora le conoscenze sulla glicobiologia e sui meccanismi delle malattie.

La sialilazione può essere sondata utilizzando MOE con analoghi dell'acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac), l'acido sialico più abbondante nell'uomo, o con analoghi di N-acetilmannosamina (ManNAc), un precursore metabolico di Neu5Ac, con un manico bioortogonale 8,16. ManNAc viene convertito in Neu5Ac nel citosol, quindi attivato in acido citidina-5′-monofosfo-N-neuraminico (CMP-Neu5Ac) nel nucleo. Una volta attivate in uno zucchero nucleotidico, le siloil transferasi nell'apparato di Golgi trasferiscono le unità Neu5Ac alle posizioni terminali delle catene glicaniche in crescita (Figura 2). A seguito dell'incorporazione metabolica di derivati innaturali del ManNAc, i glicani sialilati marcati possono essere legati in modo covalente a un fluoroforo contenente un gruppo reattivo complementare alla maniglia reporter attraverso la chimica a clic bioortogonale. Ciò consente l'osservazione diretta dei glicoconiugati in vivo o ex vivo.

Per la maggior parte dei reporter di monosaccaridi, è necessaria una forma peracetilata per attraversare la membrana plasmatica attraverso la diffusione passiva. Tuttavia, sia i reporter peracetilati che quelli non protetti hanno dimostrato di sondare efficacemente la sialilazione16. I reporter di sialilazione non protetti sono in grado di entrare nelle cellule attraverso meccanismi di trasporto attivi, vale a dire la pinocitosi per gli analoghi di Neu5Ac e un trasportatore non ancora identificato per ManNAc. Mentre gli zuccheri non protetti richiedono una concentrazione più elevata (in genere 100-500 μM) per ottenere effetti comparabili, una volta all'interno della cellula, possono entrare direttamente nella via metabolica dell'acido sialico. Al contrario, gli zuccheri peracetilati devono essere completamente deacetilati da esterasi intracellulari non specifiche prima di diventare metabolicamente attivi. Sebbene possano essere utilizzati a concentrazioni più basse (tipicamente 10-50 μM), la deacetilazione incompleta può interferire con l'attività enzimatica o portare all'incorporazione di analoghi dell'acido sialico parzialmente acetilato, potenzialmente distorcendo l'analisi a valle. Inoltre, il rilascio di acido acetico può influenzare il pH localmente, influenzando potenzialmente la funzione cellulare. Chen e colleghi hanno anche dimostrato che gli zuccheri per-O-acetilati reagiscono con i residui di cisteina libera nelle proteine attraverso un meccanismo non enzimatico, portando all'incorporazione fuori bersaglio e all'aumento del segnale non specifico17,18. Nel presente protocollo, impieghiamo quindi reporter ManNAc non protetti.

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Figura 2: Ingegneria degli oligosaccaridi metabolici e marcatura degli acidi sialici. UDP-GlcNAc è convertito in ManNAc dal dominio UDP-GlcNAc 2-epimerasi di GNE/MNK nel citosol. ManNAc viene quindi fosforilato nel citosol dal dominio ManNAc 6-chinasi di GNE/MNK per formare ManNAc-6-fosfato. La N-acetilneuraminato sintasi catalizza la condensazione di ManNAc-6-P con fosfoenolpiruvato per produrre Neu5Ac-9-fosfato, che viene successivamente defosforilato dalla fosfatasi dell'acido sialico per produrre Neu5Ac. Neu5Ac può anche essere fornito dalla via di salvataggio attraverso l'endocitosi e il riciclo lisosomiale8. Dopo il trasporto al nucleo, viene convertito in CMP-Neu5Ac dalla CMP-sialica acido sintetasi. Nell'apparato di Golgi, CMP-NeuAc è il substrato delle sialiltransferasi che introducono una porzione Neu5Ac nelle posizioni terminali dei glicani sui glicoconiugati in maturazione, che sono infine espressi a livello della membrana cellulare o secreti. I reporter chimici ManNAz dotati di un manico bioortogonale possono penetrare nella cellula attraverso un trasportatore attivo non identificato ed entrare nella via metabolica. Le unità Neu5Az marcate incorporate nei glicani dopo la biosintesi vengono quindi marcate attraverso la coniugazione mediata da CuAAC di una sonda fluorescente. Abbreviazioni: NAc = N-acetile; UDP-GlcNAc = Uridina difosfato N-acetilglucosamina; ManNAc = N-acetilmannosamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerasi; MNK = ManNAc 6-chinasi; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfato; NANS = N-acetilneuraminato sintasi; PEP = fosfoenolpiruvato; Neu5Ac = acido N-acetilneuraminico; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfato; NANP = acido sialico fosfatasi; CMP = citidina-5′-monofosfato; CMAS = acido CMP-sialico sintetasi; STs = sialiltransferasi; ManNAz = N-azidoacetilmannosamina; Neu5Az = acido N-azidoacetilneuraminico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tra le possibili reazioni bioortogonali, abbiamo focalizzato il nostro interesse sulla cicloaddizione azide-alchino catalizzata dal rame (CuAAC)16,19. Secondo la nostra esperienza, il CuAAC è l'opzione migliore per marcare i glicani intracellulari nelle cellule fissate. Questa reazione è ben consolidata, studiata a fondo in chimica bioortogonale ed è stata standardizzata per l'uso in ambienti biologici complessi, fornendo una solida base di conoscenze e protocolli ottimizzati. La sua cinetica veloce offre infatti un'elevata efficienza e specificità di reazione, e coinvolge gruppi azidici e alchini facili da sintetizzare, stabili, assenti dai sistemi viventi e inerti verso le biomolecole native, rendendolo ideale per applicazioni a celle fisse in cui la tossicità del rame non è un problema. La cicloaddizione alchino-azide promossa dal ceppo (SPAAC)20,21, pur evitando la tossicità del rame, ha una cinetica più lenta e sonde più voluminose, che tende a portare a un segnale di fondo più elevato e a una diminuzione del rapporto segnale/rumore per applicazioni intracellulari a causa dell'intrappolamento idrofobico, mentre la domanda di elettroni inversa Diels-Alder (IEDDA)22,23, sebbene veloce e priva di rame, comporta una sintesi di sonde più complessa e richiede gruppi reporter più ingombranti che devono ancora essere completamente caratterizzati nelle applicazioni MOE. Poiché ExM richiede esclusivamente celle fisse, CuAAC offre una soluzione robusta ed efficiente per la marcatura bioortogonale.

Questo articolo presenta un protocollo per la visualizzazione delle glicoproteine sialilate intracellulari nelle cellule, combinando la marcatura metabolica, la chimica del clic bioortogonale e la microscopia ad espansione. Nelle procedure sperimentali descritte in questo articolo, utilizziamo la N-azidoacetilmannosamina (ManNAz) come reporter chimico e la legatura CuAAC di piccoli fluorofori organici viene eseguita prima della procedura di espansione. Le glicoproteine sono ancorate all'idrogel con NAS prima della gelificazione, della digestione e dell'espansione. La marcatura MOE degli acidi sialici può essere associata ad approcci di immunofluorescenza per la valutazione della co-localizzazione, come esemplificato qui con un anticorpo primario di topo anti-GM130 localizzato nell'apparato cis-Golgi. Questo protocollo può essere applicato alle cellule nel loro stato fisiologico o alle cellule che sono state sottoposte a trattamento chimico. Per illustrare ciò, la clorochina è stata utilizzata per inibire la funzione lisosomiale, che influenza l'elaborazione e il traffico delle glicoproteine all'interno delle cellule. La colorazione nucleare viene utilizzata come punto di riferimento, non solo per localizzare le cellule, ma anche come indicatore della qualità del processo ExM. Il fattore di espansione può infatti essere misurato confrontando le dimensioni del nucleo pre-espansione (preExM) e post-espansione (postExM).

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Protocollo

1. Semina cellulare

NOTA: Eseguire i passaggi successivi in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi linea cellulare utilizzata nel presente lavoro (HeLa, MCF7, fibroblasti primari), o alla maggior parte dei modelli di linee cellulari aderenti comunemente utilizzati nella ricerca 20,24,25.

  1. Far crescere le cellule in terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un pallone T75 a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
  2. Una volta che le cellule hanno raggiunto la piena confluenza, rimuovere il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule con 4 mL di PBS.
    NOTA: Le soluzioni PBS utilizzate in questa fase e in tutte le successive fasi di lavaggio devono essere rese sterili mediante filtrazione attraverso una membrana in PTFE da 0,2 μm prima dell'uso.
  3. Incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C in 2 mL di soluzione 1x tripsina-EDTA contenente 0,5 g/L di tripsina, per liberarle dal fondo del pallone.
  4. Aggiungere 8 mL di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM contenente il 10% di FBS e mescolare accuratamente per assicurarsi che ogni singola cellula sia staccata dal fondo del pallone.
  5. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 200 × g. Nel frattempo, aggiungere un vetrino coprioggetto (diametro 12 mm, spessore 130-160 μm) a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
    NOTA: Lo spessore del vetrino coprioggetti deve essere regolato in base ai requisiti del microscopio utilizzato nelle successive fasi di imaging.
  6. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di coltura cellulare.
  7. Determinare il numero medio di cellule/mL mediante emocitometria in almeno due misurazioni.
  8. Diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di 300.000 cellule per mL nel terreno di coltura cellulare e seminare 1 mL di sospensione in ciascun pozzetto.
  9. Lasciare riposare le cellule per 24 ore in un terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di FBS a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% prima delle fasi successive.

2. Trattamento con clorochina (opzionale)

NOTA: I passaggi 2.1-2.8 illustrano come utilizzare il protocollo su cellule trattate con un reagente esterno (inibitore, effettore, farmaco), utilizzando la clorochina come esempio. Saltare questi passaggi per le cellule non trattate con reagenti esterni.

  1. Pesare la quantità corretta di sale di clorochina difosfato (CQ) per preparare un volume sufficiente di una soluzione madre da 10 mM.
    NOTA: Eseguire i passaggi successivi in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare.
  2. Solubilizzare il CQ solido nella quantità desiderata di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 10 mM.
  3. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm.
  4. Aliquotare 1 mL della soluzione madre da 10 mM in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservarle a -20 °C.
  5. Lavare il campione di cellule preparato al punto 1.9 con 1 mL di PBS.
  6. Aggiungere 100 μL di 10 mM CQ in 9,9 mL di terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di FBS, per una concentrazione finale di 100 μM di CQ.
  7. Incubare le cellule per 8 ore in 1 mL di un terreno integrato con 100 μM di CQ a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
  8. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS.

3. Ingegneria degli oligosaccaridi metabolici

  1. Preparare una soluzione madre da 5 mM di ManNAz (o ManNAc per la condizione di controllo negativo) in un terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di FBS.
    NOTA: Questa soluzione madre deve avere un volume sufficiente in modo che ogni pozzetto possa essere trattato con 1 mL di soluzione analoga allo zucchero. Eseguire le fasi successive in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare.
  2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm e conservare in aliquote da 1 mL a -20 °C fino al momento del bisogno.
  3. Preparare un terreno integrato con 500 μM di ManNAz o ManNAc diluendo un'aliquota di soluzione madre da 1 mL preparata al punto 3.2 con 9 mL di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM contenente il 10% di FBS.
  4. Incubare le cellule preparate nella fase 1.9 (per esperimenti su cellule non trattate) o nella fase 2.8 (per esperimenti su cellule trattate con CQ) in 1 mL di terreno addizionato con 500 μM di ManNAz (o 500 μM di ManNAc per il gruppo di controllo) per 24 ore a 37 °C in atmosfera di CO2 al 5%.

4. Fissazione e permeabilizzazione

NOTA: Tutti questi passaggi vengono eseguiti sotto una cappa aspirante.

  1. Lavare i campioni con 1 mL di PBS.
  2. Fissare le cellule su ciascun vetrino coprioggetti aggiungendo 500 μl di paraformaldeide al 5%. Lasciate riposare per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Lavare 3 volte con 1 mL di PBS.
  4. Preparare una camera umida personalizzata utilizzando una scatola opaca sufficientemente grande (ad esempio, una scatola di polistirolo) con coperchio. Posiziona un pezzo di carta assorbente bagnato sul fondo della scatola, quindi stendici sopra uno strato di parafilm.
    NOTA: La camera umida deve proteggere completamente il campione da fonti di luce esterne quando è chiusa.
  5. Posizionare i vetrini coprioggetti sul parafilm, le cellule rivolte verso l'alto.
    NOTA: Etichettare in anticipo il parafilm con il nome o il riferimento dei campioni.
  6. Eseguire la permeabilizzazione cellulare utilizzando 200 μl di Triton X-100 allo 0,5% (v/v) in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
  7. Lavare 3 volte con 200 μL di PBS.

5. Marcatura a fluorescenza

  1. Marcatura CuAAC di glicani sialilati marcati
    NOTA: Il tampone di reazione CuAAC deve essere preparato di fresco prima dell'uso e i reagenti devono essere aggiunti nell'ordine specificato, con l'ascorbato di sodio aggiunto per ultimo. Nelle soluzioni acquose ossigenate, gli ioni Cu(I) formati dalla riduzione del Cu(II) con ascorbato si riossidano gradualmente a Cu(II), portando ad una diminuzione della concentrazione di ascorbato nel tempo. Per mantenere la riproducibilità dei risultati, il tampone non deve essere conservato per più di qualche giorno a 4 °C e viene utilizzato preferibilmente lo stesso giorno.
    1. Per marcare i glicani sialilati modificati con azide ingegnerizzati nella sezione 3, preparare un tampone di reazione CuAAC costituito da 5 μM di AlexaFluor 488 alchino (AF488Alk), 150 μM di CuSO4, 300 μM 2-(4-((bis((1-(terz-butil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)ammino)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)acido acetico (BTTAA), 0,1 M K2HPO4 e 2,5 mM di ascorbato di sodio in acqua deionizzata. Preparare una soluzione sufficiente per applicare 200 μl su ciascun vetrino coprioggetti.
    2. Aggiungere 200 μl di tampone CuAAC su ciascun vetrino coprioggetti per avviare la reazione. Assicurarsi che il campione sia coperto in modo omogeneo con la goccia e lasciarlo reagire per 45 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    3. Lavare 3 volte con 200 μL di PBS per fermare la reazione e rimuovere la sonda e i reagenti in eccesso.
  2. Colorazione del nucleo
    1. Per la marcatura nucleare con Hoechst 33342, diluire una soluzione madre da 10 mg/mL a 1:2000 in PBS.
      NOTA: Controcoloranti nucleari equivalenti come il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) possono essere utilizzati per lo stesso effetto.
    2. Coprire le cellule con 200 μL di questa soluzione e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    3. Lavare 3 volte con 200 μL di PBS.
  3. Colorazione in immunofluorescenza
    1. Preparare un tampone bloccante l'albumina sierica bovina (BSA) contenente 0,1 g di gelatina, 1 g di BSA, 1 ml di FBS e 49 ml di PBS per 50 ml di tampone.
    2. Incubare i campioni per 1 ora a 4 °C in 200 μL di tampone bloccante BSA. Proteggere il campione dalla luce.
    3. Per la colorazione in immunofluorescenza dell'apparato di Golgi utilizzando un anticorpo di topo purificato anti-GM130 (epitopo riconosciuto: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), diluire l'anticorpo primario a 1:100 nel tampone bloccante BSA preparato.
      NOTA: Questo passaggio può essere adattato alla colorazione in immunofluorescenza mirata ad altri organelli utilizzando qualsiasi anticorpo primario pertinente, nel qual caso il fattore di diluizione deve essere adattato secondo le linee guida del produttore.
    4. Aggiungere 70 μl della soluzione contenente l'anticorpo ai vetrini coprioggetti e incubare per 1 ora a 4 °C, al riparo dalla luce.
    5. Lavare 3 volte con 200 μL di PBS.
    6. Diluire l'anticorpo secondario fluorescente (Alexa Fluor 546 anti-mouse IgG) a 1:600 in tampone bloccante BSA e aggiungere 100 μl su ciascun vetrino coprioggetti.
    7. Incubare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    8. Lavare 3 volte con 200 μL di PBS.
    9. Trasferire i vetrini coprioggetti su una piastra a 6 pozzetti. Conservare i campioni in 2 mL di PBS a 4 °C per alcuni giorni, al riparo dalla luce.
      NOTA: si consiglia di preparare sempre una replica esclusivamente per la visualizzazione preExM come riferimento a scopo di confronto prima e dopo l'espansione e per assicurarsi che il modello di etichettatura non sia stato distorto dopo l'espansione.

6. Imaging pre-espansione dei campioni

NOTA: I seguenti passaggi dipendono dall'apparecchiatura di bioimaging utilizzata e potrebbe essere necessario adattarli ai requisiti della macchina. Si prega di seguire le regole del laboratorio locale o della piattaforma di bioimaging. I passaggi 6.1-6.13 vengono eseguiti su un microscopio confocale a scansione laser.

  1. Accendere il microscopio e assicurarsi che le sorgenti luminose (laser) siano riscaldate. Aprire il software di acquisizione bioimaging.
  2. Selezionare le lunghezze d'onda di eccitazione laser corrispondenti ai fluorofori per creare i canali (ad esempio, 405 nm per la colorazione nucleare, 488 nm per i glicani sialilati marcati con AF488Alk e 546 nm per la marcatura in immunofluorescenza). Attivare i laser di conseguenza.
  3. Posizionare e fissare un vetrino coprioggetti di 32 mm di diametro (spessore 130-170 μm) in un supporto adatto al microscopio.
  4. Posizionare il campione preparato al punto 5.3.9, con le cellule rivolte verso il basso, sul vetrino coprioggetti da 32 mm. Aggiungere una goccia di acqua deionizzata per evitare che il campione si secchi.
  5. Seleziona un obiettivo appropriato, qui un obiettivo a immersione in olio 63x con un'apertura numerica di 1,4 o equivalente.
    NOTA: L'apertura numerica più alta fornisce la migliore risoluzione. Quando si utilizza un obiettivo ad immersione in olio, ricordarsi di aggiungere una goccia d'olio tra l'obiettivo e il vetrino coprioggetti.
  6. Posizionare il supporto sul tavolino del microscopio sopra l'obiettivo.
  7. Utilizzare la modalità di fluorescenza a campo chiaro o a bassa intensità laser per individuare un'area di interesse nel campione.
  8. Imposta la messa a fuoco.
  9. Visualizza le cellule nel software in modalità di fluorescenza dal vivo . Impostare l'intensità del laser per ciascun canale. Inizia con una bassa potenza del laser per evitare il fotosbiancamento. Aumentare lentamente la potenza del laser e regolare il guadagno e l'offset del rivelatore per amplificare il segnale senza introdurre rumore eccessivo come necessario per visualizzare chiaramente la fluorescenza senza sovraesposizione.
    NOTA: I parametri devono essere regolati per ridurre al minimo il rumore di fondo ed evitare la saturazione del segnale. È fondamentale mantenere impostazioni coerenti su tutti i campioni in una serie di esperimenti, compresi i controlli negativi.
  10. Impostare i parametri dell'immagine come la dimensione del foro stenopeico (ad esempio, 1 unità di Airy), la velocità di scansione (ad esempio, 8), il fattore di zoom (ad esempio, 1), l'intervallo di valori di luminosità (ad esempio, 16 bit) e il numero medio (ad esempio, 2), la modalità (ad esempio, la linea) e il metodo (ad esempio, la media) in base alle esigenze per raggiungere l'osservazione desiderata.
    NOTA: Questi valori dipendono dal sistema e dal campione e devono essere ottimizzati prima dell'acquisizione. La dimensione del foro stenopeico dipende dall'apertura numerica, dall'ingrandimento e dalla lunghezza d'onda: diminuirla può migliorare la risoluzione a scapito del rapporto segnale/rumore. Si consiglia di impostare la velocità di scansione su valori elevati (corrispondenti a un tempo di permanenza ridotto per pixel) per evitare il fotosbiancamento.
  11. Eseguire l'acquisizione e salvare i dati nel formato desiderato con i metadati appropriati per riferimento futuro.
  12. Una volta terminata l'acquisizione, rimettere il campione nella piastra a 6 pozzetti aggiungendo una piccola quantità di acqua deionizzata per facilitare il trasferimento con un paio di pinzette.
    NOTA: Il passaggio 6.12 viene eseguito solo se è necessaria l'espansione di questo particolare campione. In caso contrario, eliminare l'esempio e utilizzare altre repliche per i passaggi seguenti.

7. Protocollo di microscopia ad espansione

NOTA: I campioni sono protetti il più possibile dalla luce per evitare il fotosbiancamento. Le fasi di ancoraggio e gelificazione vengono eseguite sotto cappa aspirante.

  1. Ancoraggio
    1. Incubare i campioni con N-acriloilsuccinimide (NAS) a una concentrazione di 3,2 mg/mL in PBS su un agitatore meccanico per 1 ora a temperatura ambiente. Preparare una quantità sufficiente di soluzione per aggiungere 500 μL di soluzione per pozzetto (soluzione madre: 16 mg/mL NAS in DMSO).
      NOTA: La NAS reagisce con i residui di lisina e gli N-terminali delle proteine per innestare un gruppo acriloilico, consentendo alle proteine di ancorarsi all'idrogel nelle fasi successive.
    2. Lavare 3 volte con 1 mL di PBS.
  2. Gelificazione
    1. Preparare una soluzione monomerica composta come segue: in 50 mL di 1x PBS (pH 7,4), aggiungere 5,843 g di NaCl, 1,25 g di acrilammide, 0,075 g di bis-acrilammide e 4,313 g di acrilato di sodio. Preparare una soluzione sufficiente per applicare 70 μl su ciascun vetrino coprioggetti. Congelare 1 mL di aliquote almeno 24 ore prima della gelificazione.
      ATTENZIONE: I monomeri sono tossici; Devono essere maneggiati con cura con adeguati dispositivi di protezione e pesati sotto una cappa aspirante.
    2. Su un pezzo di parafilm, viene posta una goccia di 70 μl di soluzione monomerica, seguita dall'aggiunta di 1,4 μl di 10% (v/v) N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TMEDA), quindi 1,4 μl di persolfato di ammonio (APS) al 10% (p/v), che vengono miscelati nella goccia.
      NOTA: I reagenti reticolanti devono essere aggiunti in questo ordine specifico, prima TMEDA, poi APS.
    3. Posizionare rapidamente il vetrino coprioggetti con cura sulla soluzione con le cellule rivolte verso il basso.
    4. Lasciare polimerizzare la soluzione per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umida.
  3. Digestione
    1. Preparare una soluzione tampone per la digestione composta da 1x tampone TAE, Triton X-100 allo 0,5% (v/v), guanidina HCl 0,8 M e proteinasi K 8 U/mL.
      NOTA: Il tampone di digestione deve essere preparato di fresco e preincubato per 30 minuti a 37 °C prima dell'uso.
    2. Aggiungere 1 mL di tampone di digestione all'idrogel formato al passaggio 7.2. Lasciare procedere la digestione per 3 ore a 37 °C su agitatore meccanico.
    3. Rimuovere il tampone digestivo e lavare delicatamente il gel 3 volte con 2 ml di acqua deionizzata.
      NOTA: L'idrogel si espanderà leggermente e si staccherà dal vetrino coprioggetto.
  4. Espansione
    1. Lasciare espandere l'idrogel in 3 ml di acqua deionizzata per 2 ore. Cambia l'acqua ogni 30 minuti.

8. Imaging post-espansione dei campioni

  1. Posizionare un vetrino coprioggetti di 32 mm di diametro (spessore 130-170 μm) e fissarlo su un supporto.
  2. Ritaglia un pezzo di idrogel e posizionalo sul vetrino coprioggetti, con le cellule sul fondo del gel.
    NOTA: I pezzi asportati devono essere sufficientemente grandi da fornire una superficie adeguata per l'osservazione, ma non troppo grandi, in quanto ciò potrebbe rendere difficile la manipolazione del gel e aumentare il rischio di rottura (dimensioni consigliate: da 5 a 8 mm). Posizionare abbastanza pezzi di idrogel da coprire l'intera superficie del vetrino coprioggetti; Ciò contribuirà a fissare i pezzi in posizione e a prevenire qualsiasi deriva durante l'imaging. In caso di problemi di deriva, il prerivestimento dei vetrini coprioggetti con poli-D-lisina potrebbe rivelarsi vantaggioso6.
  3. Posizionare il supporto sul tavolino del microscopio sopra l'obiettivo.
  4. Eseguire l'acquisizione dell'immagine su un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo a immersione in olio come descritto al punto 6.

9. Calcolo del fattore di espansione (EF) in ImageJ

  1. Aprire i dati di imaging nel freeware ImageJ o equivalente.
  2. Se si lavora su un'immagine di più canali, dividere i canali e lavorare solo sul canale del nucleo navigando su Seleziona immagine | Colore | Canali divisi.
  3. Per misurare il diametro del nucleo, evidenziare il segnale corrispondente al nucleo determinando una soglia cliccando su Seleziona immagine | Regola | Soglia.... Scegli un metodo nel menu a discesa predefinito che si adatta meglio all'immagine (ad esempio, Otsu) e regola la soglia fino a quando la forma del nucleo non viene chiaramente ritagliata dallo sfondo.
    NOTA: L'impostazione della soglia deve essere regolata per ogni immagine poiché un'impostazione potrebbe non adattarsi a tutte le immagini o a tutti i campioni.
  4. Impostare la misura per determinare il diametro del Feret facendo clic su Seleziona analizza | Imposta le misure.... Dal menu, selezionare Diametro feret e regolare il decimale se necessario.
  5. Per iniziare l'analisi dell'immagine, fare clic su Seleziona analizza | Analizza le particelle per impostare la dimensione delle particelle; Per il nucleo, scegli 5-infinito μm² | Visualizzazione dei risultati | Aggiungi al manager | Escludi su bordi e sovrapposizione. Avviare l'analisi.
  6. All'inizio dell'analisi, verranno visualizzate più finestre. Nei risultati della finestra, cerca il diametro massimo di Feret di ciascun nucleo nella colonna Feret. Copia e incolla i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcola la dimensione media del nucleo per campioni preespansi ed espansi .
    NOTA: Assicurarsi che le regioni di interesse (ROI) corrispondenti a ciascun nucleo seguano l'intera periferia del nucleo.
  7. Calcolare il fattore di dilatazione (EF) come segue:
    EF = figure-protocol-1
    NOTA: Il fattore EF determina di quanto il campione è stato espanso.

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Risultati

Di seguito è mostrata l'applicazione del protocollo per visualizzare le glicoproteine sialilate nelle cellule HeLa (Figura 3A) e nelle cellule MCF7 (Figura 3B), omettendo il trattamento CQ (sezione 2 del protocollo) e la colorazione di co-localizzazione in immunofluorescenza (fase 5.3 del protocollo).

figure-results-1

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Discussione

L'attuale protocollo di marcatura del CuAAC non include l'aminoguanidina nel tampone di reazione. Poiché ha lo scopo di visualizzare i glicoconiugati intracellulari, viene eseguito su cellule che vengono fissate dopo la fase di incorporazione metabolica, per evitare qualsiasi problema di citotossicità e migliorare l'assorbimento del sistema catalitico. L'uso dell'aminoguanidina è tipicamente raccomandato per la marcatura della superficie cellulare delle cellule viventi per prevenire reazioni collaterali tra deidroascorba...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo le strutture TisBio e la piattaforma PLBS per aver fornito l'ambiente tecnico favorevole alla realizzazione di questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del CNRS e del Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Ringraziamo il Dr. François Foulquier, la Dr. Zoé Durin, la Sig.ra Dorothée Vicogne e la Sig.ra Céline Schulz per le stimolanti discussioni e per averci fornito la linea cellulare Fibroblast 533T e l'anticorpo primario GM130.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(+) Sodio L-ascorbatoSigma Aldrich11140
12 pozzetti piastra per coltura cellulareCorning3513
AcrilammideSigma AldrichA8887
Acido acrilico N-idrossisuccinimide estere Sigma AldrichA8060
Alexa Fluor 488 alchino Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 capra anti-topoIgG InvitrogenA11003
Amonium persulfateSigma Aldrich9913
Bis-acrilammideSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
Provetta da centrifugazione 2 mLEPPENDORF 30120094
sale di clorochina difosfatoSigma AldrichC6628
Provetta conica 15 mLFalcon352097
vetrini coprioggetti 12 mm #1eprediaCB00120RA120MNZ0
vetrini coprioggetti 32 mm #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM ad alto contenuto di glucosioDutscherL0104-500
salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) DutscherL0615-500
Fetale Siero BovinobiowestS1810-500
Fibroblast 533T-Raccolto da individuo sano
FIJI ImageJ 2.9.0-
GelatinaBio-RAD170-6537
Guanidina HClSigma Aldrich50950
Cellule HeLaATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-BMicroscopia confocale anidro
LSM 780 Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-acetilmannosamina (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azidoacetilmannosamina (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Olio DIC M27Zeiss420782-9900-799 
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinasi KSigma AldrichP2308da  Tritirachium album
topo purificato GM130 anticorpoBD Bioscience61082250 µ g
Acrilato di sodio Sigma Aldrich408220
T75 FlaconeCorning430641
TEMEDSigma AldrichT9281
tris Acetato EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BlueDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherL0930-100
Soluzione

Riferimenti

  1. De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
  2. Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
  3. Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
  5. Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
  6. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
  7. Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
  8. Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
  9. Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
  10. Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  14. Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
  16. Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
  17. Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
  18. Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
  19. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
  20. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  21. Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
  22. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
  23. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
  24. Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
  25. Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
  26. Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
  27. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
  28. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  29. Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
  30. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
  31. Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
  32. Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
  33. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  34. Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
  35. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).

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