Modellazione del consumo di alcol nei roditori utilizzando l'uso di due bottiglie di alcol in gabbia domestica e l'analisi microstrutturale

Sommario

Questo protocollo descrive un paradigma standard di consumo in gabbia domestica con accesso intermittente a due bottiglie per modellare il consumo di alcol nei ratti. Inoltre, fornisce istruzioni dettagliate per aumentare il protocollo standard con un sistema di rilevamento delle leccate fai-da-te che consente l'analisi microstrutturale del comportamento nel bere.

Abstract

Il consumo casalingo in gabbia a due bottiglie è uno dei paradigmi più utilizzati per studiare il consumo di etanolo nei roditori. Nella sua forma più semplice, gli animali hanno accesso a due borracce, una delle quali contiene normale acqua del rubinetto e l'altra etanolo, con l'assunzione giornaliera misurata dalla variazione del peso della bottiglia nel periodo di 24 ore. Di conseguenza, questo approccio non richiede attrezzature di laboratorio specializzate. Mentre tale facilità di implementazione è probabilmente il maggior contributo alla sua adozione diffusa da parte dei ricercatori preclinici sull'alcol, la risoluzione dei dati sul consumo acquisiti utilizzando questo approccio è limitata dal numero di volte in cui il ricercatore misura il peso della bottiglia (ad esempio, una volta al giorno). Tuttavia, il desiderio di esaminare i modelli di consumo nel contesto dell'assunzione complessiva, degli interventi farmacologici e delle manipolazioni neuronali ha spinto lo sviluppo di sistemi di rilevamento delle leccate in gabbia domestica in grado di acquisire dati a livello di singole leccate. Sebbene un certo numero di questi sistemi sia stato sviluppato di recente, il sistema open source, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), ha raccolto una notevole attenzione nel settore per la sua convenienza e facilità d'uso. Sebbene eccitante, questo sistema è stato progettato per l'uso nei topi. Qui, esaminiamo le procedure appropriate per il consumo di alcol in gabbia domestica standard e dotato di leccometro a due bottiglie. Introduciamo anche metodi per adattare il sistema LIQ HD ai ratti, comprese le modifiche hardware per adattarsi a gabbie di dimensioni maggiori e un portabottiglie stampato in 3D ridisegnato compatibile con le borracce standard standard. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono esaminare in parallelo i modelli di consumo quotidiano oltre ai livelli di assunzione in molti ratti, aumentando così la risoluzione dei dati acquisiti con un investimento minimo in risorse aggiuntive. Questi metodi offrono ai ricercatori la flessibilità di utilizzare bottiglie standard o un apparecchio dotato di leccometro per interrogare i meccanismi neurobiologici alla base del consumo di alcol a seconda delle loro precise esigenze sperimentali.

Introduzione

Sebbene l'uso moderato di alcol sia stato storicamente associato a benefici per la salute moderati, recenti studi completi su larga scala hanno rivelato che nessuna quantità di consumo di alcol è sicura^1,2. In effetti, l'uso di alcol è il 7° fattore di rischio principale per la morte e la disabilità a livello globale¹ con individui che bevono anche piccole quantità di alcol che hanno un aumentato rischio di cancro, malattie infettive e lesioni^1,3. Negli Stati Uniti, i decessi per uso di alcol sono aumentati di quasi il 30% tra il 2016 e il 2021⁴. È importante sottolineare che il rischio di morte e invalidità aumenta monotonicamente con l'aumento del consumo¹.

Sebbene gli studi sull'uomo abbiano fornito preziose informazioni sulla neurobiologia dell'uso e dell'abuso di alcol, il controllo sperimentale offerto dai modelli animali è fondamentale per una comprensione approfondita dei meccanismi alla base del comportamento di consumo e del rischio di bere pesantemente. Questi modelli sono anche strumenti preziosi per lo sviluppo di trattamenti volti a ridurre il consumo incontrollato. Il consumo casalingo in gabbia a due bottiglie è uno dei paradigmi preclinici più utilizzati per studiare il consumo di alcol nei roditori. Ciò è dovuto, in gran parte, alla sua facilità di implementazione, in quanto consente di misurare il consumo volontario totale di alcol e la preferenza senza la necessità di apparecchiature di ricerca specializzate o analisi complesse. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono raccogliere misurazioni agli intervalli desiderati (ad esempio, ore, giorni, settimane) calcolando la variazione di peso della bottiglia dall'inizio alla fine di una sessione di consumo. Variazioni su questo metodo di base sono state utilizzate da molti nel campo per facilitare livelli di assunzione di alcol da bassi a moderati a binge sia per brevi che per lunghi periodi di tempo. Ad esempio, sono state utilizzate procedure di scelta continua e intermittente di due bottiglie per facilitare livelli bassi e moderati di assunzione di alcol, rispettivamente, sia nei topi^{5 che nei} ratti^6,7,8. Gli stessi paradigmi possono promuovere alti livelli di assunzione nei ceppi che preferiscono l'alcol^7,9. In alternativa, è stato dimostrato che un adattamento di questo metodo che limita l'accesso all'alcol a 2-4 ore al giorno a partire da circa 3 ore dopo l'inizio del ciclo del buio genera binge drinking nei topi (ad esempio, bere al buio)^10,11. Ulteriori variazioni di questi metodi sono state utilizzate in combinazione con metodi che facilitano la dipendenza da alcol (ad esempio, esposizione cronica intermittente al vapore di etanolo) per esaminare l'escalation del consumo volontario di alcol durante l'astinenza^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Sebbene ampiamente adottato dal settore, l'approccio standard di misurare l'assunzione di alcol in base alla variazione del peso della bottiglia è limitato in risoluzione al consumo totale per sessione di consumo. Di conseguenza, questo approccio non è in grado di catturare i modelli di consumo, che sono ben noti per influenzare sia il rischio che la gravità del disturbo da uso di alcol (AUD)^20,21,22. In effetti, l'assunzione media di un individuo nel tempo può essere una conseguenza di diversi episodi di consumo pesante o di molti episodi di consumo di alcol, ciascuno associato a un consumo relativamente basso e queste sfumature non vengono rilevate quando il consumo viene misurato come assunzione totale per sessione di consumo. È importante sottolineare che negli individui con AUD si osservano un numero significativamente maggiore di episodi di consumo associati a grandi attacchi di consumo (ad esempio, deglutizione) rispetto ai controlli sani²³ e i dati nei primati non umani suggeriscono che gli individui che stabiliscono un modello di consumo di alcol che include grandi attacchi di consumo all'inizio della loro storia alcolica sono a rischio significativo di AUD²². Inoltre, gli episodi di consumo che includono ampi periodi di consumo aumentano significativamente il rischio di morbilità e mortalità indipendentemente dalla diagnosi di AUD²¹. Nel complesso, questi dati hanno portato a un maggiore interesse nell'esaminare i modelli di consumo oltre ai livelli di assunzione complessiva nei modelli preclinici e hanno stimolato lo sviluppo di una serie di sistemi di varia complessità che sono in grado di acquisire dati sul consumo a livello di singole leccate.

Tra i primi c'è stato lo sviluppo di un sistema a due bottiglie dotato di rilevamento del lick del fotoraggio progettato per l'uso nei topi²⁴. Questo sistema è stato successivamente adattato da un gruppo separato per l'uso in rats²⁵. Negli anni successivi, sono state utilizzate variazioni su questo tema per sviluppare sistemi simili contenuti all'interno di alloggi personalizzati per roditori²⁶, che consentono il rilevamento delle leccate di singoli animali socialmente alloggiati^27,28 e che catturano sia il comportamento alimentare che quello di bere²⁹. Tra questi, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ ha raccolto un'attenzione significativa per l'offerta di un sistema per l'uso nei mouse che è parallelo alla facilità di implementazione e all'accessibilità del sistema sviluppato da Godnyuck et al.²⁴. Questo sistema utilizza il rilevamento capacitivo per rilevare direttamente il contatto tra la linguetta e il tubo del sorso in metallo conduttivo, al contrario delle misure indirette come l'avvicinamento o l'interazione del sorso che si ottengono utilizzando il sistema di rilevamento del fotoraggio. Gli autori forniscono dati che dimostrano che il loro sistema di rilevamento capacitivo offre una precisione e una sensibilità significativamente maggiori nel rilevamento delle leccate, producendo correlazioni più forti tra il numero di leccate e la variazione del peso della bottiglia rispetto al rilevamento del fotoraggio. Gli autori dimostrano inoltre la capacità di utilizzare questo sistema in combinazione con un paradigma di consumo in gabbia domestica ad accesso continuo a due bottiglie per catturare le misure della microstruttura del consumo di alcol oltre alle misure dell'assunzione giornaliera complessiva³⁰.

Qui, descriviamo le procedure per il consumo di alcol in gabbia domestica a due bottiglie utilizzando un approccio standard, nonché metodi che consentono il rilevamento del lick (Figura 1). Introduciamo anche metodi per la creazione e l'implementazione di LIQ HDR, un adattamento di LIQ HD³⁰ per l'uso nei ratti che include modifiche hardware per adattarsi a gabbie di dimensioni maggiori e un portabottiglie stampato in 3D ridisegnato compatibile con le bottiglie standard standard. Questi metodi offrono ai ricercatori la flessibilità di utilizzare un approccio standard o dotato di leccometro a seconda delle loro risorse sperimentali e delle esigenze di raccolta dei dati.

Di seguito è riportata una descrizione dei materiali necessari e istruzioni dettagliate per catturare l'uso domestico del consumo in gabbia utilizzando la procedura di consumo a scelta a due bottiglie ad accesso intermittente adattata da Simms et al.⁷. In questa procedura, ai ratti viene fornito l'accesso 24 ore su 24 a due bottiglie per bere 7 giorni alla settimana. Il lunedì, il mercoledì e il venerdì (MWF), i ratti ricevono una bottiglia contenente acqua (H₂O) e un'altra bottiglia contenente etanolo (EtOH). Queste bottiglie vengono rimosse il martedì, il giovedì e il sabato (TRS) e sostituite con due bottiglie d'acqua. I ratti bevono dalle stesse due bottiglie d'acqua il sabato e la domenica. Si noti che questi metodi possono essere facilmente regolati per programmi alternativi di accesso all'etanolo (ad esempio, continuo, abbuffata, ecc.), se lo si desidera. Vengono fornite istruzioni separate per gli approcci standard e dotati di lecometro.

Protocollo

Tutti i dati rappresentativi sono stati raccolti utilizzando ratti Long-Evans adulti alloggiati singolarmente con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università dell'Illinois di Chicago e in conformità con le Linee Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. È necessaria un'unica custodia per monitorare con precisione il consumo di fluido da parte di ciascun soggetto. I ratti Long-Evans maschi adulti (n = 38) e femmine (n = 22) erano P50-80 all'arrivo e lasciati acclimatare al vivaio per una settimana prima di iniziare l'esperimento. I ratti avevano accesso ad libitum al cibo standard (Teklad 7912, Envigo) e all'acqua, se non diversamente specificato.

1. Preparazione prima dell'esperimento

1. Etichettare le bottiglie come H₂O o EtOH. Quindi, etichettare con un identificatore univoco per ogni ratto, una bottiglia di H₂O e una bottiglia di EtOH per MWF e due bottiglie di H₂O per TRS.
   NOTA: Facoltativamente, utilizzare un nastro di colore diverso per identificare le bottiglie H₂O ed EtOH per evitare potenziali errori durante il cambio della bottiglia.
2. Riempire le borracce H₂O con acqua potabile 1 giorno prima della data di inizio dell'esperimento. Preparare la soluzione di EtOH combinando 190 proof di EtOH con acqua potabile (20% v/v) 1 giorno prima della data di inizio dell'esperimento.
   ATTENZIONE: È fondamentale che l'EtOH utilizzato non sia denaturato, poiché l'EtOH denaturato è velenoso.
3. Prepara una gabbia vuota sulla stessa scaffalatura dei ratti che partecipano all'esperimento. Questa gabbia verrà utilizzata per calcolare la fuoriuscita.
4. Equipaggiare le gabbie con il sistema LIQ HDR se si utilizza (vedere il passaggio 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura 1 supplementare).
5. Determinare l'ora precisa del giorno per il cambio del biberon prima dell'inizio dello studio. Le bottiglie devono essere sostituite ogni giorno alla stessa ora per ottenere una misurazione accurata dell'assunzione di 24 ore.
   NOTA: Ricerche precedenti hanno dimostrato che i roditori mostrano il massimo grado di consumo subito dopo l'inizio del ciclo del buio^10,31. Pertanto, al fine di catturare l'assunzione durante questo periodo altamente attivo (vedere il passaggio 2.3.1 per catturare il binge drinking), si consiglia di sostituire la bottiglia 30-60 minuti dopo lo spegnimento delle luci. Utilizzare lampade rosse durante il cambio della bottiglia per consentire la visualizzazione senza interrompere il ciclo luce-buio.

2. Procedure quotidiane e manutenzione

1. Il primo giorno dell'esperimento, procedi come segue.
   1. Rimuovere le borracce standard dalle gabbie.
   2. Facoltativo: i ratti spesso spingono la parte superiore della gabbia mentre cercano cibo, il che potrebbe causare fuoriuscite che non possono essere corrette dalla gabbia di fuoriuscita vuota. L'uso di tazze per alimenti all'interno della gabbia può alleviare questa preoccupazione. Se lo usi, rimuovi ora il cibo dalla parte superiore della gabbia, aggiungi una tazza per il cibo all'interno della gabbia e riempila con il cibo. Assicurati che lo spazio assegnato al ratto soddisfi ancora le linee guida istituzionali basate sulle dimensioni della gabbia per ratti e sulle dimensioni della tazza del cibo.
   3. Indicare al personale addetto all'assistenza e all'allevamento, a seconda dei casi, che il personale di ricerca fornirà cibo e acqua per tutta la durata dell'esperimento.
   4. Le modifiche alla gabbia possono essere dannose per la raccolta dei dati. Esegui i cambi di gabbia in tandem con l'ottenimento di misurazioni del peso corporeo. I ricercatori che scelgono di farlo dovrebbero informare di conseguenza il personale addetto all'assistenza e all'allevamento.
2. Nei giorni successivi, seguire le procedure descritte di seguito.
   NOTA: Ricorda che qualsiasi movimento di gabbie e bottiglie può creare fuoriuscite. Pertanto, è importante essere delicati con i movimenti e utilizzare gli stessi metodi di applicazione e rimozione delle bottiglie sulla gabbia di fuoriuscita utilizzati per le gabbie per topi.
   1. Entrare nella stanza prima dell'orario di cambio bottiglia, assicurandosi di avere il tempo sufficiente per eseguire i passaggi seguenti, e posizionare le nuove bottiglie sulle gabbie all'orario di inizio sessione appropriato.
   2. Rimuovere le parti superiori dei filtri dalle gabbie. Se MWF, procedere al passaggio 2.2.3. Se TRS, procedere al passaggio 2.2.4.
   3. Il lunedì, il mercoledì e il venerdì, rimuovere le bottiglie TRS dai tappi della gabbia. Pesare le bombole MWF (una EtOH e una H₂O). Registra il peso iniziale della bottiglia per la sessione di bevute di oggi. Se necessario, fornire cibo aggiuntivo alla parte superiore della gabbia o tazze per alimenti. All'ora di inizio della sessione designata, posiziona le bottiglie sulla parte superiore della gabbia di ogni ratto con il nastro adesivo rivolto verso l'alto in modo che i ratti non mastichino l'etichetta della bottiglia><. NOTA: In genere, il consumo di acqua non viene registrato o riportato per la TRS, ma i ricercatori possono facoltativamente raccogliere questi dati ottenendo i pesi delle bottiglie come descritto di seguito nei passaggi 2.2.3 e 2.2.4, se lo desiderano. Il lato per la bottiglia di EtOH deve essere alternato dopo ogni sessione di consumo per evitare lo sviluppo di potenziali preferenze laterali, che possono inavvertitamente distorcere i dati di consumo.
      1. Facoltativo: Lavori precedenti hanno dimostrato che molti ratti mostrano un consumo eccessivo di alcol all'inizio della sessione di bevute^8,32,33. La maggior parte dei ricercatori che catturano il binge drinking durante questo periodo riportano l'assunzione durante i primi 30-60 minuti della sessione di bevute. Per ottenere i dati sull'assunzione durante questo potenziale episodio di abbuffata, segui i passaggi descritti di seguito.
      2. Imposta un timer dopo che le bottiglie sono state applicate all'ultima gabbia. Lasciare la stanza indisturbata durante il periodo di tempo.
      3. Rientrare nella stanza quando il timer suona. Rimuovere le bottiglie EtOH e H₂O e registrare i pesi delle bottiglie. Restituire le bottiglie EtOH e H₂O nelle gabbie.
         NOTA: Questo passaggio non è necessario per catturare gli episodi di abbuffata quando si utilizza un sistema attrezzato per il rilevamento delle leccate.
   4. Il martedì, il giovedì e il sabato, rimuovere le bombole MWF dalle gabbie all'ora di fine sessione designata, corrispondente a 24 ore dopo l'orario di inizio. Pesare ogni bottiglia e registrare il peso finale della bottiglia per la sessione di consumo MWF. Ottieni e registra il peso corporeo di ogni ratto. Se necessario, fornire cibo aggiuntivo alla parte superiore della gabbia o alle tazze del cibo. Posizionare le bottiglie TRS H₂O sulla parte superiore della gabbia di ogni ratto con il nastro adesivo rivolto verso l'alto in modo che i ratti non mastichino l'etichetta della bottiglia.
   5. Restituisci le cime dei filtri alle gabbie e lascia la stanza degli animali.
      NOTA: Opzionalmente coprire i sorseggiatori delle bottiglie EtOH per evitare l'evaporazione. Se il personale di ricerca esegue cambi di gabbia, designare 1 giorno alla settimana durante i compiti TRS per eseguire questo compito. Metti ogni ratto in una gabbia pulita dopo aver ottenuto il peso corporeo.
3. Lavare i biberon e rinfrescare i liquidi regolarmente, settimanalmente o bisettimanalmente in conformità con le procedure di cura e allevamento degli animali dell'istituto. Fare attenzione a svolgere questi compiti in modo da non interrompere le sessioni di bevute. Ad esempio, le bottiglie TRS H₂O possono essere lavate e ricaricate dopo la rimozione su MWF. Allo stesso modo, le bottiglie MWF H₂O ed EtOH possono essere lavate e ricaricate dopo la rimozione su TRS.

3. Rilevamento delle leccate durante gli esperimenti di scelta di due bottiglie

NOTA: I ricercatori interessati a catturare dati sul consumo di alcol ad alta risoluzione possono modificare la procedura di cui sopra aggiungendo funzionalità di rilevamento delle leccate alle bottiglie. LIQ HD³⁰ è un sistema fai-da-te (DIY) a basso costo che consente questo tipo di raccolta dati nei mouse. Le procedure descritte di seguito descrivono le modifiche necessarie per adattare LIQ HD per l'uso nei ratti (indicato come LIQ HDR). Vedere la tabella dei materiali per un elenco di tutte le parti vendute in commercio e stampate in 3D personalizzate necessarie per costruire un sistema di rilevamento delle leccate, in grado di acquisire dati sulla scelta di due bottiglie per un massimo di 18 ratti. I file .stl di stampa 3D e le istruzioni sono disponibili sul sito Web dell'autore (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Configurazione delle unità sensore capacitive
   NOTA: Ogni sistema LIQ HDR è costituito da tre unità sensore capacitive, che insieme acquisiscono i dati di leccata da 36 bottiglie in parallelo corrispondenti a 18 ratti alloggiati in un solo alloggiamento. Ogni unità sensore è costituita da una scheda di breakout di comunicazione differenziale I²C e da una scheda sensore capacitiva a 12 tasti, che si collegherà ai leccometri da sei gabbie separate attraverso sei coppie di cavi a 2 pin codificati a colori per ciascun licometro (Figura 2A).
   1. Raccogli i materiali necessari per costruire tutte e tre le unità sensore capacitive, come mostrato in Figura 2B, insieme agli strumenti di saldatura necessari.
   2. Per iniziare a costruire l'unità sensore A, coprire un cavo connettore femmina a 2 pin con una guaina termorestringente rossa lunga 7 pollici, inserire le estremità del filo rosso e nero ai pin #0 e #1 sulla scheda del sensore (Figura 2C-1) e saldare in posizione (Figura 2C-2). Assicurarsi che il cavo si trovi nella parte anteriore della scheda del sensore come mostrato per disporre le gabbie in ordine numerico da sinistra a destra nel vivaio senza sovrapporre i cavi e potenzialmente interrompere la registrazione (vedere il passaggio 3.6 e Figura 6).
   3. Coprire altri cinque cavi con guaina termorestringente di colore distinto e saldare al pin #2-11 come mostrato (Figura 2C-3). Assicurati che tutti i fili rossi siano saldati a pin pari, che si collegheranno a tutte le bottiglie sul lato sinistro, e che tutti i fili neri siano saldati a pin dispari, che si collegheranno a tutte le bottiglie sul lato destro.
   4. Coprire i giunti di saldatura con colla a caldo su tutti i lati per proteggerli (Figura 2C-4). Etichettare i connettori in ordine numerico, fornendo un ID univoco per ogni licometro (Figura 2C-4).
   5. Per assemblare l'unità sensore A, collegare la scheda sensore A a un EndPoint di breakout di comunicazione con un cavo a 4 pin da 50 mm e collegare l'EndPoint all'uscita da 3,3 V del cambio a leva da 5 V a 3 V con un cavo a 4 pin da 100 mm (Figura 2D-1). Sebbene sia la scheda del sensore che la scheda di breakout della comunicazione abbiano due connettori identici a 4 pin, è comunque importante assicurarsi che il cablaggio sia esattamente come mostrato (Figura 2D-1 e Figura 2F) per utilizzare i custodi dei sensori stampati in 3D e la configurazione suggerita del vivaio (vedere il passaggio 3.6 e Figura 6). Alloggiare l'unità sensore A all'interno della custodia stampata in 3D (Figura 2D-2). Chiudere delicatamente la parte superiore, facendo attenzione a non schiacciare il cavo del traslatore di livello (Figura 2D-3).
   6. Modificare gli indirizzi I²C delle schede sensore B e C saldando un ponticello dal pin ADDR al pin 3Vo o SDA come indicato (Figura 2E).
   7. Saldare sei cavi del connettore femmina con codice colore alle schede dei sensori B e C utilizzando lo stesso ordine utilizzato per la scheda A. Etichettare ciascun connettore con il numero ID del leccometro corrispondente. Collegare la scheda B al punto medio di breakout di comunicazione e C a un punto finale con cavi a 4 pin da 50 mm (Figura 2F).
   8. Alloggia le unità sensore B e C nelle rispettive custodie stampate in 3D. Collegare a margherita tutte e tre le unità sensore con cavi Ethernet per completare la configurazione del sensore (Figura 2G).
2. Configurazione dell'interfaccia del microcontrollore
   NOTA: L'interfaccia del microcontrollore LIQ HDR (Figura supplementare 1A) è la stessa descritta per LIQ HD³⁰ con modifiche molto piccole. Le procedure descritte di seguito forniscono una panoramica generale dei passaggi necessari per configurare l'interfaccia con le modifiche descritte nei passaggi 3.2.6 e 3.2.8. I ricercatori sono indirizzati al protocollo originale e al video tutorial fornito sulla pagina GitHub dell'autore per istruzioni dettagliate passo dopo passo³⁰.
   1. Raccogliere i materiali e gli strumenti di saldatura necessari per costruire l'interfaccia del microcontrollore (Figura 1B supplementare). Sul lato posteriore della protezione antitocco (Figura supplementare 1C-1), creare un ponticello di saldatura attraverso le piazzole di saldatura posteriori (Figura supplementare 1C-2).
   2. Sul lato posteriore dello scudo di registrazione dei dati, recidere la traccia del ponticello del pin CS (Figura supplementare 1D-1). Sul lato anteriore del data logger, saldare un breve ponticello dal pin CS al pin #7 (Figura supplementare 1D-2).
   3. Per installare le intestazioni di impilamento della visiera, impilarle prima sul retro della schermatura del touchscreen (Figura supplementare 1E-1). Impilare il data logger sul touchscreen, utilizzare il nastro adesivo per stabilizzarlo e saldare tutti i pin dell'intestazione al data logger (Figura supplementare 1E-2). Quindi rimuovere il touchscreen.
   4. Impilare il rimanente connettore 2 x 3 sul microcontrollore (Figura supplementare 1F-1), quindi impilare il data logger sul microcontrollore prima di saldare i pin del connettore in posizione (Figura supplementare 1F-2).
   5. Inserire la batteria a bottone nel data logger (Figura supplementare 1G-1). Impilare il touchscreen sul registratore di dati (Figura supplementare 1G-1). Inserire la scheda microSD insieme al relativo adattatore nel data logger (Figura supplementare 1G-2).
   6. Per realizzare il cavo di messa a terra aggiuntivo, tagliare un connettore maschio da un ponticello e spelare l'estremità a ~1/4 di pollice (Figura supplementare 1H-1). Saldare un filo di filo a nucleo solido spelato al filo del ponticello e coprire il giunto di saldatura con una guaina termorestringente (Figura supplementare 1H-2).
   7. Collegare i ponticelli a 4 pin e il cavo di messa a terra aggiuntivo al microcontrollore (Nero - GND, Rosso - 5V, Giallo - pin #21, Blu - pin #20, Figura supplementare 1I-1). Fissare i collegamenti con colla a caldo (Figura supplementare 1I-2). Facoltativamente, avvolgere i ponticelli con una guaina termorestringente (Figura supplementare 1I-2).
   8. Alloggia l'interfaccia del microcontrollore completamente assemblata nel case stampato in 3D, con i ponticelli a 4 pin e il cavo di messa a terra infilati attraverso l'apertura nella parte superiore (Figura 1J supplementare).
   9. Seguire il protocollo originale per l'installazione del software dell'interfaccia del microcontrollore³⁰.
3. Costruzione LIQ HDR lickometer
   NOTA: La stampa 3D personalizzata che contiene le bottiglie è progettata per l'uso con una borraccia standard per roditori con un diametro del tubo del sorseggiatore di 8 mm (vedi Tabella dei materiali, Figura 3A). Questo portabottiglie può essere facilmente adattato per l'uso con bottiglie simili e tubi per sorseggiare con piccole o nessuna modifica.
   1. Raccogli i materiali, le stampe 3D e gli strumenti di saldatura necessari per costruire un lickometer come mostrato in Figura 3B. Si noti che ogni sistema LIQ HDR ospita un massimo di 18 leccometri per 36 bottiglie.
   2. Per estendere il cavo del connettore maschio, spellare entrambe le sue estremità a ~1/4 di pollice di lunghezza, così come i fili di prolunga nero e rosso (Figura 3C-1).
   3. Saldare i fili di prolunga al cavo del connettore (Figura 3C-2) e coprire i giunti di saldatura con una guaina termorestringente (Figura 3C-3). Coprire il cavo del connettore maschio con una guaina termorestringente del colore corrispondente a un cavo del connettore femmina corrispondente sull'unità sensore (Figura 3C-4).
   4. Per essere coerenti con il cablaggio della scheda del sensore (Figura 2), infilare il filo rosso e nero attraverso il passaggio del cavo interno sinistro e destro del portabottiglie, rispettivamente (Figura 3D-1).
   5. Saldare ogni filo fino all'estremità del nastro di rame conduttore da 1 3/4 di pollice (Figura 3D-2) e piegare i nastri di rame a metà (Figura 3D-3).
   6. Staccare il nastro di rame e utilizzare un paio di pinze per manovrarlo con cautela all'interno della staffa del sorso (Figura 3E-1) prima di farlo aderire saldamente alle pareti interne della staffa del sipper (Figura 3E-2). Assicurarsi che il lato di saldatura del nastro di rame sia aderente alla parete più vicino alla linea mediana del portabottiglie, come indicato (Figura 3E-2). Spingere un tubo sipper attraverso la staffa per premere saldamente il nastro contro la parete e adescare la staffa.
   7. Per rinforzare il lato di saldatura del nastro di rame, che non è così adesivo e tende a staccarsi, applicare una cucchiaiata di colla a caldo sul giunto di saldatura (Figura 3E-3). Spalmare la colla per coprire sia il nastro di rame che qualsiasi parte esposta adiacente della stampa 3D (Figura 3E-4).
   8. Infilare il cavo attraverso il passaggio interno della protezione del cavo (Figura 3F). Assicurati di selezionare la protezione del cavo appropriata (rivolta a sinistra o a destra) per ciascun licometro al fine di utilizzare la configurazione del vivaio suggerita (vedi passaggio 3.6 e Figura 6)."NOTA: I licometri 5-6, 11-12 e 17-18, che sono raffigurati in cavi di colore blu o viola nella configurazione attuale, richiedono una protezione per cavi rivolta a sinistra (Figura 4D-1), mentre tutti gli altri lickometri richiedono una protezione per cavi rivolta a destra (Figura 4D-2).
   9. Per installare il fermacavo, inserire prima un filo nella scanalatura di una metà del fermacavo (Figura 3G-1), quindi inserire l'altra metà sul secondo filo, quindi chiudere saldamente entrambe le metà con il dado (Figura 3G-2).
   10. Etichettare il connettore maschio con il numero ID del leccometro corrispondente (Figura 3H). Ripeti questi passaggi fino a quando tutti i 18 lecometri sono stati costruiti.
4. Installazione dei licrometri LIQ HDR
   NOTA: LIQ HDR è progettato per l'installazione su una gabbia per ratti standard con una parte superiore in filo metallico (Figura 4A-1).
   1. Identificare due coppie di aste con un interasse di ~75 mm sulla parte superiore della gabbia metallica per accogliere il portabottiglie. Usa un paio di pinze per aprire leggermente le aste di metallo attorno alle aperture del sipper. Isolare queste aste con nastro isolante per evitare il contatto metallo-metallo tra i sorsi e la parte superiore della gabbia (Figura 4A-2).
      NOTA: Sebbene il nastro isolante non sia accessibile ai ratti e, quindi, non sia suscettibile alla masticazione, si consiglia di gettarlo via alla fine dello studio e di non riutilizzarlo tra uno studio e l'altro.
   2. Installare il leccometro e il pannello acrilico laser spesso 1/8 di pollice sulla parte superiore della gabbia con due set di viti e dadi M5 (Figura 4B). Assicurarsi che le aperture del sipper sul leccometro e sul pannello acrilico siano allineate e che i sipper non siano a contatto con nessuna parte della parte superiore della gabbia.
   3. Fissare il fermacavo all'asta più esterna (~4 mm di diametro) della parte superiore della gabbia metallica (Figura 4C). Regolare il fermacavo, se necessario, per assicurarsi che la parte superiore della gabbia poggi saldamente sul fondo della gabbia e che il cavo non venga tirato o piegato sotto troppa tensione. Assicurarsi che venga utilizzata la protezione del cavo corretta per ogni licometro (Figura 4D e vedere il passaggio 3.8.8).
   4. Regolare i tubi del sipper secondo necessità in modo che solo ~2 cm del sipper si estendano dal tappo (Figura 4E-1). Per installare le bottiglie, inserire il tubo del sorso attraverso la staffa del portabottiglie fino all'arresto (Figura 4E-2). Solo la punta del tubo del sorso dovrebbe estendersi oltre il pannello acrilico (Figura 4E-3). È fondamentale che nessun'altra parte del tubo del sorso sia esposta per evitare leccate false positive dovute a comportamenti non consumatori, come il ratto che tocca o gioca con il tubo del sorso. La parte superiore di un filtro dovrebbe essere in grado di appoggiarsi comodamente sopra la parte superiore della gabbia metallica e il fermacavo senza disturbare il cavo stesso (Figura 4F).
      NOTA: È possibile utilizzare un pannello acrilico più spesso o una pila di più pannelli da 1/8 di pollice per racchiudere completamente tubi per sorseggiatori di lunghezze maggiori per esperimenti che richiedono che i tubi per sorseggiare si estendano ulteriormente nella gabbia, ad esempio quando si misura il consumo di alcol in ratti giovani che potrebbero avere difficoltà a raggiungere un sorso corto.
5. Installazione e utilizzo dei bloccanti del sorsofo
   NOTA: Il bloccante del sorso (Figura 5A) è progettato per limitare l'accesso del ratto al sorseggiatore durante il cambio della bottiglia e per garantire un'accurata calibrazione del leccometro all'inizio di ogni sessione di consumo.
   1. Raccogli le parti stampate in 3D e una vite, un dado e una rondella M5 per un bloccatore di sorsi come mostrato in Figura 5B.
   2. Inserisci il SIPPER_Gear nel SIPPER_Base (Figura 5C-1). Assicurati che il SIPPER_Gear sia orientato esattamente come mostrato nel riquadro del rendering 3D. Inserire la SIPPER_Worm nell'apertura nella parte superiore del SIPPER_Base. Ruotare la vite senza fine in senso orario durante l'inserimento fino a quando la testa non è a filo con la base (Figura 5C-2).
   3. Avvitare la SIPPER_Nut all'estremità del verme dal fondo della base (Figura 5C-3). Utilizzare una pinza per serrare il dado mentre si ruota la manopola a vite senza fine. Inserire i colli rotondi e stretti del SIPPER_Blockers nelle fessure del Gear (Figura 5C-4).
   4. Installare il bloccante montato sulla parte superiore della gabbia utilizzando il set di viti M5 (Figura 5D). Assicurarsi che entrambi i bloccanti siano allineati con le aperture del sedile.
   5. Per bloccare l'accesso ai sipper, ruotare la manopola a vite senza fine in senso orario per abbassare i bloccanti fino a coprire completamente le aperture del sipper (Figura 5E).
   6. Per fornire l'accesso ai sorseggiatori, ruotare la manopola in senso antiorario fino a quando i bloccanti non si trovano in posizione verticale perpendicolare alla parte superiore della gabbia (Figura 5F-1). Tirare manualmente verso l'alto ciascun braccio di blocco fino a quando le teste non si trovano appena sotto la parte superiore della gabbia metallica. Ruota i bloccanti di 90° in modo che le teste siano parallele alle aste di metallo sulla parte superiore della gabbia e le braccia siano bloccate in posizione (Figura 5F-2). Continuare a ruotare la manopola in senso antiorario fino a quando entrambi i blocchi non sono sollevati sopra la parte superiore della gabbia (Figura 5F-3) e i sorsi sono completamente accessibili (Figura 5F-4).
6. Utilizzo del sistema LIQ HDR nel vivarium
   NOTA: La seguente configurazione del vivarium è ottimizzata per catturare il consumo di bevande a scelta in due bottiglie utilizzando un'unica interfaccia a microcontrollore collegata a 18 gabbie per ratti standard a scatola da scarpe. Tutti i componenti elettronici, tra cui l'interfaccia del microcontrollore, le unità sensore e i vari cavi, sono fissati a una scaffalatura in filo metallico montata a parete che sostiene le gabbie (Figura 6A). Potrebbero essere necessarie alcune modifiche per adattarsi alle strutture degli animali e alle esigenze degli utenti.
   1. Montare ciascuna unità sensore sulla scaffalatura del vivaio utilizzando la vite di montaggio personalizzata stampata in 3D (Figura 6B). Assicurarsi che ogni unità sensore sia montata direttamente sotto la gabbia con il leccometro di colore giallo per evitare inutili tensioni del cavo (Figura 6A).
   2. Disporre e fissare ciascun cavo del connettore femmina assicurandosi che non si sovrappongano l'uno all'altro o si pieghino eccessivamente alle estremità di saldatura, il che potrebbe comportare uno scarso rilevamento del lick (Figura 6B). Se si utilizzano scaffalature in barre metalliche, ciò può essere facilmente ottenuto legando i cavi del connettore alle aste separate sullo scaffale come raffigurato.
   3. Montare l'interfaccia del microcontrollore accanto all'unità sensore A utilizzando la stessa vite di montaggio stampata in 3D e collegare il connettore a 4 pin alla porta di ingresso a 5 V del traslatore di livello da 5 V a 3 V collegato all'unità sensore A (Figura 6C).
   4. Utilizzare del nastro isolante per fissare il filo di terra aggiuntivo a una fonte di messa a terra come la scaffalatura metallica (Figura 6D).
   5. Disporre ogni gabbia in base al colore e all'ID del lickometro installato secondo la rappresentazione Figura 6A al fine di ridurre al minimo la sovrapposizione e la tensione dei cavi.
   6. Collegare saldamente tutti i cavi del connettore del lickometro maschio ai cavi del connettore del sensore femmina corrispondenti (Figura 6E). Collegare l'alimentatore per attivare l'interfaccia del microcontrollore (Figura 6F).
   7. Nella pagina principale della GUI (interfaccia utente grafica) (Figura 6G), toccare il simbolo di impostazione per aprire la pagina Impostazioni. Gli utenti possono modificare l'orario di accensione e spegnimento delle luci in base al programma del vivaio per garantire che il display dell'interfaccia si oscuri automaticamente all'inizio del ciclo di buio (Figura 6H-1).
   8. Tocca Modifica impostazioni sensore (Figura 6H-1) per regolare la soglia di tocco su 8 e la soglia di rilascio su 2, che abbiamo scoperto abilitare il rilevamento del lick più coerente per i ratti utilizzando la configurazione corrente (Figura 6H-2). Si noti, tuttavia, che gli utenti potrebbero dover sperimentare impostazioni diverse se vengono introdotte modifiche al sistema corrente.
   9. Deselezionare Calibrazione automatica se i dati vengono raccolti solo per un periodo di 24 ore o meno (Figura 6H-2).

4. Procedure quotidiane per l'uso del rilevamento delle leccate in gabbia a casa con scelta di due bottiglie

1. Seguire i passaggi descritti nel passaggio 2 per le procedure standard di scelta di due bottiglie con le seguenti modifiche.
2. Il lunedì, il mercoledì e il venerdì, prima di indossare le bottiglie MWF, utilizzare i bloccanti per coprire le aperture di tutte le gabbie (vedere il passaggio 3.5.5 e Figura 5E).
3. Prima di registrare, selezionare il lato sperimentale corretto nella pagina principale dell'interfaccia grafica, che sarà il lato della bottiglia EtOH per quel giorno (Figura 6G).
4. Dopo aver installato tutte le bombole MWF, toccare START! nella pagina principale (Figura 6G) per avviare la calibrazione dei sensori, durante la quale si consiglia agli utenti di allontanarsi dal sistema e assicurarsi che i ratti non stiano leccando i sorsi (Figura 6I-1). La calibrazione richiede alcuni secondi per essere completata, dopodiché il sistema entra nella pagina di registrazione principale che mostra i numeri cumulativi di lick su ogni bottiglia per ogni lickometro (Figura 6I-2).
5. Sollevare tutti i bloccanti sopra la parte superiore della gabbia per consentire l'accesso ai filtri (vedere il passaggio 3.5.6 e Figura 5F) e riportare delicatamente tutte le parti superiori del filtro come descritto (vedere il passaggio 3.4.4 e Figura 4F).
6. Tocca Aggiorna per aggiornare i numeri di lick sullo schermo, che non si aggiorneranno in tempo reale da soli (Figura 6I-2).
7. Il martedì, il giovedì e il sabato, toccare Salva ed esci per interrompere la registrazione e tornare alla pagina principale (Figura 6I-2) prima di rimuovere le bottiglie MWF.
8. Per rimuovere la scheda SD per il trasferimento dei dati, toccare Espelli SD prima di scollegare la scheda SD (Figura 6G). Inserisci la scheda SD in qualsiasi computer e copia/incolla il file di dati .csv con il nome della data di accensione della bottiglia su quel computer (Figura 6K). Per rimontare la scheda SD per la registrazione successiva, inserire la scheda nell'interfaccia e toccare Monta SD (Figura 6J).
   NOTA: Si consiglia di eseguire il backup dei file di dati ogni giorno.
9. Si consiglia di limitare le misurazioni del peso corporeo a una volta alla settimana, se compatibile con il modello animale e il protocollo di utilizzo dell'animale, ed eseguire questa attività nel giorno designato per il cambio della gabbia al fine di ridurre al minimo i disturbi non necessari ai leccometri e ai sensori. Scollegare tutti i cavi del licometro maschio dai cavi del sensore femmina corrispondenti prima di spostare le gabbie. Dopo aver pesato ogni topo, rimettilo in una gabbia pulita. Trasferisci il leccometro su una nuova parte superiore della gabbia e ricollega ogni leccometro al sensore corrispondente quando necessario.
10. Per gli esperimenti che testano l'effetto di un intervento (ad esempio, iniezione di farmaci) sull'assunzione di EtOH e sulla microstruttura del bere, programmare tali interventi prima dell'inizio della sessione di bere, quando possibile. Nelle occasioni in cui ciò non è possibile, i ricercatori possono interrompere il rilevamento delle leccate toccando Pausa (Figura 6I-2) e riprendere l'acquisizione dei dati toccando Riprendi al termine dell'intervento. Si consiglia di raccogliere i pesi delle bottiglie durante ogni pausa della sessione di bevuta al fine di catturare i cambiamenti nell'assunzione di EtOH prima e dopo l'intervento, nonché di tenere conto delle fuoriuscite che possono verificarsi quando si rimuove la parte superiore della gabbia per accedere all'animale.
11. Al termine dello studio, tutti i componenti della gabbia devono essere disinfettati accuratamente prima di essere utilizzati con nuovi animali per limitare la trasmissione di contaminanti tra gli animali. Si consiglia di spruzzare delicatamente e strofinare il leccometro con una soluzione di EtOH al 70%, facendo attenzione a non interrompere i componenti elettrici interni. Il bloccante e il pannello acrilico possono essere lavati con acqua tiepida e sapone.

5. Analisi dei dati

1. Prima di valutare le misure dipendenti, correggere i dati di assunzione per le fuoriuscite che inevitabilmente si verificano a seguito del cambio di bottiglia ogni giorno. Per fare ciò, calcolare la media della variazione di peso della bottiglia per le bottiglie EtOH e H₂O sulla gabbia di fuoriuscita nel corso dell'intero periodo di studio.
2. Escludere tutti i valori superiori a due deviazioni standard dalla media per ogni bottiglia. Dopo aver escluso questi valori anomali, sottrarre le medie calcolate dalle variazioni di EtOH e H₂O peso delle bottiglie ottenute dalle bottiglie sulle gabbie contenenti animali. Sottraendo questa quantità, i ricercatori possono essere sicuri che la perdita media derivante dalla fuoriuscita di una data soluzione non viene considerata nelle misure di consumo. La sottrazione della quantità media di fuoriuscita può comportare un valore negativo per alcuni animali in alcune occasioni. Convertili in zero e interpretali come l'assenza di qualsiasi assunzione per quella soluzione.
3. Le principali misure dipendenti per gli esperimenti di consumo a scelta di due bottiglie sono l'assunzione di EtOH (g/kg) e la preferenza (%). Calcolare l'assunzione dalla variazione del peso della bottiglia di EtOH (g) e normalizzare al peso corporeo (kg) utilizzando i seguenti passaggi.
   1. Convertire la variazione del peso della bottiglia (g) in variazione di volume (mL) utilizzando la seguente equazione:
      
      La densità dell'etanolo puro è di 0,789 g/mL. Pertanto, la densità contributiva del 20% di EtOH è 0,1578 g/mL. H₂O pesa 1 g/mL. Pertanto, la densità contributiva dell'80% H₂O = 0,80 g/mL. Di conseguenza, ogni mL di una soluzione di EtOH al 20% (v/v) è composto da 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL. Pertanto, l'equazione finale quando si utilizza una concentrazione di EtOH del 20% (v/v) è:
      
   2. Calcola la dose di etanolo consumata utilizzando l'equazione seguente. Utilizzare i pesi corporei ottenuti durante la stessa settimana come dati sull'assunzione per calcolare l'etanolo consumato in termini di peso corporeo animale.
      
   3. Calcola la preferenza utilizzando la seguente equazione:
      
4. Come la sua controparte del mouse³⁰, LIQ HDR acquisisce una varietà di variabili della microstruttura del bere, tra cui la durata del lick, il numero del bout, la durata del bout, il numero del lick del bout e la durata del lick del bout (Figura 6K). Un attacco di bevute è definito come una serie di leccate che inizia con almeno 3 leccate eseguite in meno di 1 secondo e termina dopo che sono trascorsi 3 secondi senza ulteriori leccate. Queste misure possono quindi essere utilizzate per calcolare la durata media del singolo lick, la durata media del singolo attacco, il numero medio di lick per attacco, la frequenza media del lick, l'intervallo stimato tra i lick e l'intervallo stimato tra i bout.
   NOTA: L'interfaccia del microcontrollore fornisce questi dati della microstruttura con una risoluzione di 1 minuto in un file .csv (Figura 6K). I ricercatori possono utilizzare l'app di analisi fornita con il protocollo LIQ HD originale³⁰ o la loro piattaforma di post-elaborazione preferita per raccogliere e riassumere i dati in base alle esigenze di ricerca. I dati della microstruttura vengono in genere sommati nell'intero periodo di 24 ore per confrontare le differenze medie a livello macro, o in un intervallo da 30 minuti a 1 ora per esaminare le variazioni del modello di consumo in un ciclo luce-buio.

Risultati

Standard intermittente a due bottiglie scelta gabbie domestiche EtOH drinking data
Utilizzando la procedura standard (Figura 7A), i ricercatori possono catturare l'assunzione di 24 ore (Figure 7B-D) e il binge drinking se i pesi delle bottiglie vengono raccolti poco dopo l'inizio della sessione di consumo (Figure 7E-F). Calcolando l'assunzione di etanolo rispetto all'assunzione di acqua, i ricercatori possono anche ottenere dati sulle preferenze in tutti i punti temporali misurati (Figure 7D,F). Come mostrato in Figura 7C, i ratti mostrano spesso un periodo di escalation nell'assunzione di etanolo nel corso dei primi giorni di accesso a due bottiglie. Segue un plateau durante il quale l'assunzione rimane relativamente stabile. Sebbene costantemente osservato nei ratti maschi^{7,32,33,34,35,36}, questo modello non è sempre osservato nelle femmine. Invece, alcuni studi riportano livelli stabili di assunzione di etanolo durante il periodo di studio nelle femmine di ratto^37,38. Inoltre, alcuni studi suggeriscono che l'assunzione di etanolo può aumentare ulteriormente con periodi di accesso più prolungati^36,39. L'assunzione giornaliera può variare in modo significativo da individuo a individuo. Tuttavia, l'assunzione media giornaliera è stata ben caratterizzata per i ceppi più comunemente utilizzati nella ricerca sull'alcol e può essere utilizzata come punto di riferimento per il successo quando si esaminano dati raggruppati^{7,8,33,34,35,39}.

Come mostrato in Figura 7E, molti ratti consumano una parte significativa della loro assunzione giornaliera di etanolo poco dopo l'inizio della sessione di bevute^8,33. Questo modello di assunzione di etanolo è spesso associato a una preferenza significativa per l'etanolo rispetto all'acqua (Figura 7F). I ricercatori non dovrebbero sorprendersi, tuttavia, se la preferenza di 24 ore non supera il 50%. Ciò è particolarmente vero per i ceppi di roditori di razza o alcol che non preferiscono e gli studi limitati a periodi relativamente brevi di scelta di due bottiglie access^{7,32,33,35,37}.

Convalida di LIQ HDR per l'analisi della microstruttura del bere a scelta di due bottiglie
L'aggiunta del sistema LIQ HDR al paradigma standard di scelta delle due bottiglie per ratto consente ai ricercatori di prevedere in modo accurato e preciso l'assunzione utilizzando i dati di consumo acquisiti. Ciò è confermato dalla presenza di una forte e significativa correlazione tra il numero cumulativo di leccate rilevate e la variazione del peso delle bottiglie sia per l'EtOH (R² = 0,7789, F_(1,113) = 398,1, p < 0,0001) che per la bottiglia H₂O (R² = 0,7910, F_(1,117) = 442,9, p < 0,0001) in un periodo di 24 ore (Figura 8A). Questo vale anche per i giorni in cui i ratti hanno ricevuto due bottiglie contenenti H₂O (R² = 0,8875, F_(1.188) = 1484, p < 0,0001; Figura 8B).

LIQ HDR consente anche un'analisi precisa dei modelli di consumo a un'alta risoluzione temporale che non è offerta dal paradigma standard di scelta delle due bottiglie. Utilizzando questo approccio, i ricercatori hanno l'opportunità di esaminare le differenze nei modelli di consumo tra diverse soluzioni, attraverso il ciclo di luce, tra i sessi, i gruppi di farmaci e altro ancora. Per illustrare, il raggruppamento delle leccate medie in intervalli di 30 minuti consente una facile analisi dei modelli di consumo medi nelle 24 ore. Come previsto, questa analisi rivela assunzioni significativamente più elevate sia di EtOH che di H₂O durante il ciclo di buio, quando i ratti sono svegli, rispetto al ciclo di luce, quando i ratti dormono tipicamente (Figura 8C). Utilizzando un approccio simile, i ricercatori possono esplorare le differenze di gruppo nei modelli di consumo. Ad esempio, la microstruttura del bere può essere confrontata tra ratti maschi e femmine esaminando il numero medio di leccate per EtOH (Figura 8D) o acqua (Figura 8E) in un periodo di 24 ore. Per studiare il caricamento frontale e/o il binge-drinking like, i ricercatori possono aumentare la risoluzione della loro analisi per concentrarsi sul consumo di alcol che si verifica poco dopo l'inizio della sessione utilizzando una finestra più piccola per riassumere i dati. In questo modo i ricercatori possono studiare i periodi di binge drinking senza richiedere la raccolta di più pesi di bottiglia entro un periodo di 24 ore. Come mostrato in Figura 8C (riquadro), questa analisi rivela che la maggior parte del consumo catturato dal peso di una bottiglia ottenuto 30 minuti dopo l'inizio della sessione avviene nei primi 5 minuti, piuttosto che durante il periodo di 30 minuti. Dati come questi possono aiutare nell'identificazione di punti temporali ottimali per la raccolta di campioni di sangue per misurare la concentrazione di etanolo nel sangue (BEC). In effetti, un modello simile di caricamento frontale è stato osservato in un giorno di consumo separato durante il quale sono stati catturati modelli di consumo ad alta risoluzione in un periodo di soli 15 minuti (Figura 8F). Le leccate medie registrate durante questa sessione hanno previsto in modo affidabile la variazione del peso della bottiglia (EtOH: R² = 0,6316, F_(1,10) = 17,15, p = 0,0020; H₂O: R² = 0,8601, F_(1,10) = 61,47, p < 0,0001; Figura 8G). Inoltre, i BEC prelevati da campioni di sangue ottenuti 15 minuti dopo l'inizio della sessione erano ben correlati con il numero di leccate rilevate (R² = 0,4327, F_(1,10) = 7,627, p = 0,0201; Figura 8H) anche per livelli relativamente bassi di assunzione di EtOH.

LIQ HDR acquisisce varie misure della microstruttura del bere che vengono rilevate e calcolate in tempo reale durante le sessioni di consumo e salvate in contenitori di 1 minuto simili al rilevamento delle leccate (Figura 6K). Queste misure sono brevemente descritte nel passaggio 5.4 e definite in precedenza³⁰. I ricercatori possono condurre analisi dettagliate dei cambiamenti nella microstruttura individuale del consumo ed esaminare come e in che misura i modelli di consumo contribuiscono alle differenze nell'assunzione complessiva. Per illustrare, abbiamo scoperto che, sebbene i ratti maschi e femmine mostrassero un numero simile di leccate, attacchi di bevute e lunghezza dell'attacco (Figura 9A-C) quando bevevano acqua, questo era associato a una maggiore assunzione complessiva (g/kg) nelle femmine rispetto ai maschi (t-test; t=2,882, df=10, p=0,0163; Figura 9D). Questo è previsto dato il dimorfismo sessuale nel peso corporeo, che facilita maggiori livelli di assunzione in base al peso corporeo per le femmine rispetto ai maschi per un numero equivalente di leccate. Sorprendentemente, questo è in contrasto con il confronto delle differenze di sesso nei modelli di microstruttura per l'EtOH, che ha rivelato una microstruttura simile del bere associata a livelli simili di assunzione di EtOH (Figure 9E-H). Questi dati suggeriscono che, mentre il volume di leccata per l'acqua è simile tra i sessi, rispetto ai maschi, le femmine di ratto hanno un volume di leccata inferiore per l'EtOH. Insieme, questi dati microstrutturali supportano l'idea che i ratti maschi e femmine probabilmente differiscono nelle strategie di consumo volontario in base al tipo di liquido consumato nell'ambiente domestico-gabbia. Lavori precedenti hanno anche riportato differenze di sesso nelle strategie di consumo che dipendono dal tipo di fluido^40,41, sebbene le differenze osservate in questi studi non fossero limitate solo al consumo di acqua. La lunghezza della storia del consumo di alcol può svolgere un ruolo nelle differenze osservate tra gli studi, poiché il consumo di bevande a scelta in due bottiglie era limitato a 5 settimane nell'attuale set di dati, mentre superava le 12 settimane nel lavoro precedente^40,41.

Figura 1: Bere in gabbia a casa con due bottiglie. (A) I ricercatori possono misurare l'assunzione volontaria di etanolo nelle gabbie domestiche e la preferenza (rispetto all'acqua) utilizzando un approccio standard che calcola l'assunzione in base alla variazione del peso della bottiglia. Utilizzando LIQ HDR, un sistema di rilevamento delle leccate in gabbia domestica fai-da-te a basso costo progettato per i ratti, i ricercatori possono acquisire le stesse misure della procedura standard di scelta di due bottiglie, acquisendo anche la microstruttura del bere ad alta risoluzione durante l'intero periodo di registrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Costruzione di unità sensore capacitive. (A) Parti elettroniche e schema elettrico. (B) Materiali per la costruzione di tre unità sensore capacitive necessari per costruire un sistema LIQ HDR. (C) Saldare i cavi del connettore femmina a 2 pin per le gabbie #1-6 al pin A #0-11 della scheda e fissare i giunti di saldatura con colla a caldo. Cavi con codice colore con guaina termorestringente colorata ed etichetta, ciascuno con un numero ID leccometro univoco. (D) Collegare la scheda A e il traslatore di livello da 5 V a 3 V a un breakout di comunicazione differenziale I²C EndPoint con cavi a 4 pin (1) e alla scheda interna A e al breakout di comunicazione nell'involucro stampato in 3D (2-3). (E) Modificare gli indirizzi I²C delle schede B e C saldando un ponticello dal pin ADDR ai pin 3Vo e SDA, rispettivamente. (F) Saldare i cavi del connettore femmina a 2 pin alle schede dei sensori B e C, etichettare con gli ID del leccometro corrispondenti e collegare la scheda B a un punto intermedio di breakout di comunicazione e la scheda C a un punto finale con cavi a 4 pin. (G) Alloggiare le unità sensore B e C nelle rispettive custodie stampate in 3D e collegare a margherita tutte e tre le unità con cavi Ethernet. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Costruisci il lickometro LIQ HDR. (A) Rendering 3D dei componenti in gabbia. (B) Materiali per l'installazione di un leccometro a due bottiglie. Si noti che un sistema LIQ HDR ospita 18 leccometri a due bottiglie. (C) Estendere la lunghezza del cavo del connettore maschio a 2 pin con una coppia di fili neri e rossi e codice colore con guaina termorestringente. (D) Infilare i fili nero e rosso attraverso le aperture sinistra (L) e destra (R) sul portabottiglie (1) e saldare le estremità ai nastri di rame (2-3). (E) Far aderire i nastri di rame alle pareti interne delle staffe del sipper (1-2) e rinforzarli con colla a caldo (3-4). (F) Infilare il cavo attraverso la protezione del cavo. (G) Installare il fermacavo. (H) Etichettare il connettore con il numero ID del leccometro corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Installazione del lickometer. (A) Utilizzare del nastro isolante per isolare le aste metalliche attorno alle aperture del sipper sulla parte superiore della gabbia metallica. (B) Installare il licometro e il pannello acrilico sulla parte superiore della gabbia con due set di viti e dadi M5. (C) Fissare il fermacavo all'asta più esterna della parte superiore della gabbia metallica. (D) Assicurarsi di utilizzare la protezione del cavo appropriata (sinistra L o destra R) per ciascuna gabbia. (E) Assicurarsi che solo ~2 cm dei sorseggiatori siano esposti (1), in modo che quando le bottiglie vengono posizionate sulla gabbia (2) solo le punte dei sorseggiatori si estendano oltre il pannello acrilico e siano accessibili ai ratti. (F) La parte superiore del filtro deve adattarsi al fermacavo senza disturbare il cavo stesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Installazione e utilizzo del bloccatore di sorseggi. (A) Rendering 3D del bloccatore di sorseggi. (B) Parti stampate in 3D personalizzate per un bloccante del sorso. (C) Assemblare le parti stampate in 3D. (D) Installare il bloccante montato sulla parte superiore della gabbia con una vite M5 + dado + rondella. (E) Ruotare la manopola in senso orario per bloccare l'accesso ai sorseggiatori. (F) Ruotare la manopola in senso antiorario per rimuovere i bloccanti dai filtri (1), sollevare i bloccanti e ruotarli di 90° (2), quindi continuare a ruotare la manopola in senso antiorario finché i bloccanti non si trovano sopra la parte superiore della gabbia (3-4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Configurazione di Vivarium e funzionamento della GUI. (A) Configurazione e schema elettrico consigliati per il vivarium. (B) Montare ciascuna unità sensore sulla scaffalatura e disporre e stabilizzare i cavi del sensore sulla scaffalatura. (C) Montare l'interfaccia del microcontrollore sulla scaffalatura e collegare il suo ponticello a 4 pin al traslatore di livello da 5 V a 3 V collegato all'unità sensore A. (D) Fissare il filo di terra aggiuntivo con nastro isolante. (E) Collegare i cavi del sensore ai cavi del leccometro corrispondenti. (F) Collegare l'alimentatore per attivare l'interfaccia del microcontrollore. (G) Pagina principale dell'interfaccia GUI. (H) Toccare Impostazioni per regolare l'ora di accensione/spegnimento delle luci in base al programma di illuminazione del vivaio (1) e toccare Impostazioni sensore per regolare le soglie di tocco e rilascio per i ratti (2). (I) Per registrare i dati, selezionare il lato della bottiglia EtOH nella pagina principale, toccare INIZIA! per calibrare i sensori (1) e avviare la registrazione (2). Toccare Aggiorna per aggiornare il numero di lick visualizzato sullo schermo, quindi toccare Salva ed esci per interrompere la registrazione. (J) Toccare Espelli SD nella pagina principale per rimuovere la scheda SD e trasferire i dati. Toccare Monta SD dopo aver inserito la scheda SD. (K) Screenshot di un file di dati grezzi rappresentativo che illustra come i dati della microstruttura vengono salvati in 1 min bin dall'interfaccia del microcontrollore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Dati rappresentativi sul consumo di bevande a scelta di due bottiglie acquisiti utilizzando la procedura standard. Nel paradigma di consumo EtOH della gabbia domestica a due bottiglie ad accesso intermittente, (A) i ratti ricevono il 20% (v/v) di soluzione di EtOH (arancione) e H₂O (blu) il lunedì, mercoledì e venerdì (MWF) e due bottiglie contenenti H₂O il martedì, il giovedì e i fine settimana. (B) Le misure dell'assunzione giornaliera di liquidi rivelano che mentre i ratti mantengono un livello relativamente costante di assunzione totale di liquidi (mL) durante il periodo di studio, (C) i ratti mostrano spesso un'escalation nell'assunzione di EtOH nel corso delle prime sessioni di consumo, dopo di che i livelli di assunzione si stabilizzano. (D) Questo modello di escalation e manutenzione si riflette in modo analogo nella preferenza per l'EtOH. I ricercatori possono anche catturare l'assunzione di EtOH (E) simile a un'abbuffata se i pesi delle bottiglie vengono raccolti dopo i primi 30-60 minuti dell'inizio della sessione. (F) Questo è spesso associato a un'alta preferenza per EtOH rispetto a H₂O. Le barre di errore ombreggiate rappresentano ± SEM (n = 32 per i maschi e n = 16 per le femmine). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: LIQ HDR cattura accuratamente il consumo ad alta risoluzione temporale. La precisione e l'accuratezza del sistema LIQ HDR è confermata, in parte, dalla presenza di una significativa correlazione positiva tra il numero di leccate e la variazione del peso della bottiglia nei giorni in cui i ratti ricevono (A) H₂O ed EtOH e (B) giorni in cui entrambe le bottiglie contengono H₂O. (C) Differenze nei modelli di consumo tra H₂O (blu) ed EtOH (arancione) durante il periodo di consumo di 24 ore possono essere facilmente valutati raggruppando le leccate medie in intervalli di 30 minuti. Il riquadro corrisponde a leccate medie in contenitori di 5 minuti durante i primi 30 minuti di accesso alla bottiglia (evidenziati in grigio), durante i quali i ratti mostrano spesso un comportamento significativo di caricamento frontale. Le differenze tra i gruppi nei modelli di consumo possono anche essere esaminate utilizzando un approccio simile, come esemplificato dalla microstruttura del lick per (D) EtOH e (E) H₂O raffigurata per ratti maschi e femmine in un periodo di 24 ore. (F) I modelli di consumo possono anche essere valutati ad alta risoluzione temporale in un periodo di test più breve, (G) durante il quale LIQ HDR continua a monitorare accuratamente l'assunzione e (H) prevedere la concentrazione di etanolo nel sangue (BEC) anche per livelli relativamente bassi di assunzione di EtOH. Le barre di errore ombreggiate rappresentano ± SEM (n = 6 per ogni sesso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Dati rappresentativi sulla microstruttura del bere. LIQ HDR consente di acquisire misure della microstruttura del bere, tra cui (A) il numero di leccate, (B) il numero di bevute e (C) la durata della bevuta, oltre a (D) misurare l'assunzione totale di acqua in base a una variazione del peso della bottiglia. (E-H) Misure analoghe possono essere ottenute per l'etanolo. I confronti tra gruppi di queste misure possono identificare modelli di consumo distinti, come nel caso dell'esempio attuale, che rivela differenze di sesso nelle strategie di consumo basate sulla soluzione consumata. La linea continua indica la mediana e le linee tratteggiate indicano i quartili (n = 6 per ogni sesso); test t non appaiato; *P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare Figura 1: Configurazione dell'interfaccia del microcontrollore. (A) Parti elettroniche e schema elettrico. (B) Materiali per la costruzione dell'interfaccia del microcontrollore necessari per un sistema LIQ HDR. (C) Sul lato posteriore della protezione tattile capacitiva, aggiungere un ponticello di saldatura sui pad di saldatura posteriori lite. (D) Sul lato posteriore dello scudo di registrazione dati, recidere la traccia del ponticello del pin CS (1). Saldare un ponticello dal pin CS al pin #7 (2). (E) Saldare i pin dell'intestazione al data logger utilizzando lo schermo tattile come base. (F) Impilare l'intestazione 2x4 rimanente sul microcontrollore (1), impilare il data logger sul microcontrollore e saldare l'intestazione in posizione (2). (G) Inserire la batteria a bottone nel registratore di dati (1), impilare il touchscreen sul registratore di dati e inserire la scheda SD nel registratore di dati (2). (H) Per realizzare il filo di terra aggiuntivo, tagliare un connettore maschio dal cavo del ponticello e saldare l'estremità a un filo a nucleo solido spellato. (I) Collegare i ponticelli a 4 pin e il cavo di messa a terra supplementare al microcontrollore (1) e fissarli con colla a caldo (2). (J) Alloggiare l'interfaccia del microcontrollore nell'involucro personalizzato stampato in 3D. Per favore clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

L'attuale protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'acquisizione dei dati relativi al consumo di etanolo utilizzando una procedura di scelta della gabbia domestica a due bottiglie ad accesso intermittente. Questo metodo può essere implementato con relativa facilità e con costi minimi o nulli o con la necessità di attrezzature di ricerca specializzate. Utilizzando le procedure fornite qui per la costruzione e l'implementazione di LIQ HDR - un sistema di rilevamento delle leccate per l'uso nei ratti - i ricercatori possono acquisire dati ad alta risoluzione sulla microstruttura del bere oltre alle misure standard di assunzione e preferenza.

Il programma di accesso intermittente descritto nell'attuale protocollo è una procedura ampiamente utilizzata in gran parte perché è ben noto per generare livelli più elevati di assunzione di etanolo rispetto a molti programmi alternativi di accesso all'etanolo. In effetti, ricerche precedenti hanno dimostrato che i ratti con accesso intermittente hanno un'assunzione media giornaliera di etanolo più elevata rispetto ai ratti con accesso continuo 24 ore su 24 ^6,7. Tuttavia, possono essere auspicabili diversi programmi di accesso all'etanolo a seconda della domanda di ricerca o di altri parametri di progettazione sperimentale. I ricercatori possono facilmente modificare il protocollo corrente per adattarsi a diversi orari (ad esempio, accesso continuo, bere al buio, ecc.) semplicemente cambiando l'orario e i giorni di accensione/spegnimento della bottiglia.

Sebbene il consumo di due bottiglie sia un paradigma relativamente semplice da implementare, possono sorgere problemi che possono compromettere la raccolta dei dati. È quindi fondamentale che gli sperimentatori ispezionino i dati su base giornaliera al fine di identificare rapidamente potenziali problemi. In particolare, i ricercatori dovrebbero prestare molta attenzione a cambiamenti molto grandi o molto piccoli nel peso delle bottiglie che possono essere indicativi di un sorso che perde o intasato, rispettivamente. Individuare tempestivamente i segnali di questi problemi può impedire l'esclusione dall'analisi di tutti i dati di un determinato argomento. Infatti, se i ricercatori notano cambiamenti drastici (o l'assenza di cambiamenti) nel peso della bottiglia in un periodo di 24 ore, un semplice passaggio a una nuova bottiglia può aiutare a confermare se una determinata bottiglia deve essere rimossa dalla circolazione. Per questi motivi, è consigliabile avere a portata di mano bottiglie e sorseggiatori extra. Tuttavia, va notato che alcuni ratti mostrano naturalmente livelli molto bassi di consumo di etanolo, ad esempio ³⁵. Ciò è particolarmente vero per i ratti di certi ceppi, vedi⁸ per una recensione. Pertanto, i ricercatori non dovrebbero allarmarsi se una piccola popolazione di animali in un determinato esperimento ha un consumo basso o nullo di etanolo. Allo stesso modo, alcuni animali sono inclini a giocare con il sorseggiatore/bottiglia in modi che possono favorire la fuoriuscita. Sebbene rari, casi ripetuti di elevate variazioni del peso della bottiglia che non sono associati al consumo possono richiedere che un particolare animale venga rimosso dall'esperimento.

Il nostro dettagliato protocollo passo-passo dimostra la facilità di implementazione e utilizzo del sistema LIQ HDR per i ratti. I ricercatori senza conoscenze o competenze pregresse nell'elettronica e nella programmazione dei microcontrollori possono facilmente adattare questo sistema alle loro esigenze sperimentali con poche o nessuna modifica. I nostri dati rappresentativi dimostrano ulteriormente la sua applicazione di successo per gli studi sull'abbeveraggio domestico in gabbia di ratto e la sua potente capacità di catturare numerose misure di microstruttura dell'acqua potabile ad alta risoluzione temporale. LIQ HDR include diverse modifiche al design rispetto al suo predecessore del mouse³⁰. Ciò è stato fatto non solo come necessità per il successo dell'adattamento per l'uso nei ratti, ma anche per migliorare la funzionalità e l'esperienza dell'utente. I componenti all'interno della gabbia, tra cui il portabottiglie stampato in 3D, il bloccante del sorso e i componenti elettronici, vengono riposizionati sulla parte superiore della gabbia per proteggerli dalla masticazione, che può comportare una perdita di dati frequente e significativa e un turnover dell'hardware. L'aggiunta di un pannello acrilico tagliato al laser aiuta ulteriormente a prevenire la distruzione di questi componenti vulnerabili. A parte il pannello acrilico, che è lo stesso materiale di una gabbia per topi standard per scatole da scarpe, tutti gli altri componenti LIQ HDR sono inaccessibili all'animale dall'interno della gabbia o accessibili solo per un breve momento durante il cambio della bottiglia. Questo design limita il potenziale di distruzione dei componenti del dispositivo e il rischio per l'animale attraverso l'ingestione di prodotti non alimentari. A differenza delle bottiglie su misura relativamente laboriose utilizzate nel design LIQ HD, il portabottiglie stampato in 3D di LIQ HDR è progettato per essere compatibile con le bottiglie per roditori commerciali pronte all'uso. Le bottiglie sono installate sulla parte superiore della gabbia e accessibili ai ratti in modo molto simile a come le bottiglie vengono applicate durante le cure e l'allevamento standard. L'aggiunta di bloccanti è una soluzione semplice ma efficace che migliora l'affidabilità del sistema e previene la perdita di dati preziosi che, in assenza del bloccante, può derivare dal consumo di alcol che si verifica prima di avviare l'acquisizione dei dati sull'interfaccia Arduino o da misure di leccamento errate che si verificano quando i ratti interagiscono con i sorseggiatori durante la calibrazione giornaliera. Mentre le gabbie per ratti considerevolmente più grandi richiedono un aumento delle dimensioni del design hardware originale, l'uso di cavi significativamente più lunghi può influire negativamente sulla sensibilità e sull'accuratezza del rilevamento capacitivo a causa delle interferenze, nonché sull'integrità della comunicazione I²C tra le schede dei sensori collegate a margherita e l'interfaccia Arduino. Aggiriamo questo problema con l'adozione del sistema di comunicazione differenziale I²C per ottenere una trasmissione del segnale a lunghissimo raggio e quasi senza perdite attraverso cavi Ethernet. I materiali utilizzati per i componenti all'interno della gabbia consentono una facile pulizia e disinfezione tra un utilizzo e l'altro. Il leccometro può essere sterilizzato e pulito con una soluzione di EtOH al 70%, mentre è necessario prestare attenzione per garantire che i componenti elettrici, come il nastro di rame conduttore, rimangano intatti. Le apparecchiature non elettriche che sono a diretto contatto con l'animale, come il bloccante e il pannello acrilico, possono essere lavate accuratamente con acqua tiepida e sapone.

L'affidabilità e l'efficacia di qualsiasi sistema di rilevamento delle leccate richiedono una costruzione e un'installazione adeguate, nonché test approfonditi, un monitoraggio diligente degli errori e un'efficace risoluzione dei problemi. Tutti i componenti fai-da-te devono essere realizzati e assemblati con abilità e cura. Ciò è particolarmente importante per le fasi che coinvolgono la saldatura, che possono richiedere pratica per i principianti. Indipendentemente da ciò, sono necessari test approfonditi di tutti i leccometri prima dell'uso negli esperimenti reali. Se il sistema deve essere modificato per adattarsi alle esigenze sperimentali individuali, potrebbe essere necessario regolare ulteriormente le impostazioni del sensore (ad esempio, le soglie di tocco e rilascio) per un rilevamento accurato del lick. Per gli utenti alle prime armi, suggeriamo di testare il sistema in un breve studio pilota su piccoli campioni utilizzando una soluzione altamente appetibile che genererà alti livelli di consumo. Il rilevamento delle leccate può essere verificato in tempo reale ispezionando visivamente la scheda del sensore poiché il LED lampeggia ogni volta che viene registrata una leccata. Correlazioni forti, significative e coerenti tra il numero di leccate e la variazione del peso della bottiglia dovrebbero essere utilizzate come punto di riferimento per una corretta configurazione hardware e software. Anche dopo che la configurazione è stata finalizzata, si consiglia di avviare la registrazione per un determinato esperimento in un giorno in cui i ratti ricevono due bottiglie contenenti acqua al fine di risolvere i problemi dell'apparecchiatura che possono essere evidenti all'inizio di un esperimento. Può anche essere vantaggioso testare la funzione del leccometro nel giorno dell'acqua associato al cambio della gabbia poiché ciò richiede che i leccometri siano scollegati e ricollegati al sensore. Il guasto casuale di un singolo leccometro o sensore, che comporterebbe dati anomali molto evidenti (ad esempio, nessuna o poche leccate rilevate nonostante una variazione sostanziale del peso della bottiglia) in modo coerente per lo stesso leccometro, è indicativo di componenti difettosi. Si consiglia di preparare in anticipo componenti aggiuntivi per ogni elemento del sistema lickometer per consentire una facile sostituzione, se necessario. Infine, l'importanza di assicurarsi che i cavi dei sensori non si sovrappongano o si pieghino eccessivamente non può essere sottovalutata. Ciò può comportare casi casuali di scarso rilevamento delle leccate, evidenti da un numero di leccate irragionevolmente basso per una data variazione del peso della bottiglia o da durate di leccate estremamente elevate (vicine a 60.000 ms per un contenitore da 1 minuto) che si estendono su minuti o ore. Tuttavia, piccole perdite di dati sono inevitabili negli studi che raccolgono dati nell'arco di 24 ore per molti animali per molti giorni utilizzando l'approccio standard o dotato di leccometro. I ricercatori possono escludere dati errati per le rare sessioni di consumo in cui i pesi e/o le leccate delle bottiglie non riflettono chiaramente l'assunzione (ad esempio, intasamento del sorso, errore di calibrazione, ecc.). In occasioni come queste, il valore medio per una determinata misura (ad esempio, assunzione (g/kg), leccate, ecc.) durante il periodo di studio per quel particolare soggetto può essere sostituito al valore mancante durante l'analisi dei dati. L'ANOVA a effetti misti può essere utilizzata anche come alternativa per gestire i punti dati mancanti.

Uno dei vantaggi del paradigma di consumo a scelta delle due bottiglie è l'aspetto volontario dell'assunzione di etanolo. Ciò offre un'eccellente validità apparente, in particolare alla luce dei risultati che dimostrano che l'alcol somministrato dallo sperimentatore può produrre effetti significativamente diversi sulla funzione cerebrale e sul comportamento rispetto all'alcol autosomministrato volontariamente⁴². Inoltre, la natura volontaria del paradigma consente ai ricercatori di catturare le differenze individuali nell'assunzione simili alla variabilità della preferenza per l'alcol e dei modelli di consumo osservati negli esseri umani. Queste differenze individuali possono fornire una potente opportunità per i ricercatori di correlare il consumo (assunzione e/o modelli) con l'entità degli effetti patologici osservati.

Tuttavia, è necessario considerare alcune limitazioni del paradigma del consumo in gabbia domestica a due bottiglie. Ad esempio, sebbene la variabilità individuale nell'assunzione di etanolo possa essere vantaggiosa per alcuni esperimenti, può essere uno svantaggio in altri esperimenti in cui può essere auspicabile un livello costante di intossicazione o esposizione all'etanolo. Ciò è particolarmente vero per gli esperimenti che esaminano le conseguenze della dipendenza e dell'astinenza dall'esposizione cronica all'etanolo. È importante sottolineare che il consumo di due bottiglie non è caratterizzato come un modello di dipendenza, anche nei ratti con accesso all'etanolo per periodi di tempo prolungati. Pertanto, in assenza di sintomi di astinenza, i ricercatori dovrebbero usare cautela nell'interpretare le conseguenze del consumo prolungato di etanolo come effetti della dipendenza e/o dell'astinenza. In effetti, è possibile, se non plausibile, che i ratti che bevono quantità relativamente elevate di etanolo durante la procedura di scelta delle due bottiglie mostrino sintomi di astinenza, ma che i ratti che bevono volumi totali inferiori in un dato periodo di 24 ore non mostrino segni di dipendenza simili. Anche i modelli di consumo possono svolgere un ruolo importante in questa considerazione, poiché due animali che bevono la stessa quantità per un periodo di 24 ore possono sperimentare livelli di intossicazione molto diversi (cioè BEC) a seconda del modello di assunzione di etanolo²². Ciò evidenzia l'utilità di LIQ HDR nella procedura di scelta delle due bottiglie in quanto è in grado di identificare facilmente i ratti che consumano una determinata dose di etanolo a una velocità elevata (ad esempio, inghiottire) rispetto a quelli che consumano la stessa dose a una velocità molto più lenta (ad esempio, sorseggiare). Sebbene potenzialmente indesiderabile per gli studi che indagano gli effetti di una dose controllata di etanolo, il rilevamento di cambiamenti nei modelli di consumo (ad esempio, riduzione degli episodi di abbuffata) a seguito di un particolare intervento sperimentale ha un valore traslazionale significativo dato l'approccio di riduzione del danno che è sempre più perseguito in clinica. Infine, non è richiesto alcuno sforzo affinché gli animali abbiano accesso all'etanolo nei paradigmi di consumo domestico in gabbia, incluso quello qui descritto. Pertanto, l'utilità di questo paradigma è limitata all'analisi del solo bere, mentre i metodi operanti sono favoriti per i casi in cui i ricercatori sono interessati a esaminare la ricerca di alcol - una caratteristica importante dell'AUD.

In sintesi, il protocollo qui descritto fornisce ai ricercatori tutte le informazioni e le risorse necessarie per misurare l'assunzione di etanolo nei ratti nell'ambiente domestico della gabbia. Presentiamo opzioni per approcci a risoluzione relativamente bassa e alta, fornendo ai ricercatori la flessibilità di scegliere il metodo più adatto alle loro esigenze di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Componenti disponibili in commercio			Quantity
12-Key capacitive touch sensor breakout (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-Pin cable matching pair (JST XH 2,5mm passo)	Adafruit	4872	18
4-Pin breadboard jumper (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
Cavo a 4 pin (100 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
Cavo a 4 pin (50 mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
breakout del traslatore di livello da 5 V a 3 V	Adafruit	5637	1
Schermo tattile capacitivo (2,8 pollici)	Adafruit	1947	1
Nastro conduttivo in rame (1/4 di pollice)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Dati scudo per registrazione	Adafruit	1141	1
Kit breakout di comunicazione differenziale I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Nastro isolante	DigiKey	3M156004-ND	1
Guaina termorestringente (3/16 pollici vari colori)	Fascette e altro	HS357-S10	6
Kit guaina termorestringente (4 pollici nero)	Jameco	2095963	1
Batteria a bottone al litio (3 V 12,5 mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
rondella piatta	M5 Grainger	54FN66	1
dado esagonale M5	Grainger	6CA72	1
vite a macchina M5 (12 mm)	Grainger	6GU88	1
vite a macchina M5 (25 mm)	Grainger	6GU91	2
Cavo jumper maschio/maschio	Adafruit	1957	1
Scheda microcontrollore (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
filamento PETG (2,85 mm argento)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
filamento PLA (2,85 mm nero)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
filamento PLA (2,85 mm argento)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Alimentatore (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
Scheda di memoria SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Shield stacking headers	Adafruit	85	1
Filo solid-core (22AWG rosso)	Adafruit	288	1
Cavo stranded-core (22AWG nero)	Adafruit	2976	1
Filo a trefoli (22AWG rosso)	Adafruit	3068	1
tubo sipper con tappo a torsione con sfera	Design alternativo	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Borraccia (8 once)	Design alternativo	WB8FS	38
Componenti stampati in 3D personalizzati			Quantità
della custodia Arduino stampato in 3D	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
Parte superiore della custodia Arduino stampata in 3D	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
Clip per cavo stampato in 3D L	N/A	CLIP_L.stl	18
Dado per clip per cavo stampato in 3D	N/A	CLIP_Nut.stl	18
Clip per cavo stampato in 3D R	N/A	CLIP_R.stl	18
Portabottiglie per leccometro stampato in 3D	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Proteggi cavo per lickometro stampato in 3D L	N/	A LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Proteggi cavo per lickometro stampato in 3D R	N/	A LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
lettere per lickometro stampate in 3D	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
Vite di montaggio stampata in 3D	N/A	Vite di montaggio.stl	4
Custodia del sensore stampata in 3D A inferiore	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D A superiore	/A	SENSOR_A_Top.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D B inferiore	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D B superiore	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D C inferiore	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Custodia del sensore stampata in 3D C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Lettere della custodia del sensore stampate in 3D	N/A	SENSOR_Letters.stl	1
Bloccante del sensore stampato in 3D	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
Base del bloccante del sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Base.stl	18
Ingranaggio del bloccatore del sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
Dado bloccante per sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Vite senza fine per bloccante per sipper stampato in 3D	N/A	SIPPER_Worm.stl	18
Pannello acrilico lickometer tagliato al laser	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19