Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

Sommario

Questo studio descrive un metodo per la produzione di sferoidi condrocitici aggregando le cellule in sferoidi in condizioni di bassa adesione utilizzando la gravità, seguita dalla coltura degli sferoidi risultanti in mini-bioreattori.

Abstract

La riparazione della cartilagine nelle malattie articolari croniche richiede terapie cellulari avanzate per rigenerare efficacemente i tessuti danneggiati. Questo protocollo fornisce un metodo graduale per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in sferoidi basati su condrociti, supportando le applicazioni di ingegneria tissutale e terapia cellulare. Il processo di differenziazione è attentamente strutturato per promuovere l'impegno del lignaggio condrogenico, a partire da iPSC coltivate in terreni specifici che guidano in sequenza le cellule attraverso le fasi critiche del differenziamento. Inizialmente, le iPSC vengono espanse per raggiungere la confluenza ottimale prima dell'induzione verso il lignaggio condrogenico utilizzando una serie di cambiamenti di terreno definiti. Entro il decimo giorno, le cellule vengono trasferite in un mezzo che promuove la condrogenesi che migliora la formazione di cellule simili ai condrociti che esprimono marcatori chiave dei condrociti maturi. Un'ulteriore aggregazione in piastre rivestite di agarosio a 96 pozzetti porta alla formazione di sferoidi tridimensionali, che vengono poi coltivati in mini-bioreattori personalizzati progettati per simulare un microambiente che favorisce la deposizione di matrice extracellulare (ECM). Consentendo la produzione scalabile di sferoidi condrocitari che imitano le caratteristiche della cartilagine nativa, questo approccio offre una soluzione promettente e riproducibile per lo sviluppo di trattamenti cellulari per i difetti della cartilagine, fornendo un'ampia utilità per applicazioni cliniche e di ricerca nella medicina rigenerativa muscoloscheletrica.

Introduzione

La prevalenza della malattia articolare comporta notevoli oneri economici a causa del crescente numero di pazienti disabili e dei costi associati alla loro cura. La cartilagine ialina è un tessuto connettivo avascolare con un potenziale rigenerativo limitato¹. L'uso prolungato di alcuni farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), glucocorticoidi e chemioterapia o radioterapia può ridurre ulteriormente la capacità rigenerativa della cartilagine, eliminando quasi completamente la sua capacità di guarire². Ciò rende difficile ottenere cellule cartilaginee autologhe per la terapia cellulare.

La tecnologia della coltivazione di cellule tridimensionali (3D), compresi i condrociti, è stata a lungo riconosciuta come un'area di ricerca emergente con un potenziale significativo. Queste strutture 3D sono in fase di studio per applicazioni sia nella ricerca biologica di base che nella medicina rigenerativa. Gli sferoidi derivati da condrociti autologhi sono promettenti dal punto di vista terapeutico per affrontare la degenerazione del tessuto cartilagineo, una condizione che attualmente riceve una notevole attenzione a livello globale³.

Gli sferoidi derivati da condrociti differenziati dalle iPSC rappresentano un'alternativa promettente ai condrociti primari, offrendo vantaggi significativi per la riparazione della cartilagine. Le iPSC forniscono una capacità quasi illimitata di auto-rinnovamento e possiedono un ampio potenziale di differenziazione, che consente la produzione di condrociti in quantità sufficienti per applicazioni cliniche senza procedure invasive per la raccolta cellulare⁴. Inoltre, il passaggio dalle tradizionali colture di condrociti bidimensionali (2D) ai sistemi di coltura 3D, come le condrosfere, migliora ulteriormente la vitalità e la funzionalità di queste cellule creando un ambiente fisiologicamente più rilevante. Gli studi dimostrano che i condrociti coltivati in sferoidi 3D mantengono meglio il loro fenotipo, mostrando tassi più bassi di dedifferenziazione e livelli di espressione più elevati dei principali marcatori della cartilagine ialina, come il collagene di tipo II e l'aggrecano⁵.

Nonostante il potenziale delle condrosfere derivate da iPSC, i protocolli standardizzati per la generazione di condrosfere di alta qualità rimangono limitati. La variabilità dei protocolli tra gli studi porta spesso a incongruenze nella qualità dei condrociti e nella composizione della matrice extracellulare, influenzando la loro efficacia per l'uso terapeutico⁶. Qui, viene presentato un protocollo raffinato che standardizza la generazione di sferoidi da condrociti derivati da iPSC utilizzando mini-bioreattori economici e personalizzati. La fase di coltura del mini-bioreattore è essenziale, in quanto fornisce un'impostazione controllata e a bassa adesione che ottimizza la distribuzione dei nutrienti, la maturazione della ECM e la compattazione degli sferoidi⁷. Questa fase promuove una robusta espressione dei marcatori essenziali dei condrociti, tra cui il collagene di tipo II, l'aggrecan e SOX9, insieme a una composizione ECM che ricorda da vicino la cartilagine nativa. I cambi regolari dei terreni e l'attento controllo delle condizioni ambientali - temperatura, CO₂ e velocità di rotazione - garantiscono ulteriormente la vitalità e la maturazione degli sferoidi dei condrociti. Questo protocollo è stato ottimizzato per creare condrosfere di alta qualità con una forte espressione di marcatori della cartilagine ialina in modo economico e scalabile, adatte per la ricerca e le applicazioni cliniche nella riparazione della cartilagine.

Protocollo

Lo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico del LOPUKHIN FRCC PCM (protocollo n. 2019/02 del 9 aprile 2019). Tutti i campioni dei donatori sono stati ottenuti in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti e/o dai loro tutori legali.

NOTA: Mantenere la tecnica sterile per tutto il protocollo. Riscaldare tutti i terreni di coltura e le soluzioni a 37 °C prima di applicarli su cellule o sferoidi. Coltivare le cellule in un incubatore di CO₂ a 37 °C, con il 5% di CO₂ e l'80% di umidità. Lo schema del protocollo è illustrato nella Figura 1.

Figura 1: Protocollo per la produzione di condrosfere dalla linea iPSC IPSRG4S. (A) Inizialmente, le iPSC vengono coltivate in terreni di cellule staminali pluripotenti fino a raggiungere l'80% di confluenza. (B) Per indurre la differenziazione verso la linea condrocitica, le iPSC vengono poi coltivate nel terreno A per 2 giorni. Il terreno viene successivamente sostituito con una formulazione priva di Chir 99021 e dell'inibitore della Rho chinasi e le cellule vengono coltivate per altri 6 giorni con cambi di terreno ogni 2 giorni. (C) Le cellule vengono quindi trasferite al terreno B per promuovere la condrogenesi per i successivi 10 giorni. (D) Una volta raggiunto un numero sufficiente di cellule, il processo avanza allo stadio di produzione degli sferoidi. (E) Le cellule sono aggregate in sferoidi in condizioni di bassa aderenza per gravità. (F) Gli sferoidi risultanti vengono coltivati in mini-bioreattori con mezzo B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Trasformazione di piastre di Petri in mini-bioreattori

NOTA: dettagli in un precedente articolo⁵.

1. Tagliare le provette da centrifuga in anelli alti 7-8 mm utilizzando le forbici sterili per autoclave (impostazioni dell'autoclave: 121 °C (250 °F) a 15 psi, 30 min e asciugatura post-autoclave per 20 min).
2. Frantumare le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in piccoli pezzi. Sciogliere circa 1 g di particelle di plastica in 10 ml di cloroformio durante la notte per creare una soluzione di plastica liquida. Eseguire questa procedura in una cappa aspirante.
3. Verificare che la plastica liquida sia sufficientemente viscosa per il pipettaggio. Assicurarsi che le goccioline mantengano una forma sferica piuttosto che diffondersi sulla superficie. Se la soluzione è troppo liquida, aggiungere altre particelle di plastica, richiedendo solitamente 1-3 g. Se è troppo denso, aggiungere altro cloroformio, che di solito richiede fino a 5 ml.
4. Formare una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione da 60 mm utilizzando uno dei due metodi efficaci descritti di seguito.
   1. Opzione 1: posizionare l'anello di plastica autoclavato al centro della capsula di Petri, quindi applicare la plastica liquida all'interno dell'anello; una goccia richiederà circa 100-200 μL di gocce di plastica liquida.
   2. Opzione 2: Applicare lo stesso numero di gocce di plastica liquida direttamente al centro della capsula di Petri senza utilizzare l'anello di plastica.
5. Lasciare asciugare le stoviglie scoperte per 2-3 ore in una cappa a flusso laminare. Dopo l'asciugatura, esporre le stoviglie ai raggi ultravioletti per 20-30 minuti.

2. Trattamento delle piastre di coltura con gelatina

1. Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% sciogliendo la gelatina in polvere in acqua distillata a 95 °C. Far passare la soluzione in sequenza attraverso filtri a membrana da 0,45 μm e 0,25 μm, quindi conservare il filtrato a 4 °C.
2. Immediatamente prima della risemina dei condrociti, applicare i 3 mL di soluzione di gelatina sul pallone da 25 cm² (si consiglia fino a 15 g di tessuto cartilagineo per pallone T25). Incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 min, rimuovere la gelatina, sciacquare due volte con PBS e procedere con la semina cellulare.

3. Isolamento e coltivazione dei condrociti

NOTA: I condrociti sono isolati da regioni cartilaginee non portanti di pazienti sottoposti a sostituzione totale del ginocchio. Raccogliere tutti i campioni in condizioni sterili e conservarli in provette sterili riempite con DMEM contenenti 200 U/mL di soluzione di penicillina/streptomicina. Conservare il tessuto cartilagineo in frigorifero a 2-8 °C.

1. Iniziare il trattamento enzimatico entro 2 giorni dal prelievo della cartilagine. Lavare i pezzi di cartilagine nella soluzione di Hanks utilizzando piastre di Petri da 60 mm, quindi tagliare la cartilagine in frammenti di circa 1-2 mm di diametro utilizzando forbici autoclavate.
2. Trasferire i pezzi di cartilagine in provette da 15 mL e digerirli in una soluzione di collagenasi 0,01% di tipo II in DMEM, circa 1 mL per 1 g di cartilagine, entro 8-12 ore in un incubatore di CO₂ impostato a 37 °C con 5% di CO₂, 100% di umidità, in continua agitazione su un agitatore orbitale a 150-200 giri/min.
3. Dopo la digestione, lavare i frammenti di cartilagine aggiungendo DMEM in una provetta da 15 mL, quindi centrifugare a 300 × g per 10 min. Risospendere i frammenti in un terreno di coltura di condrociti (Tabella supplementare 1) e seminarli su un pallone adesivo T25 pre-rivestito con una soluzione di gelatina allo 0,1%.
4. Passaggio dei condrociti quando si raggiunge una densità confluente dell'80%.
   1. Per il passaggio, lavare i condrociti con la soluzione di Hanks, quindi incubare le cellule con una soluzione di tripsina allo 0,25% a 37 °C per 5 minuti.
   2. Per inattivare la tripsina, aggiungere un volume uguale di DMEM + 10% FBS. Risospendere i condrociti in un terreno di coltura fresco, quindi distribuirli in un rapporto 1:3, seminando 20.000-30.000 cellule per 1 cm².
   3. Porre il pallone di coltura in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 100% di umidità.

4. Coltivazione di cellule staminali pluripotenti

NOTA: In collaborazione con il Laboratorio di Cellule Staminali del Molecular Brain Research Group, Dipartimento di Neurobiologia, A.I. Virtanen Institute, Università della Finlandia Orientale, Kuopio, Finlandia, è stata generata con successo una linea di iPSCs IPSRG4S in un precedente studio⁸.

1. Coltivare iPSC in piastre a 6 pozzetti pre-rivestite con una matrice contenente proteine extracellulari (Figura 1A). Utilizzare un terreno per le cellule staminali pluripotenti (Tabella supplementare 1).
2. Celle di passaggio all'80% di confluenza, mantenendo un rapporto 1:4 (50.000-75.000 celle per 1 cm²). Circa 2-3 ore prima del distacco, trasferire le iPSC nel terreno per cellule staminali pluripotenti contenenti l'inibitore della chinasi Rho Y27632 a una concentrazione finale di 1 μM per 1 giorno.
3. Lavare le iPSC con la soluzione di Hanks e incubare a 37 °C con una soluzione di tripsina allo 0,05%. Per inattivare la tripsina, aggiungere un volume uguale di DMEM + 10% FBS. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti in provette da 15 mL.
4. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno fresco per ottenere cellule staminali pluripotenti. Per migliorare la vitalità cellulare, aggiungere l'inibitore della chinasi Rho Y27632 al terreno a una concentrazione finale di 1 μM per 1 giorno. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a CO₂ impostato a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 100% di umidità.

5. Differenziamento condrogenico delle iPSC

1. Avviare la differenziazione verso la linea condrocitica coltivando cellule nel terreno A (Tabella supplementare 1) per i primi 2 giorni. Il giorno 3, sostituire il terreno A con una soluzione che escluda Chir 99021 e l'inibitore della Rho chinasi mantenendo invariati tutti gli altri componenti. Cambiare il mezzo ogni 2 giorni dal giorno 3 al giorno 9 (Figura 1B).
2. Il giorno 10, trasferire le cellule simili ai condrociti nel terreno B (Tabella supplementare 1), formulato per facilitare la condrogenesi. Cambiare il fluido ogni 2 giorni per 10 giorni (Figura 1C).
3. Preparare in anticipo una piastra di coltura in sospensione cellulare da 96 pozzetti rivestendo ogni pozzetto con agarosio all'1,5% in acqua distillata. Sciogliere l'agarosio in un forno a microonde fino a ebollizione (circa 60-90 s a 700 W). Una volta liquefatto l'agarosio, aggiungere 75 μL di agarosio a ciascun pozzetto e lasciarlo indurire a RT (circa 15 minuti).
4. Aggiungere 150 μl di terreno DMEM a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore di CO₂ per almeno 12 ore.
   NOTA: Le piastre preparate possono essere conservate per un massimo di 1 mese in un incubatore di CO₂ a 37 °C se il terreno in ciascun pozzetto viene reintegrato per compensare l'evaporazione.
5. Il giorno 12, dopo aver osservato i cambiamenti fenotipici associati alla condrogenesi, avviare la formazione di sferoidi utilizzando le cellule simili ai condrociti generate.
   NOTA: In questa fase, è consigliabile analizzare l'espressione di marcatori condrocitici chiave con immunocitochimica (ICC) e reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) utilizzando il metodo ^{2-ΔΔCT 9} per confermare il successo della differenziazione condrogenica delle iPSC. Durante il passaggio da una piastra a 6 pozzetti a un pallone per colture cellulari da 75 cm² , una piccola porzione di cellule può essere seminata in una piastra a 48 pozzetti, in base al numero di marcatori da analizzare. Eseguire l'analisi ICC su questi campioni per verificare l'espressione genica.

6. Formazione di sferoidi da cellule derivate da iPSC simili ai condrociti

1. Dopo aver ottenuto derivati simili ai condrociti, le cellule passano all'80% di confluenza. Staccare le cellule dalle piastre a 6 pozzetti utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,05%. Per inattivare la tripsina, aggiungere un volume uguale di DMEM + 10% FBS, quindi trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
2. Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 1 mL di terreno B e trasferirle in un pallone di coltura cellulare da 75 cm² pre-rivestito con soluzione di gelatina allo 0,1% (Figura 1D). Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza come monostrato, staccare nuovamente le cellule con la tripsina e risospendere nel terreno B come descritto.
3. Trasferire le cellule in una piastra da 96 pozzetti rivestita con agarosio all'1,5% a una densità di 100.000 cellule per pozzetto. Coltivare nel terreno B, aggiungendo 150 μl di terreno completo per pozzetto (Figura 1D, 3A).
4. Mantenere le cellule nella piastra a 96 pozzetti rivestite con agarosio all'1,5% per un minimo di 1 giorno e un massimo di 3 giorni fino alla formazione di sferoidi (Figura 2B). Trasferire gli sferoidi dai pozzetti utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL con un'estremità tagliata, quindi trasferirli in una provetta da 15 mL. Lasciare riposare gli sferoidi per 2-3 minuti e rimuovere il surnatante.
5. Immergere gli sferoidi in una soluzione di matrice a membrana basale appena scongelata e non diluita mantenuta a 4 °C. Dopo 30 minuti, raccogliere gli sferoidi per sedimentazione passiva in una provetta da 15 mL o per centrifugazione delicata a 100 x g per 1 minuto.
   NOTA: La matrice deve essere scongelata per una notte con ghiaccio in frigorifero a 2-8 °C. Dopo il primo scongelamento, vengono realizzate aliquote monouso della matrice per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento. I tubi in polipropilene o altri tubi compatibili con il congelatore vengono utilizzati e conservati a -70 °C o -20 °C. Prestare attenzione alla data di scadenza del lotto/lotto, che è di 2 anni dalla data di produzione.
6. Trasferire gli sferoidi nei mini-bioreattori e aggiungere 6 mL di terreno B. Posizionare il mini-bioreattore su un agitatore orbitale all'interno di un incubatore di CO₂ impostato a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 100% di umidità e una velocità di agitazione di 70-75 giri/min (Figura 1F).
7. Cambiare il terreno settimanalmente o come richiesto dall'esaurimento del medio o dal cambiamento di colore dell'indicatore acido-base. Per fare ciò, lasciare che gli sferoidi si depositino per gravità in una provetta da 15 mL, quindi rimuovere con cura il surnatante. Aggiungere il terreno B fresco al tubo e trasferire gli sferoidi ai mini-bioreattori.

Risultati

Il protocollo delineato è illustrato nella Figura 1. Questa metodologia impiega due terreni di coltura distinti per guidare la differenziazione delle iPSC in sferoidi condrocitari per una durata minima di 1 mese (Figura 2). Il processo di differenziazione inizia quando le iPSC raggiungono una confluenza del 75%-90% (Figura 1B). I primi indicatori di differenziazione condrogenica emergono intorno al 9...

Discussione

Le iPSC rappresentano uno strumento trasformativo nella medicina rigenerativa, offrendo il potenziale per generare condrociti specifici per il paziente per la riparazione della cartilagine. I protocolli attuali sfruttano la differenziazione diretta attraverso le vie mesodermiche, con molecole di segnalazione chiave come TGF-β e BMP-2 che promuovono l'impegno del lignaggio condrocitico. Questi metodi mirano a replicare lo sviluppo della cartilagine embrionale, consentendo la produzione di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di tripsina allo 0,05%	Thermo Fisher Scientific	25300-062
Soluzione di tripsina allo 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Eagle's medium	Thermo Fisher Scientific	12634028
Anticorpo monoclonale aggrecano	Invitrogen	AHP0022	Ospite: Topo; Diluizione: 1/500
Acido ascorbico	Sigma	A4544	50 μ g/mL
integratore di B-27	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x o 2%
Beta-mercaptoetanolo	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μ M
COL1A1 (E6A8E) Anticorpo monoclonale	CellSignalling	39952	Ospite: Coniglio; Diluizione: 1/800
COL2A1 (M2139) Anticorpo monoclonale	Santa Cruz	sc-52658	Ospite: Topo; Diluizione: 1/50
Soluzione di collagenasi di tipo II	PanEco	P011-2	0,01%
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μ g/mL
di DMEM medio senza glutammina	PanEco	?420?
Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
La soluzione di Hanks	PanEco	?020?
Hybris 8 medium	PanEco	?780?/?780
Soluzione di insulina-transferrina-selenio	PanEco	?065	1x ha le seguenti concentrazioni: Insulina: 10 &; g/mL; Transferrina: 5,5 & micro; g/mL; Selenio 5 ng/mL
L-alanil-L-glutammina	Thermo Fisher Scientific 35050038		2 mM
Matrigel Matrix	BD	354277	300 μ g/mL
Soluzione di penicillina-streptomicina	PanEco	?063?	100 U/mL
Acido retinoico	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Inibitore della chinasi Rho Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
Anticorpo secondario Capra anti-topo IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Ospite: Capra; Diluizione: 1/500
Anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG (H + L) altamente adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific.	?32732	Ospite: Capra; Diluizione: 1/500
Sox9 (D8G8H) Anticorpo monoclonale	CellSignalling	82630	Ospite: Rb; Diluizione: 1/400
TeSR-1 medium	STEMCELL technologies	85850
TGF-β 1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/mL