Modellazione del consumo di alcol nei roditori utilizzando l'uso di due bottiglie di alcol in gabbia domestica e l'analisi microstrutturale

Sommario

Questo protocollo descrive un paradigma standard di consumo in gabbia domestica con accesso intermittente a due bottiglie per modellare il consumo di alcol nei ratti. Inoltre, fornisce istruzioni dettagliate per aumentare il protocollo standard con un sistema di rilevamento delle leccate fai-da-te che consente l'analisi microstrutturale del comportamento nel bere.

Abstract

Il consumo casalingo in gabbia a due bottiglie è uno dei paradigmi più utilizzati per studiare il consumo di etanolo nei roditori. Nella sua forma più semplice, gli animali hanno accesso a due borracce, una delle quali contiene normale acqua del rubinetto e l'altra etanolo, con l'assunzione giornaliera misurata dalla variazione del peso della bottiglia nel periodo di 24 ore. Di conseguenza, questo approccio non richiede attrezzature di laboratorio specializzate. Mentre tale facilità di implementazione è probabilmente il maggior contributo alla sua adozione diffusa da parte dei ricercatori preclinici sull'alcol, la risoluzione dei dati sul consumo acquisiti utilizzando questo approccio è limitata dal numero di volte in cui il ricercatore misura il peso della bottiglia (ad esempio, una volta al giorno). Tuttavia, il desiderio di esaminare i modelli di consumo nel contesto dell'assunzione complessiva, degli interventi farmacologici e delle manipolazioni neuronali ha spinto lo sviluppo di sistemi di rilevamento delle leccate in gabbia domestica in grado di acquisire dati a livello di singole leccate. Sebbene un certo numero di questi sistemi sia stato sviluppato di recente, il sistema open source, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), ha raccolto una notevole attenzione nel settore per la sua convenienza e facilità d'uso. Sebbene eccitante, questo sistema è stato progettato per l'uso nei topi. Qui, esaminiamo le procedure appropriate per il consumo di alcol in gabbia domestica standard e dotato di leccometro a due bottiglie. Introduciamo anche metodi per adattare il sistema LIQ HD ai ratti, comprese le modifiche hardware per adattarsi a gabbie di dimensioni maggiori e un portabottiglie stampato in 3D ridisegnato compatibile con le borracce standard standard. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono esaminare in parallelo i modelli di consumo quotidiano oltre ai livelli di assunzione in molti ratti, aumentando così la risoluzione dei dati acquisiti con un investimento minimo in risorse aggiuntive. Questi metodi offrono ai ricercatori la flessibilità di utilizzare bottiglie standard o un apparecchio dotato di leccometro per interrogare i meccanismi neurobiologici alla base del consumo di alcol a seconda delle loro precise esigenze sperimentali.

Introduzione

Sebbene l'uso moderato di alcol sia stato storicamente associato a benefici per la salute moderati, recenti studi completi su larga scala hanno rivelato che nessuna quantità di consumo di alcol è sicura^1,2. In effetti, l'uso di alcol è il 7° fattore di rischio principale per la morte e la disabilità a livello globale¹ con individui che bevono anche piccole quantità di alcol che hanno un aumentato rischio di cancro, malattie infettive e lesioni^1,3. Negli Stati Uniti, i decessi per uso di alcol sono aumentati di quasi il 30% tra il 2016 e il 2021⁴. È importante sottolineare che il rischio di morte e invalidità aumenta monotonicamente con l'aumento del consumo¹.

Sebbene gli studi sull'uomo abbiano fornito preziose informazioni sulla neurobiologia dell'uso e dell'abuso di alcol, il controllo sperimentale offerto dai modelli animali è fondamentale per una comprensione approfondita dei meccanismi alla base del comportamento di consumo e del rischio di bere pesantemente. Questi modelli sono anche strumenti preziosi per lo sviluppo di trattamenti volti a ridurre il consumo incontrollato. Il consumo casalingo in gabbia a due bottiglie è uno dei paradigmi preclinici più utilizzati per studiare il consumo di alcol nei roditori. Ciò è dovuto, in gran parte, alla sua facilità di implementazione, in quanto consente di misurare il consumo volontario totale di alcol e la preferenza senza la necessità di apparecchiature di ricerca specializzate o analisi complesse. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono raccogliere misurazioni agli intervalli desiderati (ad esempio, ore, giorni, settimane) calcolando la variazione di peso della bottiglia dall'inizio alla fine di una sessione di consumo. Variazioni su questo metodo di base sono state utilizzate da molti nel campo per facilitare livelli di assunzione di alcol da bassi a moderati a binge sia per brevi che per lunghi periodi di tempo. Ad esempio, sono state utilizzate procedure di scelta continua e intermittente di due bottiglie per facilitare livelli bassi e moderati di assunzione di alcol, rispettivamente, sia nei topi^{5 che nei} ratti^6,7,8. Gli stessi paradigmi possono promuovere alti livelli di assunzione nei ceppi che preferiscono l'alcol^7,9. In alternativa, è stato dimostrato che un adattamento di questo metodo che limita l'accesso all'alcol a 2-4 ore al giorno a partire da circa 3 ore dopo l'inizio del ciclo del buio genera binge drinking nei topi (ad esempio, bere al buio)^10,11. Ulteriori variazioni di questi metodi sono state utilizzate in combinazione con metodi che facilitano la dipendenza da alcol (ad esempio, esposizione cronica intermittente al vapore di etanolo) per esaminare l'escalation del consumo volontario di alcol durante l'astinenza^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Sebbene ampiamente adottato dal settore, l'approccio standard di misurare l'assunzione di alcol in base alla variazione del peso della bottiglia è limitato in risoluzione al consumo totale per sessione di consumo. Di conseguenza, questo approccio non è in grado di catturare i modelli di consumo, che sono ben noti per influenzare sia il rischio che la gravità del disturbo da uso di alcol (AUD)^20,21,22. In effetti, l'assunzione media di un individuo nel tempo può essere una conseguenza di diversi episodi di consumo pesante o di molti episodi di consumo di alcol, ciascuno associato a un consumo relativamente basso e queste sfumature non vengono rilevate quando il consumo viene misurato come assunzione totale per sessione di consumo. È importante sottolineare che negli individui con AUD si osservano un numero significativamente maggiore di episodi di consumo associati a grandi attacchi di consumo (ad esempio, deglutizione) rispetto ai controlli sani²³ e i dati nei primati non umani suggeriscono che gli individui che stabiliscono un modello di consumo di alcol che include grandi attacchi di consumo all'inizio della loro storia alcolica sono a rischio significativo di AUD²². Inoltre, gli episodi di consumo che includono ampi periodi di consumo aumentano significativamente il rischio di morbilità e mortalità indipendentemente dalla diagnosi di AUD²¹. Nel complesso, questi dati hanno portato a un maggiore interesse nell'esaminare i modelli di consumo oltre ai livelli di assunzione complessiva nei modelli preclinici e hanno stimolato lo sviluppo di una serie di sistemi di varia complessità che sono in grado di acquisire dati sul consumo a livello di singole leccate.

Tra i primi c'è stato lo sviluppo di un sistema a due bottiglie dotato di rilevamento del lick del fotoraggio progettato per l'uso nei topi²⁴. Questo sistema è stato successivamente adattato da un gruppo separato per l'uso in rats²⁵. Negli anni successivi, sono state utilizzate variazioni su questo tema per sviluppare sistemi simili contenuti all'interno di alloggi personalizzati per roditori²⁶, che consentono il rilevamento delle leccate di singoli animali socialmente alloggiati^27,28 e che catturano sia il comportamento alimentare che quello di bere²⁹. Tra questi, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ ha raccolto un'attenzione significativa per l'offerta di un sistema per l'uso nei mouse che è parallelo alla facilità di implementazione e all'accessibilità del sistema sviluppato da Godnyuck et al.²⁴. Questo sistema utilizza il rilevamento capacitivo per rilevare direttamente il contatto tra la linguetta e il tubo del sorso in metallo conduttivo, al contrario delle misure indirette come l'avvicinamento o l'interazione del sorso che si ottengono utilizzando il sistema di rilevamento del fotoraggio. Gli autori forniscono dati che dimostrano che il loro sistema di rilevamento capacitivo offre una precisione e una sensibilità significativamente maggiori nel rilevamento delle leccate, producendo correlazioni più forti tra il numero di leccate e la variazione del peso della bottiglia rispetto al rilevamento del fotoraggio. Gli autori dimostrano inoltre la capacità di utilizzare questo sistema in combinazione con un paradigma di consumo in gabbia domestica ad accesso continuo a due bottiglie per catturare le misure della microstruttura del consumo di alcol oltre alle misure dell'assunzione giornaliera complessiva³⁰.

Qui, descriviamo le procedure per il consumo di alcol in gabbia domestica a due bottiglie utilizzando un approccio standard, nonché metodi che consentono il rilevamento del lick (Figura 1). Introduciamo anche metodi per la creazione e l'implementazione di LIQ HDR, un adattamento di LIQ HD³⁰ per l'uso nei ratti che include modifiche hardware per adattarsi a gabbie di dimensioni maggiori e un portabottiglie stampato in 3D ridisegnato compatibile con le bottiglie standard standard. Questi metodi offrono ai ricercatori la flessibilità di utilizzare un approccio standard o dotato di leccometro a seconda delle loro risorse sperimentali e delle esigenze di raccolta dei dati.

Di seguito è riportata una descrizione dei materiali necessari e istruzioni dettagliate per catturare l'uso domestico del consumo in gabbia utilizzando la procedura di consumo a scelta a due bottiglie ad accesso intermittente adattata da Simms et al.⁷. In questa procedura, ai ratti viene fornito l'accesso 24 ore su 24 a due bottiglie per bere 7 giorni alla settimana. Il lunedì, il mercoledì e il venerdì (MWF), i ratti ricevono una bottiglia contenente acqua (H₂O) e un'altra bottiglia contenente etanolo (EtOH). Queste bottiglie vengono rimosse il martedì, il giovedì e il sabato (TRS) e sostituite con due bottiglie d'acqua. I ratti bevono dalle stesse due bottiglie d'acqua il sabato e la domenica. Si noti che questi metodi possono essere facilmente regolati per programmi alternativi di accesso all'etanolo (ad esempio, continuo, abbuffata, ecc.), se lo si desidera. Vengono fornite istruzioni separate per gli approcci standard e dotati di lecometro.

Protocollo

Tutti i dati rappresentativi sono stati raccolti utilizzando ratti adulti Long-Evans allevati singolarmente, con l'approvazione del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio dell'Università dell'Illinois di Chicago e nel rispetto delle Linee guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. L'allevamento singolo è necessario per monitorare accuratamente il consumo di liquidi di ciascun soggetto. Alla loro consegna, i ratti adulti maschi (n = 38) e femmine (n = 22) di ceppo Long-Evans avevano un'età compresa tra P50 e P80 e sono stati lasciati ambientare al vivario per una settimana prima dell'inizio dell'esperimento. I ratti avevano ad libitum accesso a mangime standard (Teklad 7912, Envigo) e acqua, salvo diversamente indicato.

1. Preparazione prima dell'esperimento

1. Etichettare le bottiglie per bere come H₂O o EtOH. Quindi, assegnare a ciascun ratto un'etichetta identificativa univoca per una bottiglia di H₂O e una di EtOH per i giorni LMV e due bottiglie di H₂O per i giorni MVS.
   NOTA: In alternativa, utilizzare nastro adesivo di colori diversi per identificare le bottiglie di H₂O e di EtOH, al fine di ridurre il rischio di errori durante la sostituzione delle bottiglie.
2. Riempire le bottiglie di H₂O con acqua potabile un giorno prima della data di inizio dell'esperimento. Preparare la soluzione di EtOH mescolando EtOH al 190 proof con acqua potabile (20% v/v) un giorno prima della data di inizio dell'esperimento.
   ATTENZIONE: È fondamentale utilizzare EtOH non denaturato, poiché l'EtOH denaturato è tossico.
3. Preparare una gabbia vuota sulla stessa scaffalatura dei ratti coinvolti nell'esperimento. Questa gabbia verrà utilizzata per calcolare il versamento.
4. Equipaggiare le gabbie con il sistema LIQ HDR se utilizzato (vedere passaggio 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura Supplementare 1).
5. Stabilire l'orario preciso della giornata per la sostituzione delle bottiglie prima dell'inizio dello studio. Le bottiglie devono essere sostituite ogni giorno allo stesso orario per ottenere una misurazione accurata del consumo in 24 ore.
   NOTA: Studi precedenti hanno dimostrato che i roditori mostrano il grado maggiore di consumo subito dopo l'inizio del ciclo scuro^10,31. Pertanto, per registrare l'assunzione durante questo periodo di elevata attività (vedere passaggio 2.3.1 per registrare il consumo simile a binge), si raccomanda di effettuare la sostituzione delle bottiglie 30-60 minuti dopo lo spegnimento delle luci. Utilizzare lampade rosse durante la sostituzione per consentire la visualizzazione senza interrompere il ciclo luce-buio.

2. Procedure quotidiane e manutenzione

1. Nel primo giorno dell'esperimento, eseguire le seguenti operazioni.
   1. Rimuovere le bottiglie d'acqua standard dalle gabbie.
   2. Facoltativo: spesso i ratti urtano il coperchio della gabbia mentre cercano il cibo, causando fuoriuscite che non possono essere corrette con la gabbia per fuoriuscite vuota. L'uso di contenitori per il cibo all'interno della gabbia può ridurre questo problema. Se si utilizzano, rimuovere il cibo dal coperchio della gabbia, aggiungere un contenitore per il cibo all'interno della gabbia e riempirlo con il mangime. Assicurarsi che lo spazio disponibile sul fondo della gabbia per il ratto rispetti le linee guida istituzionali, in base alle dimensioni della gabbia e del contenitore per il cibo.
   3. Informare il personale addetto alla cura e all'allevamento, se applicabile, che il personale di ricerca fornirà cibo e acqua per tutta la durata dell'esperimento.
   4. Le sostituzioni della gabbia possono interferire con la raccolta dei dati. Eseguire le sostituzioni contemporaneamente alla misurazione del peso corporeo. I ricercatori che scelgono di farlo devono informare di conseguenza il personale addetto alla cura e all'allevamento.
2. Negli giorni successivi, seguire le procedure descritte di seguito.
   NOTA: ricordare che qualsiasi movimento delle gabbie e delle bottiglie può causare fuoriuscite. Pertanto, è fondamentale essere delicati nei movimenti e utilizzare gli stessi metodi per applicare e rimuovere le bottiglie sulla gabbia per fuoriuscite impiegati per le gabbie dei ratti.
   1. Entrare nella stanza prima dell'orario di cambio delle bottiglie, assicurandosi di avere tempo sufficiente per eseguire i passaggi seguenti, e posizionare le nuove bottiglie sulle gabbie all'orario previsto per l'inizio della sessione.
   2. Rimuovere i tappi filtranti dalle gabbie. Se MWF, procedere al punto 2.2.3. Se TRS, procedere al punto 2.2.4.
   3. Nel lunedì, mercoledì e venerdì, rimuovere le bottiglie TRS dai coperchi delle gabbie. Pesare le bottiglie MWF (una di EtOH e una di H₂O). Registrare il peso iniziale delle bottiglie per la sessione odierna di consumo. Fornire ulteriore cibo sul coperchio della gabbia o nei contenitori per il cibo, se necessario. All'orario designato per l'inizio della sessione, posizionare le bottiglie sul coperchio della gabbia di ciascun ratto con l'etichetta rivolta verso l'alto, in modo che i ratti non mordano l'etichetta della bottiglia.
      NOTA: di norma, il consumo di acqua non viene registrato né riportato per TRS, ma i ricercatori possono eventualmente raccogliere questi dati ottenendo i pesi iniziali e finali delle bottiglie come descritto ai punti 2.2.3 e 2.2.4, se lo desiderano. Il lato per la bottiglia di EtOH deve essere alternato dopo ogni sessione di consumo, per evitare lo sviluppo di una preferenza laterale che potrebbe alterare involontariamente i dati di consumo.
      1. Facoltativo: studi precedenti hanno dimostrato che molti ratti mostrano un consumo simile a una sbronca all'inizio della sessione di consumo^8,32,33. La maggior parte dei ricercatori che studiano il consumo eccessivo in questo periodo riporta l'assunzione nei primi 30-60 minuti della sessione. Per ottenere dati sull'assunzione durante questo possibile episodio di consumo eccessivo, seguire i passaggi descritti di seguito.
      2. Impostare un timer dopo aver posizionato le bottiglie sull'ultima gabbia. Lasciare la stanza senza disturbi durante il periodo di tempo misurato.
      3. Rientrare nella stanza quando il timer suona. Rimuovere le bottiglie di EtOH e H₂O e registrare i loro pesi. Riportare le bottiglie di EtOH e H₂O sulle gabbie.
         NOTA: questo passaggio non è necessario per rilevare episodi di consumo eccessivo quando si utilizza un sistema dotato di rilevamento dei leccamenti.
   4. Nel martedì, giovedì e sabato, rimuovere le bottiglie MWF dalle gabbie all'orario designato di fine sessione, corrispondente a 24 h dopo l'orario di inizio. Pesare ciascuna bottiglia e registrare il peso finale per la sessione di consumo MWF. Ottenere e registrare il peso corporeo di ciascun ratto. Se necessario, fornire ulteriore cibo sul coperchio della gabbia o nei contenitori per il cibo. Posizionare le bottiglie di H₂O TRS sul coperchio della gabbia di ciascun ratto con l'etichetta rivolta verso l'alto, in modo che i ratti non mordano l'etichetta della bottiglia.
   5. Rimettere i tappi filtranti sulle gabbie e lasciare la stanza degli animali.
      NOTA: facoltativamente, coprire i beccucci delle bottiglie di EtOH per prevenire l'evaporazione. Se le sostituzioni delle gabbie sono effettuate dal personale di ricerca, designare un giorno alla settimana durante i compiti TRS per eseguire questa operazione. Posizionare ogni ratto in una gabbia pulita dopo averne misurato il peso corporeo.
3. Lavare le bottiglie e rinnovare i liquidi con cadenza settimanale o bisettimanale, in conformità alle procedure istituzionali di cura e allevamento degli animali. Prestare attenzione a eseguire queste operazioni in modo da non interrompere le sessioni di consumo. Ad esempio, le bottiglie di H₂O TRS possono essere lavate e riempite nuovamente dopo la rimozione nei giorni MWF. Analogamente, le bottiglie di H₂O ed EtOH MWF possono essere lavate e riempite nuovamente dopo la rimozione nei giorni TRS.

3. Rilevamento delle leccate durante esperimenti di scelta tra due bottiglie

NOTA: I ricercatori interessati alla registrazione di dati di consumo ad alta risoluzione possono modificare la procedura sopra descritta aggiungendo ai contenitori la capacità di rilevare i lecchii. LIQ HD³⁰ è un sistema fai-da-te (DIY) economico che consente questo tipo di raccolta dati nei topi. Le procedure descritte di seguito illustrano le modifiche necessarie per adattare LIQ HD all'uso nei ratti (denominato LIQ HDR). Consultare la Tabella dei Materiali per un elenco di tutti i componenti acquistati a livello commerciale e di quelli personalizzati stampati in 3D necessari per costruire un sistema di rilevamento dei lecchii, in grado di registrare dati di scelta tra due contenitori per fino a 18 ratti. I file .stl per la stampa 3D e le istruzioni sono disponibili sul sito web degli autori (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Configurazione delle unità del sensore capacitivo
   NOTA: Ogni sistema LIQ HDR è composto da tre unità di sensori capacitivi, che insieme registrano i dati dei lecchii da 36 bottiglie in parallelo, corrispondenti a 18 ratti alloggiati singolarmente. Ogni unità del sensore comprende una scheda di breakout per comunicazione differenziale I²C e una scheda del sensore capacitivo a 12 canali, che si collega ai liceometri di sei gabbie separate tramite sei coppie di cavi a 2 pin codificati a colori per ciascun liceometro (Figura 2A).
   1. Raccogliere i materiali necessari per costruire tutte e tre le unità del sensore capacitivo, come mostrato in Figura 2B, insieme agli strumenti di saldatura richiesti.
   2. Per iniziare a costruire l'unità del sensore A, coprire un connettore femmina a 2 pin con un tubo termorestringente rosso lungo 7 pollici, inserire i capi rosso e nero del cavo rispettivamente nei pin #0 e #1 della scheda del sensore (Figura 2C-1) e saldare in posizione (Figura 2C-2). Assicurarsi che il cavo sia posizionato sul lato anteriore della scheda del sensore, come mostrato, per disporre le gabbie in ordine numerico da sinistra a destra nel vivario senza sovrapposizione dei cavi e potenziali interruzioni della registrazione (vedere punto 3.6 e Figura 6).
   3. Coprire altri cinque cavi con tubi termorestringenti di colore diverso e saldarli ai pin #2-11 come indicato (Figura 2C-3). Assicurarsi che tutti i fili rossi siano saldati ai pin pari, che si collegheranno a tutte le bottiglie sul lato sinistro, e che tutti i fili neri siano saldati ai pin dispari, che si collegheranno a tutte le bottiglie sul lato destro.
   4. Coprire le saldature con colla a caldo su tutti i lati per protezione (Figura 2C-4). Etichettare i connettori in ordine numerico, assegnando un ID univoco a ciascun liceometro (Figura 2C-4).
   5. Per assemblare l'unità del sensore A, collegare la scheda del sensore A a un EndPoint della scheda di comunicazione tramite un cavo a 4 pin da 50 mm e collegare l'EndPoint all'uscita a 3,3 V dello shifter da 5 V a 3 V tramite un cavo a 4 pin da 100 mm (Figura 2D-1). Sebbene sia la scheda del sensore che la scheda di breakout di comunicazione abbiano due connettori a 4 pin identici, è comunque importante assicurarsi che il cablaggio sia esattamente come mostrato (Figura 2D-1 e Figura 2F) per utilizzare le custodie stampate in 3D per i sensori e la configurazione del vivario suggerita (vedere punto 3.6 e Figura 6). Inserire l'unità del sensore A all'interno della custodia stampata in 3D (Figura 2D-2). Chiudere delicatamente il coperchio, facendo attenzione a non schiacciare il cavo dello shifter (Figura 2D-3).
   6. Modificare gli indirizzi I²C delle schede del sensore B e C saldando un filo ponticello dal pin ADDR al pin 3Vo o SDA come indicato (Figura 2E).
   7. Saldare sei cavi femmina a connettore codificati a colori alle schede del sensore B e C utilizzando lo stesso ordine usato per la scheda A. Etichettare ciascun connettore con il numero ID corrispondente del liceometro. Collegare la scheda B al MidPoint della scheda di comunicazione e la C a un EndPoint tramite cavi a 4 pin da 50 mm (Figura 2F).
   8. Inserire le unità del sensore B e C nelle rispettive custodie stampate in 3D. Collegare in serie tutte e tre le unità del sensore con cavi Ethernet per completare la configurazione del sensore (Figura 2G).
2. Configurazione dell'interfaccia del microcontrollore
   NOTA: L'interfaccia del microcontrollore LIQ HDR (Figura supplementare 1A) è identica a quella descritta per LIQ HD³⁰, con modifiche di minima. Le procedure descritte di seguito forniscono una panoramica generale dei passaggi necessari per configurare l'interfaccia, con modifiche descritte ai punti 3.2.6 e 3.2.8. Si rimanda i ricercatori al protocollo originale e al tutorial video disponibile sulla pagina GitHub dell'autore per istruzioni dettagliate passo dopo passo³⁰.
   1. Raccogliere i materiali e gli strumenti di saldatura necessari per costruire l'interfaccia del microcontrollore (Figura supplementare 1B). Sul lato posteriore dello schermo touch (Figura supplementare 1C-1), creare un ponticello di saldatura tra i pad di saldatura del retroilluminatore (Figura supplementare 1C-2).
   2. Sul lato posteriore della scheda di registrazione dati, interrompere la traccia del pad del ponticello del pin CS (Figura supplementare 1D-1). Sul lato anteriore del registratore dati, saldare un breve filo ponticello dal pin CS al pin #7 (Figura supplementare 1D-2).
   3. Per installare gli header di sovrapposizione degli shield, posizionarli prima sul retro dello shield touch (Figura supplementare 1E-1). Sovrapporre il registratore dati allo shield touch, stabilizzarlo con del nastro e saldare tutti i pin degli header al registratore dati (Figura supplementare 1E-2). Successivamente, rimuovere lo schermo touch.
   4. Montare i restanti header 2 x 3 sul microcontrollore (Figura supplementare 1F-1), quindi sovrapporre il registratore dati al microcontrollore prima di saldare gli header in posizione (Figura supplementare 1F-2).
   5. Inserire la batteria a bottone nel registratore dati (Figura supplementare 1G-1). Sovrapporre lo schermo touch al registratore dati (Figura supplementare 1G-1). Inserire la scheda microSD con il suo adattatore nel registratore dati (Figura supplementare 1G-2).
   6. Per realizzare il filo di messa a terra aggiuntivo, staccare un connettore maschio da un filo ponticello e spelare l'estremità fino a circa 1/4 di pollice (Figura supplementare 1H-1). Saldare un tratto di filo rigido spelato al filo ponticello e coprire la saldatura con tubo termorestringente (Figura supplementare 1H-2).
   7. Collegare i fili ponticello a 4 pin e il filo di messa a terra aggiuntivo al microcontrollore (Nero - GND, Rosso - 5V, Giallo - pin #21, Blu - pin #20, Figura supplementare 1I-1). Fissare i collegamenti con colla a caldo (Figura supplementare 1I-2). Facoltativamente, avvolgere i fili ponticello con tubo termorestringente (Figura supplementare 1I-2).
   8. Inserire l'interfaccia del microcontrollore completamente assemblata nella custodia stampata in 3D, facendo passare i fili ponticello a 4 pin e il filo di messa a terra attraverso l'apertura superiore (Figura supplementare 1J).
   9. Seguire il protocollo originale per l'installazione del software dell'interfaccia del microcontrollore³⁰.
3. Costruzione dei liceometri LIQ HDR
   NOTA: La stampa 3D personalizzata che sostiene le bottiglie è progettata per essere utilizzata con una bottiglia standard per roditori con un tubo bevitore di diametro di 8 mm (vedere Tabella dei Materiali, Figura 3A). Questo supporto per bottiglie può essere facilmente adattato per l'uso con bottiglie e tubi bevitore simili, con modifiche minime o nulle.
   1. Raccogliere i materiali, le stampe 3D e gli strumenti di saldatura necessari per costruire un liceometro come mostrato in Figura 3B. Notare che ogni sistema LIQ HDR supporta un massimo di 18 liceometri per 36 bottiglie.
   2. Per estendere il cavo del connettore maschio, spelare entrambe le estremità per circa 1/4 di pollice, così come i fili nero e rosso di estensione (Figura 3C-1).
   3. Saldare i fili di estensione al cavo del connettore (Figura 3C-2) e coprire le saldature con tubo termorestringente (Figura 3C-3). Coprire il cavo del connettore maschio con tubo termorestringente dello stesso colore del corrispondente cavo del connettore femmina sull'unità del sensore (Figura 3C-4).
   4. Per essere coerenti con il cablaggio della scheda del sensore (Figura 2), far passare il filo rosso e quello nero rispettivamente attraverso il passaggio interno sinistro e destro del supporto per bottiglie (Figura 3D-1).
   5. Saldare ciascun filo all'estremità del nastro di rame conduttivo lungo 1 ¾ pollici (Figura 3D-2) e piegare i nastri di rame a metà (Figura 3D-3).
   6. Svitare il nastro di rame e utilizzare una pinza per manovrarlo con attenzione all'interno della staffa del tubo bevitore (Figura 3E-1) prima di incollarlo saldamente alle pareti interne della staffa (Figura 3E-2). Assicurarsi che il lato con la saldatura del nastro di rame sia incollato alla parete più vicina alla linea mediana del supporto per bottiglie, come indicato (Figura 3E-2). Inserire un tubo bevitore nella staffa per premere saldamente il nastro contro la parete e preparare la staffa.
   7. Per rinforzare il lato con la saldatura del nastro di rame, che è meno adesivo e tende a staccarsi, applicare una goccia di colla a caldo sulla saldatura (Figura 3E-3). Spalmare la colla in modo da coprire sia il nastro di rame che qualsiasi porzione adiacente esposta della stampa 3D (Figura 3E-4).
   8. Fare passare il cavo attraverso il passaggio interno del proteggi-cavo (Figura 3F). Assicurarsi di selezionare il proteggi-cavo corretto (orientato a sinistra o a destra) per ciascun liceometro al fine di utilizzare la configurazione del vivario suggerita (vedere punto 3.6 e Figura 6). NOTA: I liceometri 5-6, 11-12 e 17-18, rappresentati con cavi di colore blu o viola nella configurazione attuale, richiedono un proteggi-cavo orientato a sinistra (Figura 4D-1), mentre tutti gli altri liceometri richiedono un proteggi-cavo orientato a destra (Figura 4D-2).
   9. Per installare la clip del cavo, inserire prima un filo nella scanalatura di una metà della clip (Figura 3G-1), quindi posizionare l'altra metà sopra il secondo filo e chiudere saldamente entrambe le metà con il dado (Figura 3G-2).
   10. Etichettare il connettore maschio con il numero ID corrispondente del liceometro (Figura 3H). Ripetere questi passaggi finché non sono stati costruiti tutti e 18 i liceometri.
4. Installazione dei liceometri LIQ HDR
   NOTA: LIQ HDR è progettato per essere installato su una gabbia standard per ratti tipo "shoebox" con coperchio in rete metallica (Figura 4A-1).
   1. Individuare due coppie di aste con una distanza centro-centro di circa 75 mm sul coperchio in rete metallica della gabbia, in modo da ospitare il supporto per bottiglie. Utilizzare una pinza per aprire leggermente le aste metalliche intorno alle aperture del tubo bevitore. Isolare queste aste con nastro isolante per evitare contatti metallo-metallo tra i tubi bevitore e il coperchio della gabbia (Figura 4A-2).
      NOTA: Sebbene il nastro isolante non sia accessibile ai ratti e quindi non soggetto a masticamento, si raccomanda di smaltirlo alla fine dello studio e di non riutilizzarlo tra studi diversi.
   2. Installare il liceometro e il pannello in acrilico laserato spesso 1/8 di pollice sul coperchio della gabbia utilizzando due set di viti e dadi M5 (Figura 4B). Assicurarsi che le aperture per i tubi bevitore del liceometro e del pannello in acrilico siano allineate e che i tubi bevitore non siano a contatto con alcuna parte del coperchio della gabbia.
   3. Fissare la clip del cavo all'asta più esterna (~4 mm di diametro) del coperchio in rete metallica (Figura 4C). Regolare la clip del cavo se necessario per assicurarsi che il coperchio della gabbia poggi saldamente sul fondo della gabbia e che il cavo non sia sottoposto a trazione eccessiva. Assicurarsi di utilizzare il proteggi-cavo corretto per ciascun liceometro (Figura 4D e vedere punto 3.8.8).
   4. Regolare i tubi bevitore secondo necessità in modo che solo circa 2 cm del tubo sporgano dal tappo (Figura 4E-1). Per installare le bottiglie, inserire il tubo bevitore nella staffa del supporto per bottiglie fino a quando non si arresta (Figura 4E-2). Solo la punta del tubo bevitore dovrebbe sporgere oltre il pannello in acrilico (Figura 4E-3). È fondamentale che nessun'altra parte del tubo bevitore sia esposta per evitare falsi positivi nei lecchii dovuti a comportamenti non consumatori, come il ratto che tocca o gioca con il tubo bevitore. Un filtro superiore dovrebbe poter poggiare saldamente sul coperchio in rete metallica e sulla clip del cavo senza disturbare il cavo stesso (Figura 4F).
      NOTA: Un pannello in acrilico più spesso o un impilamento di più pannelli da 1/8 di pollice può essere utilizzato per racchiudere completamente tubi bevitore più lunghi in esperimenti che richiedono una maggiore estensione del tubo all'interno della gabbia, ad esempio quando si misura il consumo di liquidi in ratti giovani che potrebbero avere difficoltà a raggiungere un tubo bevitore corto.
5. Installazione e utilizzo dei blocchi per tubi bevitore
   ​NOTA: Il blocco per tubo bevitore (Figura 5A) è progettato per limitare l'accesso del ratto al tubo bevitore durante il cambio delle bottiglie e per garantire una calibrazione accurata del liceometro all'inizio di ogni sessione di consumo.
   1. Raccogliere le parti stampate in 3D e una vite, un dado e una rondella M5 per un blocco per tubo bevitore come mostrato in Figura 5B.
   2. Inserire il SIPPER_Gear nel SIPPER_Base (Figura 5C-1). Assicurarsi che il SIPPER_Gear sia orientato esattamente come mostrato nell'insetto della rappresentazione 3D. Inserire il SIPPER_Worm nell'apertura superiore del SIPPER_Base. Ruotare il verme in senso orario durante l'inserimento finché la testa non è a filo con la base (Figura 5C-2).
   3. Avvitare il SIPPER_Nut all'estremità del verme dal lato inferiore della base (Figura 5C-3). Usare la pinza per stringere il dado mentre si ruota la manopola del verme. Inserire i colli rotondi e stretti dei SIPPER_Blockers nelle fessure dell'ingranaggio (Figura 5C-4).
   4. Installare il blocco per tubo bevitore assemblato sul coperchio della gabbia utilizzando il set di viti M5 (Figura 5D). Assicurarsi che entrambi i blocchi per tubi bevitore siano allineati con le aperture dei tubi bevitore.
   5. Per bloccare l'accesso ai tubi bevitore, ruotare la manopola del verme in senso orario per abbassare i blocchi finché non coprono completamente le aperture dei tubi bevitore (Figura 5E).
   6. Per consentire l'accesso ai tubi bevitore, ruotare la manopola in senso antiorario finché i blocchi non sono in posizione verticale, perpendicolari al coperchio della gabbia (Figura 5F-1). Tirare manualmente verso l'alto ciascun braccio del blocco finché le teste non sono appena sotto il coperchio in rete metallica. Ruotare i blocchi di 90° in modo che le teste siano parallele alle aste metalliche del coperchio e i bracci siano bloccati in posizione (Figura 5F-2). Continuare a ruotare la manopola in senso antiorario finché entrambi i blocchi non sono sollevati sopra il coperchio della gabbia (Figura 5F-3) e i tubi bevitore sono completamente accessibili (Figura 5F-4).
6. Utilizzo del sistema LIQ HDR nel vivario
   NOTA: La seguente configurazione del vivario è ottimizzata per registrare il consumo in regime di scelta tra due bottiglie, utilizzando un'unica interfaccia del microcontrollore collegata a 18 gabbie standard per ratti tipo "shoebox". Tutti i componenti elettronici, inclusi l'interfaccia del microcontrollore, le unità del sensore e i vari cavi, sono fissati a scaffalature in rete metallica montate a parete che sostengono le gabbie (Figura 6A). Potrebbero essere necessarie alcune modifiche per adattarsi alle strutture per animali e alle esigenze dell'utente.
   1. Montare ciascuna unità del sensore sugli scaffali del vivario utilizzando la vite di montaggio personalizzata stampata in 3D (Figura 6B). Assicurarsi che ciascuna unità del sensore sia montata direttamente sotto la gabbia con il liceometro di colore giallo per evitare tensioni eccessive sui cavi (Figura 6A).
   2. Disporre e fissare ciascun cavo del connettore femmina assicurandosi che non si sovrappongano tra loro né si pieghino eccessivamente alle estremità saldate, il che potrebbe causare una rilevazione imprecisa dei lecchii (Figura 6B). Se si utilizzano scaffali in rete metallica, ciò può essere facilmente ottenuto legando i cavi dei connettori a aste separate dello scaffale come mostrato.
   3. Montare l'interfaccia del microcontrollore accanto all'unità del sensore A utilizzando la stessa vite di montaggio stampata in 3D e collegare il suo connettore a 4 pin alla porta di ingresso a 5 V dello shifter da 5 V a 3 V collegato all'unità del sensore A (Figura 6C).
   4. Utilizzare nastro isolante per fissare il filo di messa a terra aggiuntivo a una massa, ad esempio la struttura in metallo (Figura 6D).
   5. Disporre ciascuna gabbia in base al colore e all'ID del liceometro installato, come mostrato in Figura 6A, per minimizzare sovrapposizioni e tensioni sui cavi.
   6. Collegare saldamente tutti i cavi dei connettori maschio dei liceometri ai corrispondenti cavi dei connettori femmina del sensore (Figura 6E). Collegare l'alimentazione per accendere l'interfaccia del microcontrollore (Figura 6F).
   7. Sulla pagina principale dell'interfaccia grafica (GUI) (Figura 6G), toccare il Simbolo delle Impostazioni per aprire la pagina delle Impostazioni.  Gli utenti possono modificare gli orari di accensione e spegnimento delle luci in base al programma del vivario, in modo che il display dell'interfaccia si attenui automaticamente all'inizio del ciclo scuro (Figura 6H-1).
   8. Toccare Modifica Impostazioni Sensore (Figura 6H-1) per regolare la Soglia di Contatto a 8 e la Soglia di Rilascio a 2, valori che abbiamo trovato ottimali per una rilevazione dei lecchii più costante nei ratti con la configurazione attuale (Figura 6H-2). Tuttavia, gli utenti potrebbero dover sperimentare con impostazioni diverse se vengono introdotte modifiche al sistema attuale.
   9. Deselezionare Calibrazione Automatica se i dati vengono raccolti solo per un periodo di 24 ore o inferiore (Figura 6H-2).

4. Procedure giornaliere per il test di scelta di due bottiglie con rilevazione delle leccate nel box di mantenimento

1. Seguire i passaggi descritti al punto 2 per le procedure standard di scelta tra due bottiglie, con le seguenti modifiche.
2. Lunedì, mercoledì e venerdì, prima di posizionare le bottiglie MWF, utilizzare i tappi per beccucci per coprire le aperture dei beccucci su tutte le gabbie (vedere passaggio 3.5.5 e Figura 5E).
3. Prima della registrazione, selezionare l'opzione corretta Lato sperimentale sulla pagina principale dell'interfaccia grafica utente (GUI), che sarà il lato della bottiglia di EtOH per quel giorno (Figura 6G).
4. Dopo aver installato tutte le bottiglie di MWF, toccare INIZIO! sulla pagina principale (Figura 6G) per iniziare la calibrazione dei sensori, durante la quale si raccomanda agli utenti di allontanarsi di un passo dal sistema e di assicurarsi che i ratti non stiano leccando le cannucce (Figura 6I-1). La calibrazione richiede alcuni secondi per completarsi, dopo di che il sistema accede alla pagina principale di registrazione, che mostra il numero cumulativo di leccate su ciascuna bottiglia per ogni lickometroFigura 6I-2).
5. Sollevare tutti i blocchi dei beverini al di sopra del coperchio della gabbia per consentire l'accesso ai beverini (vedere il punto 3.5.6 e Figura 5F) e riposizionare delicatamente tutti i coperchi dei filtri come descritto (vedi passaggio 3.4.4 e Figura 4F).
6. Toccare Aggiorna per aggiornare il numero di leccate sullo schermo, che non si aggiorna in tempo reale autonomamente (Figura 6I-2).
7. Il martedì, il giovedì e il sabato, premere Salva & Esci per interrompere la registrazione e tornare alla pagina principale (Figura 6I-2) prima di rimuovere le bottiglie di MWF.
8. Per rimuovere la scheda SD per il trasferimento dei dati, toccare Espelli SD prima di scollegare la scheda SD (Figura 6G). Inserire la scheda SD in un qualsiasi computer e copiare/incollare il file di dati .csv, denominato in base alla data di accensione della bottiglia, su quel computer (Figura 6K). Per rimontare la scheda SD per la registrazione successiva, inserire la scheda nell'interfaccia e toccare Montaggio SD (Figura 6J).
   NOTA: Si raccomanda di eseguire il backup dei file di dati quotidianamente.
9. È consigliabile limitare le misurazioni del peso corporeo a una volta alla settimana, laddove compatibile con il modello animale e il protocollo di utilizzo degli animali, eseguendo questa operazione nel giorno stabilito per il cambio della gabbia, al fine di ridurre al minimo il disturbo non necessario ai lickometri e ai sensori. Scollegare tutti i cavi maschili dei lickometri dai corrispondenti cavi femmina dei sensori prima di spostare le gabbie. Dopo aver pesato ciascun ratto, riposizionarlo in una gabbia pulita. Trasferire il lickometro su un nuovo coperchio di gabbia e ricollegare ciascun lickometro al sensore corrispondente, quando necessario.
10. Per esperimenti volti a testare l'effetto di un intervento (ad es. iniezione di un farmaco) sull'assunzione di EtOH e sulla microstruttura della bevuta, programmare tali interventi prima dell'inizio della sessione di bevuta ogni volta che possibile. Nei casi in cui ciò non sia possibile, i ricercatori possono interrompere il rilevamento dei licks mediante un tocco leggero Pausa (Figura 6I-2) e riprendere l'acquisizione dei dati toccando Riassunto dopo il completamento dell'intervento. Si consiglia di raccogliere i pesi delle bottiglie durante ogni pausa della sessione di consumo al fine di monitorare le variazioni nell'assunzione di EtOH prima e dopo l'intervento, nonché per tenere conto di eventuali versamenti che potrebbero verificarsi durante la rimozione del coperchio della gabbia per accedere all'animale.
11. Al termine dello studio, tutti i componenti all'interno della gabbia devono essere disinfettati accuratamente prima di essere utilizzati con nuovi animali, al fine di limitare la trasmissione di contaminanti tra gli animali. Si raccomanda di spruzzare delicatamente e pulire il lickometro con una soluzione di EtOH al 70%, avendo cura di non danneggiare i componenti elettrici interni. Il bloccatore del beccuccio e il pannello in acrilico possono essere lavati con acqua calda e sapone.

5. Analisi dei dati

1. Prima di valutare le misure dipendenti, correggere i dati di assunzione per la fuoriuscita inevitabile che si verifica durante la sostituzione quotidiana delle bottiglie. A tale scopo, calcolare la media della variazione del peso delle bottiglie di EtOH e di H₂O nella gabbia di fuoriuscita durante l'intero periodo dello studio.
2. Escludere tutti i valori superiori a due deviazioni standard rispetto alla media per ciascuna bottiglia. Dopo aver escluso questi dati anomali, sottrarre le medie calcolate dalle variazioni di peso delle bottiglie di EtOH e H₂O ottenute dalle gabbie contenenti gli animali. Sottraendo questa quantità, i ricercatori possono essere certi che la perdita media dovuta alla fuoriuscita di una determinata soluzione non venga considerata nelle misure di consumo. La sottrazione della quantità media di fuoriuscita può portare a valori negativi per alcuni animali in alcune occasioni. Convertire questi valori a zero e interpretarli come assenza di assunzione per quella soluzione.
3. Le misure dipendenti principali negli esperimenti di scelta tra due bottiglie sono l'assunzione di EtOH (g/kg) e la preferenza (%). Calcolare l'assunzione dalla variazione del peso della bottiglia di EtOH (g) e normalizzarla rispetto al peso corporeo (kg) seguendo i passaggi indicati di seguito.
   1. Convertire la variazione del peso della bottiglia (g) in variazione di volume (mL) utilizzando l'equazione seguente:
      
      La densità dell'etanolo puro è 0,789 g/mL. Pertanto, la densità contributiva dell'EtOH al 20% è 0,1578 g/mL. L'H₂O pesa 1 g/mL. Di conseguenza, la densità contributiva dell'80% di H₂O = 0,80 g/mL. Di conseguenza, ogni mL di una soluzione al 20% di EtOH (v/v) è composto da 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL. L'equazione finale, quando si utilizza una concentrazione di EtOH al 20% (v/v), è quindi la seguente:
      
   2. Calcolare la dose di etanolo consumata utilizzando l'equazione riportata di seguito. Utilizzare i pesi corporei ottenuti nella stessa settimana dei dati di assunzione per calcolare l'etanolo consumato in relazione al peso corporeo dell'animale.
      
   3. Calcolare la preferenza utilizzando l'equazione seguente:
      
4. Come il suo corrispettivo nei topi³⁰, LIQ HDR acquisisce una varietà di variabili della microstruttura del bere, inclusi la durata delle leccate, il numero di episodi, la durata degli episodi, il numero di leccate per episodio e la durata delle leccate per episodio (Figura 6K). Un episodio di bere è definito come una serie di leccate che inizia con almeno 3 leccate effettuate in meno di 1 secondo e termina dopo che sono trascorsi 3 secondi senza ulteriori leccate. Queste misure possono quindi essere utilizzate per calcolare la durata media delle singole leccate, la durata media dei singoli episodi, il numero medio di leccate per episodio, la frequenza media delle leccate, l'intervallo stimato tra una leccata e l'altra e l'intervallo stimato tra un episodio e l'altro.
   NOTA: L'interfaccia del microcontrollore fornisce questi dati di microstruttura con una risoluzione di 1 minuto in un file .csv (Figura 6K). I ricercatori possono utilizzare l'applicazione di analisi fornita con il protocollo originale LIQ HD³⁰ o la piattaforma di post-elaborazione di loro scelta per raccogliere e riassumere i dati in base alle esigenze di ricerca. I dati di microstruttura vengono generalmente sommati sull'intero periodo di 24 ore per confrontare le differenze medie a livello macroscopico, oppure in intervalli di 30 minuti fino a 1 ora per esaminare le variazioni del modello di consumo durante il ciclo luce-buio.

Risultati

Dati standard di consumo di EtOH in gabbia domiciliare con scelta intermittente tra due bottiglie
Utilizzando la procedura standard (Figura 7A), i ricercatori possono registrare l'assunzione nelle 24 ore (Figure 7B-D) così come il consumo di tipo binge, qualora i pesi delle bottiglie vengano rilevati poco dopo l'inizio della sessione di assunzione (Figure 7E-F). Calcolando l'assunzione di etanolo in rapporto a quella dell'acqua, i ricercatori possono inoltre ottenere dati sulle preferenze in tutti i punti temporali misurati (Figure 7D,F). Come mostrato nella Figura 7C, i ratti spesso mostrano un periodo di aumento dell'assunzione di etanolo durante i primi giorni di accesso con scelta tra due bottiglie. Questo è seguito da una fase di plateau in cui l'assunzione rimane relativamente stabile. Sebbene questo andamento sia osservato in modo costante nei ratti maschi^{7,32,33,34,35,36}, non sempre si osserva nelle femmine. Al contrario, alcuni studi riportano livelli stabili di assunzione di etanolo per tutta la durata dello studio nelle ratti femmine^37,38. Inoltre, alcuni studi suggeriscono che l'assunzione di etanolo possa aumentare ulteriormente con periodi di accesso più prolungati^36,39. L'assunzione giornaliera può variare notevolmente tra individui. Tuttavia, l'assunzione media giornaliera è stata ben caratterizzata per i ceppi più comunemente utilizzati nella ricerca sull'alcol e può essere utilizzata come parametro di riferimento per il successo quando si analizzano dati raggruppati^{7,8,33,34,35,39}.

Come mostrato in Figura 7E, molti ratti assumono una parte significativa del loro consumo giornaliero di etanolo poco dopo l'inizio della sessione di bevuta^8,33. Questo modello di assunzione di etanolo simile a un'abbuffata è spesso associato a una marcata preferenza per l'etanolo rispetto all'acqua (Figura 7F). Tuttavia, i ricercatori non dovrebbero sorprendersi se la preferenza nelle 24 ore non supera il 50%. Questo è particolarmente vero per ceppi di roditori outbred o non preferenti per l'alcol e per studi limitati a periodi relativamente brevi di accesso alla scelta tra due bottiglie^{7,32,33,35,37}.

Convalida del sistema LIQ HDR per l'analisi della microstruttura del consumo in un paradigma di scelta tra due bottiglie
L'aggiunta del sistema LIQ HDR al tradizionale paradigma di scelta tra due bottiglie nel ratto consente ai ricercatori di prevedere con precisione e accuratezza l'assunzione di liquido sulla base dei dati registrati sul consumo. Questo risultato è confermato dalla presenza di una correlazione forte e significativa tra il numero cumulativo di leccate rilevate e la variazione del peso delle bottiglie sia per la bottiglia contenente EtOH (R² = 0.7789, F_(1,113) = 398.1, p < 0.0001) che per quella contenente H₂O (R² = 0.7910, F_(1,117) = 442.9, p < 0.0001) durante un periodo di 24 ore (Figura 8A). Tale correlazione si osserva anche nei giorni in cui ai ratti vengono somministrate due bottiglie contenenti H₂O (R² = 0.8875, F_(1,188) = 1484, p < 0.0001; Figura 8B).

LIQ HDR permette anche un'analisi precisa dei modelli di consumo di bevande con un'elevata risoluzione temporale, che non è ottenibile con il paradigma standard della scelta tra due bottiglie. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono esaminare le differenze nei modelli di consumo tra diverse soluzioni, durante il ciclo luce-buio, tra i sessi, tra gruppi farmacologici e altro ancora. Ad esempio, suddividendo le leccate medie in intervalli di 30 minuti è possibile analizzare facilmente i modelli medi di consumo nelle 24 ore. Come previsto, questa analisi rivela un consumo significativamente maggiore sia di EtOH che di H₂O durante il ciclo scuro, quando i ratti sono svegli, rispetto al ciclo luminoso, quando i ratti sono solitamente addormentati (Figura 8C). Utilizzando un approccio simile, i ricercatori possono esplorare le differenze tra gruppi nei modelli di consumo. Per esempio, la microstruttura del consumo può essere confrontata tra ratti maschi e femmine analizzando il numero medio di leccate per EtOH (Figura 8D) o per acqua (Figura 8E) nell'arco di 24 ore. Per indagare il consumo iniziale intenso (front-loading) e/o modelli di consumo simili a binge, i ricercatori possono aumentare la risoluzione dell'analisi concentrandosi sul consumo avvenuto subito dopo l'inizio della sessione, utilizzando finestre di tempo più piccole per riassumere i dati. Questo consente di studiare periodi di consumo simili a binge senza dover raccogliere più pesi delle bottiglie nell'arco di 24 ore. Come mostrato nell'Figura 8C (insetto), questa analisi rivela che la maggior parte del consumo registrato da un peso della bottiglia ottenuto 30 minuti dopo l'inizio della sessione avviene nei primi 5 minuti, piuttosto che distribuirsi uniformemente nei 30 minuti. Dati di questo tipo possono aiutare nell'identificazione dei punti temporali ottimali per il prelievo di campioni ematici al fine di misurare la concentrazione ematica di etanolo (BEC). Effettivamente, un modello simile di front-loading è stato osservato in un altro giorno di consumo durante il quale i modelli di consumo ad alta risoluzione sono stati registrati in un periodo breve come 15 minuti (Figura 8F). Le leccate medie registrate durante questa sessione hanno predetto in modo affidabile la variazione del peso della bottiglia (EtOH: R² = 0.6316, F_(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H₂O: R² = 0.8601, F_(1,10) = 61.47, p < 0.0001; Figura 8G). Inoltre, le BEC ottenute da campioni ematici prelevati 15 minuti dopo l'inizio della sessione hanno mostrato una buona correlazione con il numero di leccate rilevate (R² = 0.4327, F_(1,10) = 7.627, p = 0.0201; Figura 8H), anche per livelli relativamente bassi di consumo di EtOH.

LIQ HDR acquisisce diverse misure della microstruttura del bere che vengono rilevate e calcolate in tempo reale durante le sessioni di assunzione e salvate in intervalli di 1 minuto, in modo analogo al rilevamento dei colpi di lingua (Figura 6K). Queste misure sono brevemente descritte al punto 5.4 e sono state definite in precedenza³⁰. I ricercatori possono effettuare analisi dettagliate delle variazioni nella microstruttura individuale del bere ed esaminare come e in quale misura i modelli di assunzione contribuiscono alle differenze nell’assunzione totale. Ad esempio, abbiamo osservato che, sebbene ratti maschi e femmine presentino un numero simile di colpi di lingua, episodi di assunzione e durata degli episodi (Figura 9A-C) durante il consumo di acqua, ciò si associa a un’assunzione complessiva maggiore (g/kg) nelle femmine rispetto ai maschi (test t; t=2.882, df=10, p=0.0163; Figura 9D). Tale risultato era atteso, considerando il dimorfismo sessuale nel peso corporeo, che consente alle femmine di assumere una quantità maggiore in base al peso corporeo rispetto ai maschi per un numero equivalente di colpi di lingua. In modo sorprendente, questo risultato contrasta con il confronto delle differenze di sesso nei modelli di microstruttura per l’EtOH, che ha rivelato una microstruttura del bere simile associata a livelli simili di assunzione di EtOH (Figure 9E-H). Questi dati suggeriscono che, sebbene il volume per singolo colpo di lingua per l’acqua sia simile tra i sessi, rispetto ai maschi, i ratti femmine abbiano un volume per colpo di lingua inferiore per l’EtOH. Nel complesso, questi dati microstrutturali supportano l’ipotesi che ratti maschi e femmine possano differire nelle strategie di assunzione volontaria in base al tipo di liquido consumato nell’ambiente della gabbia. Studi precedenti hanno inoltre riportato differenze di sesso nelle strategie di assunzione dipendenti dal tipo di liquido^40,41, anche se le differenze osservate in tali studi non erano limitate esclusivamente al consumo di acqua. La durata della storia di assunzione potrebbe influenzare le differenze osservate tra gli studi, poiché nel presente set di dati il consumo in condizione di scelta tra due bottiglie è stato limitato a 5 settimane, mentre in lavori precedenti superava le 12 settimane^40,41.

Figura 1: Consumo in gabbia domestica con scelta tra due bottiglie. (A) I ricercatori possono misurare l'assunzione volontaria di etanolo in gabbia domestica e la preferenza (rispetto all'acqua) utilizzando un approccio standard che calcola l'assunzione in base alla variazione del peso delle bottiglie. (B) Utilizzando LIQ HDR, un sistema fai-da-te economico per il rilevamento dei lecchii in gabbia domestica progettato per i ratti, i ricercatori possono ottenere le stesse misure del procedimento standard con scelta tra due bottiglie, registrando contemporaneamente la microstruttura del consumo con elevata risoluzione per tutto il periodo di registrazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Costruzione delle unità sensoriali a capacità. (A) Componenti elettronici e schema di collegamento. (B) Materiali necessari per costruire tre unità sensoriali a capacità richieste per realizzare un sistema LIQ HDR. (C) Saldare i cavi con connettori femmina a 2 pin per le gabbie n. 1-6 ai pin n. 0-11 della scheda A e fissare le saldature con colla termofusibile. Codificare i cavi con guaine termoretraibili colorate ed etichettare ciascuno con un numero ID univoco del lickometro. (D) Collegare la scheda A e lo shifter di livello da 5V a 3V a un terminale di comunicazione differenziale I²C (EndPoint) mediante cavi a 4 pin (1), quindi alloggiare la scheda A e il terminale di comunicazione all'interno del contenitore stampato in 3D (2-3). (E) Modificare gli indirizzi I²C delle schede B e C saldando un ponticello dal pin ADDR rispettivamente ai pin 3Vo e SDA. (F) Saldare i cavi con connettori femmina a 2 pin alle schede sensoriali B e C, etichettarle con i corrispondenti ID del lickometro e collegare la scheda B a un terminale di comunicazione MidPoint e la scheda C a un EndPoint mediante cavi a 4 pin. (G) Alloggiare le unità sensoriali B e C nei rispettivi contenitori stampati in 3D e collegarle in cascata insieme all'unità A mediante cavi Ethernet. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Assemblare il lickometro LIQ HDR. (A) Rappresentazione 3D dei componenti da inserire nella gabbia. (B) Materiali necessari per configurare un lickometro a due bottiglie. Si noti che un sistema LIQ HDR può ospitare 18 lickometri a due bottiglie. (C) Prolungare la lunghezza del cavo del connettore maschio a 2 pin con un paio di fili nero e rosso e codificarli con guaine termoretraibili. (D) Far passare i fili nero e rosso attraverso le aperture sinistra (L) e destra (R) del supporto per bottiglie (1) e saldare le estremità alle strisce di rame (2-3). (E) Applicare le strisce di rame alle pareti interne dei supporti per beccucci (1-2) e rinforzarle con colla a caldo (3-4). (F) Far passare il cavo attraverso il proteggi-cavo. (G) Installare la clip per il cavo. (H) Etichettare il connettore con il numero identificativo corrispondente del lickometro. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Installazione del lickometro. (A) Utilizzare nastro isolante per isolare le barre metalliche intorno alle aperture dei beccucci sul coperchio metallico della gabbia. (B) Fissare il lickometro e il pannello in acrilico al coperchio della gabbia utilizzando due coppie di viti e dadi M5. (C) Fissare il bloccacavo alla barra più esterna del coperchio a rete metallica. (D) Assicurarsi di utilizzare il proteglicavo appropriato (sinistro L o destro R) per ogni gabbia. (E) Assicurarsi che sia esposta solo circa ~2 cm delle cannule delle bottiglie (1), in modo che, quando le bottiglie vengono posizionate sulla gabbia (2), solo le estremità più esterne delle cannule sporgano oltre il pannello in acrilico ed siano accessibili ai ratti. (F) Il coperchio del filtro deve adattarsi sopra il bloccacavo senza disturbare il cavo stesso. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Installazione e utilizzo del bloccasucchiotto. (A) Rappresentazione tridimensionale del bloccasucchiotto. (B) Parti personalizzate stampate in 3D per un bloccasucchiotto. (C) Assemblare le parti stampate in 3D. (D) Installare il bloccasucchiotto assemblato sul coperchio della gabbia utilizzando una vite M5 + dado + rondella. (E) Ruotare la manopola in senso orario per bloccare l'accesso ai succhietti. (F) Ruotare la manopola in senso antiorario per rimuovere i blocchi dai succhietti (1), sollevare i blocchi e ruotarli di 90° (2), quindi continuare a ruotare la manopola in senso antiorario finché i blocchi non siano al di sopra del coperchio della gabbia (3-4). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Configurazione del vivarium e funzionamento dell'interfaccia grafica (GUI). (A) Impostazione consigliata del vivarium e schema elettrico (B) Montare ogni unità sensoriale sugli scaffali e disporre e stabilizzare i cavi dei sensori sugli scaffali. (C) Montare l'interfaccia del microcontrollore sugli scaffali e collegare il suo jumper a 4 pin al convertitore di livello da 5 V a 3,3 V collegato all'unità del sensore A. (D) Fissare il filo di terra aggiuntivo con del nastro isolante. (E) Collegare i cavi del sensore ai rispettivi cavi del lickometro. (F) Collegare l'alimentatore per accendere l'interfaccia del microcontrollore. (G) Pagina principale dell'interfaccia GUI. (H) Toccare Impostazioni per regolare l'orario di accensione/spegnimento delle luci secondo il programma luminoso del vivario (1) e toccare Impostazioni del sensore per regolare le soglie di contatto e di rilascio per i ratti (2). (I) Per registrare i dati, selezionare il lato della bottiglia di EtOH nella pagina principale, battere leggermente INIZIA! per calibrare i sensori (1) e iniziare la registrazione (2). Toccare Aggiorna per aggiornare il numero di leccate visualizzato sullo schermo e toccare Salva & Esci per interrompere la registrazione. (J) Toccare Espellere la scheda SD nella pagina principale per rimuovere la scheda SD e trasferire i dati. Toccare Montaggio SD dopo aver inserito la scheda SD. (K) Screenshot di un file di dati grezzi rappresentativo che illustra come i dati sulla microstruttura vengano salvati in intervalli di 1 minuto tramite l'interfaccia del microcontrollore Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Dati rappresentativi del consumo nel test della scelta tra due bottiglie ottenuti mediante la procedura standard. Nel paradigma intermittente di accesso al consumo di EtOH in gabbia domiciliare con scelta tra due bottiglie, (A) i ratti ricevono una soluzione di EtOH al 20% (v/v) (arancione) e H₂O (blu) il lunedì, mercoledì e venerdì (LMV), e due bottiglie contenenti H₂O rispettivamente il martedì, giovedì e nei fine settimana. (B) Le misurazioni dell'assunzione giornaliera di liquidi mostrano che, sebbene i ratti mantengano un livello relativamente costante di assunzione totale di liquidi (mL) durante tutto il periodo dello studio, (C) spesso si osserva un aumento dell'assunzione di EtOH nelle prime sessioni di consumo, dopo le quali i livelli si stabilizzano. (D) Questo andamento di aumento e mantenimento si riflette in modo analogo nella preferenza per l'EtOH. I ricercatori possono inoltre rilevare un consumo di tipo binge di EtOH (E) se i pesi delle bottiglie vengono registrati dopo i primi 30-60 minuti dall'inizio della sessione. (F) Ciò è spesso associato a una elevata preferenza per l'EtOH rispetto all'H₂O. Le barre di errore ombreggiate rappresentano ± SEM (n = 32 per i maschi e n = 16 per le femmine). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: LIQ HDR cattura con precisione il consumo con elevata risoluzione temporale. La precisione e l'accuratezza del sistema LIQ HDR sono confermate, in parte, dalla presenza di una correlazione positiva significativa tra il numero di leccate e la variazione del peso della bottiglia nei giorni in cui i ratti ricevono (A) H₂O ed EtOH, nonché (B) nei giorni in cui entrambe le bottiglie contengono H₂O. (C) Le differenze nei modelli di assunzione tra H₂O (blu) ed EtOH (arancione) nell'arco delle 24 ore possono essere facilmente valutate raggruppando le leccate medie in intervalli di 30 minuti. L'ingrandimento mostra le leccate medie in intervalli di 5 minuti durante i primi 30 minuti di accesso alle bottiglie (evidenziati in grigio), periodo in cui i ratti spesso mostrano un comportamento di "front-loading" significativo. Le differenze tra gruppi nei modelli di assunzione possono essere analizzate anche con un approccio simile, come illustrato dalla microstruttura delle leccate per (D) EtOH e (E) H₂O, riportata per ratti maschi e femmine nell'arco di 24 ore. (F) I modelli di assunzione possono essere valutati anche con elevata risoluzione temporale in un periodo di prova più breve, (G) durante il quale LIQ HDR continua a monitorare con precisione l'assunzione e (H) a prevedere la concentrazione ematica di etanolo (BEC), anche per livelli relativamente bassi di assunzione di EtOH. Le barre di errore ombreggiate rappresentano ± SEM (n = 6 per ciascun sesso). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Dati rappresentativi della microstruttura del bere. LIQ HDR consente di rilevare parametri della microstruttura del bere, inclusi (A) il numero di leccate, (B) il numero di episodi di assunzione di liquidi e (C) la durata degli episodi, oltre a (D) misurare l'assunzione totale di acqua tramite la variazione del peso della bottiglia. (E-H) Misure simili possono essere ottenute per l'etanolo. Il confronto tra gruppi di questi parametri può identificare pattern distinti di assunzione di liquidi, come nel caso dell'esempio attuale, che evidenzia differenze legate al sesso nelle strategie di assunzione in base alla soluzione consumata. La linea continua indica la mediana, mentre le linee tratteggiate indicano i quartili (n = 6 per ciascun sesso); test t non appaiato; *p < 0,05. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Configurazione dell'interfaccia del microcontrollore. (A) Componenti elettronici e schema di collegamento. (B) Materiali necessari per costruire l'interfaccia del microcontrollore richiesta per un sistema LIQ HDR. (C) Sul lato posteriore dello schermo capacitivo touch, aggiungere un ponte saldato tra i pad di saldatura per l'illuminazione di fondo. (D) Sul lato posterio dello schermo per la registrazione dati, interrompere la traccia del pad jumper del pin CS (1). Saldare un filo ponticello dal pin CS al pin #7 (2). (E) Saldare i pin di collegamento allo shield per la registrazione dati utilizzando lo schermo touch come base. (F) Montare il connettore 2x4 rimanente sul microcontrollore (1), posizionare lo shield per la registrazione dati sul microcontrollore e saldare il connettore al suo posto (2). (G) Inserire la batteria a bottone nello shield per la registrazione dati (1), posizionare lo schermo touch sullo shield e inserire la scheda SD nello shield (2). (H) Per realizzare il filo di massa aggiuntivo, tagliare un connettore maschio dal filo ponticello e saldare l'estremità a un filo rigido sguainato. (I) Collegare i fili ponticello a 4 pin e il filo di massa aggiuntivo al microcontrollore (1) e fissarli con colla a caldo (2). (J) Posizionare l'interfaccia del microcontrollore all'interno della custodia personalizzata stampata in 3D. Cliccare qui per scaricare questo file.

Discussione

L'attuale protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'acquisizione dei dati relativi al consumo di etanolo utilizzando una procedura di scelta della gabbia domestica a due bottiglie ad accesso intermittente. Questo metodo può essere implementato con relativa facilità e con costi minimi o nulli o con la necessità di attrezzature di ricerca specializzate. Utilizzando le procedure fornite qui per la costruzione e l'implementazione di LIQ HDR - un sistema di rilevamento delle leccate per l'uso nei ratti - i ricercatori possono acquisire dati ad alta risoluzione sulla microstruttura del bere oltre alle misure standard di assunzione e preferenza.

Il programma di accesso intermittente descritto nell'attuale protocollo è una procedura ampiamente utilizzata in gran parte perché è ben noto per generare livelli più elevati di assunzione di etanolo rispetto a molti programmi alternativi di accesso all'etanolo. In effetti, ricerche precedenti hanno dimostrato che i ratti con accesso intermittente hanno un'assunzione media giornaliera di etanolo più elevata rispetto ai ratti con accesso continuo 24 ore su 24 ^6,7. Tuttavia, possono essere auspicabili diversi programmi di accesso all'etanolo a seconda della domanda di ricerca o di altri parametri di progettazione sperimentale. I ricercatori possono facilmente modificare il protocollo corrente per adattarsi a diversi orari (ad esempio, accesso continuo, bere al buio, ecc.) semplicemente cambiando l'orario e i giorni di accensione/spegnimento della bottiglia.

Sebbene il consumo di due bottiglie sia un paradigma relativamente semplice da implementare, possono sorgere problemi che possono compromettere la raccolta dei dati. È quindi fondamentale che gli sperimentatori ispezionino i dati su base giornaliera al fine di identificare rapidamente potenziali problemi. In particolare, i ricercatori dovrebbero prestare molta attenzione a cambiamenti molto grandi o molto piccoli nel peso delle bottiglie che possono essere indicativi di un sorso che perde o intasato, rispettivamente. Individuare tempestivamente i segnali di questi problemi può impedire l'esclusione dall'analisi di tutti i dati di un determinato argomento. Infatti, se i ricercatori notano cambiamenti drastici (o l'assenza di cambiamenti) nel peso della bottiglia in un periodo di 24 ore, un semplice passaggio a una nuova bottiglia può aiutare a confermare se una determinata bottiglia deve essere rimossa dalla circolazione. Per questi motivi, è consigliabile avere a portata di mano bottiglie e sorseggiatori extra. Tuttavia, va notato che alcuni ratti mostrano naturalmente livelli molto bassi di consumo di etanolo, ad esempio ³⁵. Ciò è particolarmente vero per i ratti di certi ceppi, vedi⁸ per una recensione. Pertanto, i ricercatori non dovrebbero allarmarsi se una piccola popolazione di animali in un determinato esperimento ha un consumo basso o nullo di etanolo. Allo stesso modo, alcuni animali sono inclini a giocare con il sorseggiatore/bottiglia in modi che possono favorire la fuoriuscita. Sebbene rari, casi ripetuti di elevate variazioni del peso della bottiglia che non sono associati al consumo possono richiedere che un particolare animale venga rimosso dall'esperimento.

Il nostro dettagliato protocollo passo-passo dimostra la facilità di implementazione e utilizzo del sistema LIQ HDR per i ratti. I ricercatori senza conoscenze o competenze pregresse nell'elettronica e nella programmazione dei microcontrollori possono facilmente adattare questo sistema alle loro esigenze sperimentali con poche o nessuna modifica. I nostri dati rappresentativi dimostrano ulteriormente la sua applicazione di successo per gli studi sull'abbeveraggio domestico in gabbia di ratto e la sua potente capacità di catturare numerose misure di microstruttura dell'acqua potabile ad alta risoluzione temporale. LIQ HDR include diverse modifiche al design rispetto al suo predecessore del mouse³⁰. Ciò è stato fatto non solo come necessità per il successo dell'adattamento per l'uso nei ratti, ma anche per migliorare la funzionalità e l'esperienza dell'utente. I componenti all'interno della gabbia, tra cui il portabottiglie stampato in 3D, il bloccante del sorso e i componenti elettronici, vengono riposizionati sulla parte superiore della gabbia per proteggerli dalla masticazione, che può comportare una perdita di dati frequente e significativa e un turnover dell'hardware. L'aggiunta di un pannello acrilico tagliato al laser aiuta ulteriormente a prevenire la distruzione di questi componenti vulnerabili. A parte il pannello acrilico, che è lo stesso materiale di una gabbia per topi standard per scatole da scarpe, tutti gli altri componenti LIQ HDR sono inaccessibili all'animale dall'interno della gabbia o accessibili solo per un breve momento durante il cambio della bottiglia. Questo design limita il potenziale di distruzione dei componenti del dispositivo e il rischio per l'animale attraverso l'ingestione di prodotti non alimentari. A differenza delle bottiglie su misura relativamente laboriose utilizzate nel design LIQ HD, il portabottiglie stampato in 3D di LIQ HDR è progettato per essere compatibile con le bottiglie per roditori commerciali pronte all'uso. Le bottiglie sono installate sulla parte superiore della gabbia e accessibili ai ratti in modo molto simile a come le bottiglie vengono applicate durante le cure e l'allevamento standard. L'aggiunta di bloccanti è una soluzione semplice ma efficace che migliora l'affidabilità del sistema e previene la perdita di dati preziosi che, in assenza del bloccante, può derivare dal consumo di alcol che si verifica prima di avviare l'acquisizione dei dati sull'interfaccia Arduino o da misure di leccamento errate che si verificano quando i ratti interagiscono con i sorseggiatori durante la calibrazione giornaliera. Mentre le gabbie per ratti considerevolmente più grandi richiedono un aumento delle dimensioni del design hardware originale, l'uso di cavi significativamente più lunghi può influire negativamente sulla sensibilità e sull'accuratezza del rilevamento capacitivo a causa delle interferenze, nonché sull'integrità della comunicazione I²C tra le schede dei sensori collegate a margherita e l'interfaccia Arduino. Aggiriamo questo problema con l'adozione del sistema di comunicazione differenziale I²C per ottenere una trasmissione del segnale a lunghissimo raggio e quasi senza perdite attraverso cavi Ethernet. I materiali utilizzati per i componenti all'interno della gabbia consentono una facile pulizia e disinfezione tra un utilizzo e l'altro. Il leccometro può essere sterilizzato e pulito con una soluzione di EtOH al 70%, mentre è necessario prestare attenzione per garantire che i componenti elettrici, come il nastro di rame conduttore, rimangano intatti. Le apparecchiature non elettriche che sono a diretto contatto con l'animale, come il bloccante e il pannello acrilico, possono essere lavate accuratamente con acqua tiepida e sapone.

L'affidabilità e l'efficacia di qualsiasi sistema di rilevamento delle leccate richiedono una costruzione e un'installazione adeguate, nonché test approfonditi, un monitoraggio diligente degli errori e un'efficace risoluzione dei problemi. Tutti i componenti fai-da-te devono essere realizzati e assemblati con abilità e cura. Ciò è particolarmente importante per le fasi che coinvolgono la saldatura, che possono richiedere pratica per i principianti. Indipendentemente da ciò, sono necessari test approfonditi di tutti i leccometri prima dell'uso negli esperimenti reali. Se il sistema deve essere modificato per adattarsi alle esigenze sperimentali individuali, potrebbe essere necessario regolare ulteriormente le impostazioni del sensore (ad esempio, le soglie di tocco e rilascio) per un rilevamento accurato del lick. Per gli utenti alle prime armi, suggeriamo di testare il sistema in un breve studio pilota su piccoli campioni utilizzando una soluzione altamente appetibile che genererà alti livelli di consumo. Il rilevamento delle leccate può essere verificato in tempo reale ispezionando visivamente la scheda del sensore poiché il LED lampeggia ogni volta che viene registrata una leccata. Correlazioni forti, significative e coerenti tra il numero di leccate e la variazione del peso della bottiglia dovrebbero essere utilizzate come punto di riferimento per una corretta configurazione hardware e software. Anche dopo che la configurazione è stata finalizzata, si consiglia di avviare la registrazione per un determinato esperimento in un giorno in cui i ratti ricevono due bottiglie contenenti acqua al fine di risolvere i problemi dell'apparecchiatura che possono essere evidenti all'inizio di un esperimento. Può anche essere vantaggioso testare la funzione del leccometro nel giorno dell'acqua associato al cambio della gabbia poiché ciò richiede che i leccometri siano scollegati e ricollegati al sensore. Il guasto casuale di un singolo leccometro o sensore, che comporterebbe dati anomali molto evidenti (ad esempio, nessuna o poche leccate rilevate nonostante una variazione sostanziale del peso della bottiglia) in modo coerente per lo stesso leccometro, è indicativo di componenti difettosi. Si consiglia di preparare in anticipo componenti aggiuntivi per ogni elemento del sistema lickometer per consentire una facile sostituzione, se necessario. Infine, l'importanza di assicurarsi che i cavi dei sensori non si sovrappongano o si pieghino eccessivamente non può essere sottovalutata. Ciò può comportare casi casuali di scarso rilevamento delle leccate, evidenti da un numero di leccate irragionevolmente basso per una data variazione del peso della bottiglia o da durate di leccate estremamente elevate (vicine a 60.000 ms per un contenitore da 1 minuto) che si estendono su minuti o ore. Tuttavia, piccole perdite di dati sono inevitabili negli studi che raccolgono dati nell'arco di 24 ore per molti animali per molti giorni utilizzando l'approccio standard o dotato di leccometro. I ricercatori possono escludere dati errati per le rare sessioni di consumo in cui i pesi e/o le leccate delle bottiglie non riflettono chiaramente l'assunzione (ad esempio, intasamento del sorso, errore di calibrazione, ecc.). In occasioni come queste, il valore medio per una determinata misura (ad esempio, assunzione (g/kg), leccate, ecc.) durante il periodo di studio per quel particolare soggetto può essere sostituito al valore mancante durante l'analisi dei dati. L'ANOVA a effetti misti può essere utilizzata anche come alternativa per gestire i punti dati mancanti.

Uno dei vantaggi del paradigma di consumo a scelta delle due bottiglie è l'aspetto volontario dell'assunzione di etanolo. Ciò offre un'eccellente validità apparente, in particolare alla luce dei risultati che dimostrano che l'alcol somministrato dallo sperimentatore può produrre effetti significativamente diversi sulla funzione cerebrale e sul comportamento rispetto all'alcol autosomministrato volontariamente⁴². Inoltre, la natura volontaria del paradigma consente ai ricercatori di catturare le differenze individuali nell'assunzione simili alla variabilità della preferenza per l'alcol e dei modelli di consumo osservati negli esseri umani. Queste differenze individuali possono fornire una potente opportunità per i ricercatori di correlare il consumo (assunzione e/o modelli) con l'entità degli effetti patologici osservati.

Tuttavia, è necessario considerare alcune limitazioni del paradigma del consumo in gabbia domestica a due bottiglie. Ad esempio, sebbene la variabilità individuale nell'assunzione di etanolo possa essere vantaggiosa per alcuni esperimenti, può essere uno svantaggio in altri esperimenti in cui può essere auspicabile un livello costante di intossicazione o esposizione all'etanolo. Ciò è particolarmente vero per gli esperimenti che esaminano le conseguenze della dipendenza e dell'astinenza dall'esposizione cronica all'etanolo. È importante sottolineare che il consumo di due bottiglie non è caratterizzato come un modello di dipendenza, anche nei ratti con accesso all'etanolo per periodi di tempo prolungati. Pertanto, in assenza di sintomi di astinenza, i ricercatori dovrebbero usare cautela nell'interpretare le conseguenze del consumo prolungato di etanolo come effetti della dipendenza e/o dell'astinenza. In effetti, è possibile, se non plausibile, che i ratti che bevono quantità relativamente elevate di etanolo durante la procedura di scelta delle due bottiglie mostrino sintomi di astinenza, ma che i ratti che bevono volumi totali inferiori in un dato periodo di 24 ore non mostrino segni di dipendenza simili. Anche i modelli di consumo possono svolgere un ruolo importante in questa considerazione, poiché due animali che bevono la stessa quantità per un periodo di 24 ore possono sperimentare livelli di intossicazione molto diversi (cioè BEC) a seconda del modello di assunzione di etanolo²². Ciò evidenzia l'utilità di LIQ HDR nella procedura di scelta delle due bottiglie in quanto è in grado di identificare facilmente i ratti che consumano una determinata dose di etanolo a una velocità elevata (ad esempio, inghiottire) rispetto a quelli che consumano la stessa dose a una velocità molto più lenta (ad esempio, sorseggiare). Sebbene potenzialmente indesiderabile per gli studi che indagano gli effetti di una dose controllata di etanolo, il rilevamento di cambiamenti nei modelli di consumo (ad esempio, riduzione degli episodi di abbuffata) a seguito di un particolare intervento sperimentale ha un valore traslazionale significativo dato l'approccio di riduzione del danno che è sempre più perseguito in clinica. Infine, non è richiesto alcuno sforzo affinché gli animali abbiano accesso all'etanolo nei paradigmi di consumo domestico in gabbia, incluso quello qui descritto. Pertanto, l'utilità di questo paradigma è limitata all'analisi del solo bere, mentre i metodi operanti sono favoriti per i casi in cui i ricercatori sono interessati a esaminare la ricerca di alcol - una caratteristica importante dell'AUD.

In sintesi, il protocollo qui descritto fornisce ai ricercatori tutte le informazioni e le risorse necessarie per misurare l'assunzione di etanolo nei ratti nell'ambiente domestico della gabbia. Presentiamo opzioni per approcci a risoluzione relativamente bassa e alta, fornendo ai ricercatori la flessibilità di scegliere il metodo più adatto alle loro esigenze di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Componenti disponibili in commercio			Quantity
12-Key capacitive touch sensor breakout (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-Pin cable matching pair (JST XH 2,5mm passo)	Adafruit	4872	18
4-Pin breadboard jumper (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
Cavo a 4 pin (100 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
Cavo a 4 pin (50 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
breakout del traslatore di livello da 5 V a 3 V	Adafruit	5637	1
Schermo tattile capacitivo (2,8 pollici)	Adafruit	1947	1
Nastro conduttivo in rame (1/4 di pollice)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Dati scudo per registrazione	Adafruit	1141	1
Kit breakout di comunicazione differenziale I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Nastro isolante	DigiKey	3M156004-ND	1
Guaina termorestringente (3/16 pollici vari colori)	Fascette e altro	HS357-S10	6
Kit guaina termorestringente (4 pollici nero)	Jameco	2095963	1
Batteria a bottone al litio (3 V 12,5 mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
rondella piatta	M5 Grainger	54FN66	1
dado esagonale M5	Grainger	6CA72	1
vite a macchina M5 (12 mm)	Grainger	6GU88	1
vite a macchina M5 (25 mm)	Grainger	6GU91	2
Cavo jumper maschio/maschio	Adafruit	1957	1
Scheda microcontrollore (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
filamento PETG (2,85 mm argento)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
filamento PLA (2,85 mm nero)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
filamento PLA (2,85 mm argento)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Alimentatore (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
Scheda di memoria SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Shield stacking headers	Adafruit	85	1
Filo solid-core (22AWG rosso)	Adafruit	288	1
Cavo stranded-core (22AWG nero)	Adafruit	2976	1
Filo a trefoli (22AWG rosso)	Adafruit	3068	1
tubo sipper con tappo a torsione con sfera	Design alternativo	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Borraccia (8 once)	Design alternativo	WB8FS	38
Componenti stampati in 3D personalizzati			Quantità
della custodia Arduino stampato in 3D	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
Parte superiore della custodia Arduino stampata in 3D	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
Clip per cavo stampato in 3D L	N/A	CLIP_L.stl	18
Dado per clip per cavo stampato in 3D	N/A	CLIP_Nut.stl	18
Clip per cavo stampato in 3D R	N/A	CLIP_R.stl	18
Portabottiglie per leccometro stampato in 3D	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Proteggi cavo per lickometro stampato in 3D L	N/	A LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Proteggi cavo per lickometro stampato in 3D R	N/	A LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
lettere per lickometro stampate in 3D	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
Vite di montaggio stampata in 3D	N/A	Vite di montaggio.stl	4
Custodia del sensore stampata in 3D A inferiore	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D A superiore	/A	SENSOR_A_Top.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D B inferiore	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D B superiore	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D C inferiore	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Lettere della custodia del sensore stampate in 3D	N/A	SENSOR_Letters.stl	1
Bloccante del sensore stampato in 3D	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
Base del bloccante del sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Base.stl	18
Ingranaggio del bloccatore del sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
Dado bloccante per sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Vite senza fine per bloccante per sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Worm.stl	18
Pannello acrilico lickometer tagliato al laser	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19

Fondo N