Sistemi modello di tessuto organotipico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro

Sommario

Il presente protocollo delinea l'applicazione di modelli tissutali organotipici per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro. In particolare, il sistema modello descritto utilizza un epitelio orale multistrato esposto a microrganismi associati a biofilm (placca dentale) nel contesto della salute orale rispetto alla malattia.

Abstract

Ricapitolare l'interfaccia ospite-patogeno alla barriera epiteliale o mucosale in vitro rimane una prospettiva impegnativa per i biologi delle infezioni. Mentre i monostrati epiteliali 2D cresciuti internamente non rappresentano realmente la situazione in vivo , i modelli di tessuto disponibili in commercio sono spesso trascurati a causa del loro costo e della loro praticità. Tuttavia, con un'attenta pianificazione, tali modelli forniscono piattaforme riproducibili per una vasta gamma di applicazioni diverse. Qui, riportiamo l'uso di modelli epiteliali che possono essere utilizzati per un'ampia varietà di scopi sperimentali per studiare le interazioni ospite-patogeno in varie nicchie ecologiche, come il cavo orale, la pelle e la mucosa vaginale. Dalle semplici cellule planctoniche alla complessa co-coltura di biofilm, i modelli epiteliali vengono utilizzati per valutare l'aderenza e l'invasione microbica e per valutare la risposta dell'ospite a livello trascrizionale e/o proteico, con la possibilità di una profilazione più dettagliata utilizzando diversi approcci omici. Inoltre, questi sistemi biologici possono essere utilizzati come banchi di prova più accurati per valutare l'attività antimicrobica convenzionale e nuova in un complesso microambiente ospite-patogeno in vitro. I protocolli qui descritti documentano come i modelli vengono maneggiati all'arrivo e preparati in laboratorio per la stimolazione di co-coltura con le comunità di biofilm. I metodi descrivono in dettaglio come si ottengono i risultati sperimentali dai sistemi modello, tra cui l'elaborazione dei tessuti, l'impostazione della co-coltura e la generazione dei dati. Questi esperimenti includono l'espressione genica dell'ospite attraverso analisi qPCR singole e multiplex e il rilevamento di proteine infiammatorie mediante ELISA. In conclusione, i modelli epiteliali forniscono utili sistemi in vitro per studi investigativi preclinici su interazioni ospite-patogeno semplici o complesse.

Introduzione

I sistemi modello in vitro forniscono eccellenti banchi di prova per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Questi sistemi organotipici hanno lo scopo di ricapitolare il microambiente di diverse nicchie ecologiche soggette a perturbazioni microbiche. Sono stati pubblicati numerosi articoli di ricerca utilizzando modelli tissutali EpiSkin (ex SkinEthic) per valutare le interazioni ospite-patogeno nella cavità orale 1,2,3,4,5, nella barriera cutanea ^{6,7,8,9,10,11} e nella mucosa vaginale ^5,12,13, tra gli altri^14,15. A differenza della coltura cellulare "bidimensionale" o "2D", che si basa sull'uso di monostrati di linee cellulari epiteliali esposte a microrganismi, questi modelli disponibili in commercio sono costituiti da più strati di cellule differenziate coltivate in un'interfaccia aria-liquido. Sebbene più economici e spesso considerati più riproducibili, i sistemi di coltura 2D sono soggetti a danni cellulari quando vengono coltivati con microrganismi, che non sempre rappresentano accuratamente le barriere epiteliali o mucose in vivo^16,17.

Prove recenti dimostrano che le tecniche di coltura "tridimensionali" o "3D" stanno diventando sempre più popolari in varie discipline scientifiche, tra cui le scienze del cancro, la ricerca sulle cellule staminali e la scoperta di farmaci^16,18. Nel contesto della biologia delle infezioni, i modelli tissutali 3D possono essere utilizzati per indagini sulle interazioni ospite-batterio, fungino o specie miste all'interfaccia della barriera epiteliale o mucosa all'interno di un microambiente controllato in vitro. Questi modelli presentano molti vantaggi ai sistemi di coltura 2D, consentendo la valutazione della colonizzazione e/o dell'invasione tissutale da parte di organismi patogeni o comunità di biofilm complessi¹⁷ e valutando le risposte dell'ospite a livello multi-componente per diversi biomarcatori in cui i modelli 2D sono talvolta limitati dai loro profili trascrizionali o proteomici 16,17,18. In definitiva, le applicazioni precliniche di tali sistemi 3D sono vaste e forniscono importanti dati esplorativi che possono essere portati avanti in modelli in vivo o studi clinici.

Nel contesto della salute e della malattia orale, la comprensione delle vie infiammatorie coinvolte sulla superficie della mucosa orale è importante per i medici, in quanto ciò può indirizzare le modalità di trattamento. Studi precedenti hanno dimostrato che i biofilm "associati alla salute" possono suscitare risposte infiammatorie minime 3,19,20,21. Ciò può derivare da una minore carica microbica associata alla salute orale o dalla composizione del biofilm con Streptococcus spp., ampiamente considerato immunomodulatorio ^22,23. D'altra parte, i biofilm costituiti da microrganismi associati alla malattia come Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis sono di natura pro-infiammatoria 3,20,24,25,26,27. Una revisione di Mountcastle et al. nel 2020 ha descritto tutti i modelli di co-coltura rilevanti esistenti all'epoca per il microambiente orale¹⁷. Sebbene tali modelli organotipici siano abbondanti, con diversi prodotti dal^28,29, rimangono una serie di ostacoli impegnativi associati alla creazione di tali modelli 3D. Per citarne alcuni, questi modelli richiedono un'ottimizzazione significativa e sono altamente laboriosi e dispendiosi in termini di risorse e manodopera; La riproducibilità può anche essere molto variabile a meno che non sia attentamente controllata^16,17. I modelli disponibili in commercio eludono tali problemi, fornendo piattaforme per lo studio delle interazioni ospite-patogeno all'interno della cavità orale e in altre nicchie ecologiche del corpo umano.

Per riassumere, l'attuale protocollo mira a delineare l'applicazione di modelli tissutali organotipici per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro nel contesto della salute orale e della malattia. In particolare, il sistema modello descritto utilizza un epitelio orale multistrato disponibile in commercio esposto a una comunità di biofilm definita rappresentativa della malattia infiammatoria orale, la gengivite.

Protocollo

Il seguente protocollo prevede la preparazione di un biofilm multispecie rappresentativo della gengivite, contenente un totale di 7 specie (spp.)^7,30. Tre Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) e Streptococcus oralis (NTCC 11427) sono inclusi per imitare la salute orale, agendo come colonizzatori iniziali della pellicola salivare. Vengono poi aggiunti quattro microrganismi anaerobi associati al passaggio dalla salute orale alla malattia: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) e due sottospecie Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) e Fusobacterium nucleatum (subspp.) vincentii (DSM 19507). Tutte le fasi coinvolte sono condotte in modo asettico alla fiamma o in un armadio di sicurezza di classe II. Tutti i terreni e la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) utilizzati per le preparazioni microbiologiche vengono sterilizzati in autoclave prima dell'uso e la sterilità viene valutata a intervalli regolari durante il protocollo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione di comunità microbiche per la co-coltura

NOTA: Questo protocollo descrive la generazione di un biofilm multispecie rappresentativo dei consorzi associati all'infiammazione del tessuto gengivale, nota anche come gengivite. Tale modello è stato utilizzato per la valutazione della risposta dell'ospite nella salute orale e nella malattia, come precedentemente descritto³.

1. Ravviva tutte e tre le specie di Streptococcus su piastre di agar sanguigno (Columbia Blood Agar base contenente il 5% di sangue di cavallo defibrinato sterile) da stock congelati di perle porose (ottenute commercialmente) contenenti i microrganismi conservati a -80^°C. Ciò si ottiene utilizzando un anello di inoculazione e la tecnica della piastra a strisce.
   1. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO₂, quindi isolare 3-4 colonie per la propagazione in 10 mL di terreno di brodo di soia triptone. Brodi di coltura per 16-18 ore a 37 °C, 5% CO₂.
2. Per i patogeni intermedi, ravvivare V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum e F. nucleatum subspp. Vincentii anaerobicamente su base Agar Anaerobica Fastidiosa contenente il 5% di sangue di cavallo defibrinato sterile per 48 ore a 37 °C, prima della coltura in brodo di Schaedler per ulteriori 24-48 ore nelle stesse condizioni.
3. Dopo la crescita, sospendere le cellule in pellet mediante centrifugazione per 5 minuti, 20 °C a 3000 x g, quindi lavare i pellet in 10 mL di PBS sterile (pH 7,2-7,6). Sospendere nuovamente le celle a pellet mediante centrifugazione per 5 minuti, 20 °C a 3000 x g, quindi ripetere le fasi di lavaggio per la seconda volta. Risospendere le cellule lavate in 10 mL di PBS sterile per la standardizzazione.
4. Standardizzare tutti e tre gli Streptococcus spp. singolarmente utilizzando uno spettrofotometro a 550 nm. Valori di assorbanza di 0,50 (intervallo da 0,45 a 0,55 accettabile) sono indicativi di una conta cellulare di ~1 x 10⁸ cellule/mL, come precedentemente determinato utilizzando la tecnica di conteggio delle cellule Miles e Misra³¹. Per ottenere questa lettura dell'assorbanza, diluire ulteriormente 10 mL di sospensioni cellulari lavate in PBS sterile.
5. Dopo la standardizzazione, diluire tutto lo Streptococcus spp. 1:10 a 1 x 10⁷ cellule/mL in una miscela 1:1 di Brodo Todd Hewitt (THB) e terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Aggiungere 500 μl di sospensioni cellulari mediante pipettaggio in una piastra di coltura tissutale per microtitolazione a 24 pozzetti contenente un disco di idrossiapatite di 13 mm di diametro. Lasciare maturare i biofilm per 24 ore a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: I biofilm multispecie possono essere coltivati su diversi substrati orali come smalto, dentina³² e superfici protesiche in poli(metilmetacrilato)^33,34. Per questi modelli possono essere utilizzati anche terreni alternativi, come la saliva artificiale o sintetica, anche se è necessario fare un'attenta considerazione a seconda dei consorzi di microrganismi utilizzati: gli studi hanno dimostrato che la selezione del terreno di crescita ha importanti implicazioni per la crescita di biofilm in comunità mista^35,36.
6. Il giorno successivo, standardizzare i quattro microrganismi anaerobi in modo simile a quanto sopra (passaggi 1.2-1.4). Le sospensioni di celle a pellet, lavare due volte, quindi standardizzare V. dispar a 0,50 di assorbanza (intervallo da 0,45 a 0,55) e i tre microrganismi rimanenti a 0,20 di assorbanza (intervallo da 0,18 a 0,22). Una volta standardizzate, diluire ulteriormente tutte le sospensioni 1:10 a 1 x 10⁷ cellule/mL in una miscela 1:1 di THB e RPMI.
7. Rimuovere con cura le cellule non aderenti e i terreni esausti ed eliminarli dai biofilm di Streptococcus mediante pipettaggio. Sostituire i pozzetti della piastra per microtitolazione con 500 μL di sospensioni standardizzate 1 x 10⁷ cellule/mL dei quattro anaerobi. Coltura di biofilm per 24 ore in condizioni anaerobiche a 37 °C.
8. Dopo 24 ore, rimuovere le cellule non aderenti e i terreni esauriti dai biofilm di 7 specie e sostituirli con 500 μL di miscela sterile 1:1 di terreni THB: RPMI. I biofilm vengono lasciati maturare in modo anaerobico a 37 °C per 4 giorni, con la rimozione del terreno e il reintegro su base giornaliera (quattro cambi di terreno in totale).
9. Il giorno 7, il biofilm multispecie è completamente maturo e pronto per gli esperimenti a valle. Lavare i biofilm due volte con 500 μL di PBS sterile per l'uso in co-coltura.
   NOTA: I biofilm possono essere profilati utilizzando una serie di metodologie biologiche come la qPCR (per la valutazione della composizione) e la profilazione microscopica con microscopia confocale o elettronica come descritto in precedenza³.

2. Manipolazione organotipica dei tessuti e impostazione sperimentale

NOTA: La configurazione sperimentale descritta di seguito coinvolge il tessuto dell'epitelio orale umano (HOE) composto da cellule TR146 coltivate su un filtro a membrana in policarbonato inerte. Esistono altri modelli, tra cui i modelli dell'epidermide, dell'epitelio vescicale, esofageo, corneale, gengivale e vaginale. Tutti i modelli vengono maneggiati e preparati in modo simile a quello descritto di seguito per lo studio delle interazioni ospite-patogeno.

1. All'arrivo, disimballare e trasferire il tessuto e i terreni HOE in un armadio di sicurezza di classe II. Aggiungere un totale di 1 mL di terreno di mantenimento fornito con il tessuto a piastre a 12 pozzetti.
2. Rimuovere gli inserti in policarbonato contenenti l'HOE con una pinzetta sterile dalle piastre a 24 pozzetti e dall'agar nutriente utilizzati per la spedizione e trasferirli nelle piastre a 12 pozzetti contenenti il terreno, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria sotto il tessuto. Assicurarsi che l'agar in eccesso attaccato ai lati o al fondo degli inserti sia stato rimosso con cura utilizzando un paio di pinzette aggiuntive o carta velina.
3. Incubare i modelli di tessuto per 24 ore a 37 °C, 5% di CO₂ prima della configurazione sperimentale per acclimatarsi alle condizioni di laboratorio dopo la spedizione. È interessante notare che sono disponibili ulteriori terreni di manutenzione o di crescita per un mantenimento più lungo o un'ulteriore maturazione dei modelli tissutali.
4. Ora è possibile condurre esperimenti di co-coltura. Per l'esempio qui fornito, rimuovere i biofilm di 7 specie creati come sopra (passaggi 1.1-1.9) dai loro substrati mediante sonicazione. Per ottenere ciò, rimuovere i dischi di HA contenenti biofilm dal fondo delle piastre a 24 pozzetti utilizzando un ago e una pinzetta da 19 G, quindi trasferire un bijoux contenente 1 mL di PBS sterile di Dulbecco. Sonicare a 35 kHz per 10 minuti in un bagno d'acqua di sonicazione.
5. Rimuovere con cura gli inserti contenenti i modelli di tessuto utilizzando una pinzetta dall'acclimatazione notturna e aggiungere 100 μl di sospensione sonicata di biofilm direttamente al tessuto mediante pipettaggio. Utilizzare tessuti di controllo non stimolati a scopo comparativo. Per questi inserti di tessuto di controllo, aggiungere 100 μl di PBS sterile di Dulbecco senza la sospensione di biofilm.
   NOTA: Le cellule planctoniche, i surnatanti di biofilm esauriti contenenti cellule disperse o i biofilm interi possono essere utilizzati per il modello di co-coltura al posto del biofilm sonicato. Diverse applicazioni per questi modelli ospite-patogeno che utilizzano diversi stimolanti microbici sono schematizzate nella Figura 1 come documentato altrove 3,5,6,8,13,37,38.
6. Dopo l'aggiunta, trasferire gli inserti in un'altra piastra a 12 pozzetti contenente 1 mL di terreno di manutenzione fresco, assicurandosi ancora una volta che non siano presenti bolle d'aria sotto gli inserti. Incubare piastre contenenti modelli di tessuto per 24 ore a 37 °C, 5% di CO₂ prima del trattamento dei tessuti per applicazioni a valle.
   NOTA: I fornitori di tessuti possono fornire terreni aggiuntivi per supportare la coltura continua del tessuto dopo l'esposizione ad aggregati sonicati o biofilm. A tal fine, sono stati pubblicati diversi modelli precedenti che studiano l'inoculazione prolungata di tessuto-biofilm 21,28,39. Per ottenere risultati simili utilizzando l'attuale modello organotipico, sonicare il tessuto (come sopra, passaggio 2.6) e lasciare che i microrganismi si attacchino per 24 ore. Scartare la sospensione microbica rimanente e continuare la coltura all'interfaccia aria-liquido per il tempo sperimentale richiesto.

3. Processamento tissutale per i risultati sperimentali

NOTA: Dopo la co-coltura, i modelli di tessuto vengono elaborati per i risultati sperimentali. I passaggi seguenti documentano il modo in cui l'RNA viene estratto dal tessuto per la profilazione trascrizionale e il modo in cui i terreni di coltura esausti vengono utilizzati per la rilevazione delle proteine. Il tessuto può anche essere fissato in formalina, paraformaldeide o un fissativo simile per la valutazione istologica, come descritto in precedenza ^3,6.

1. In primo luogo, preparare 350 μL di tampone di lisi RLT in provette O-Ring da 2,0 mL con tappo a vite contenenti l'1% di β-mercaptoetanolo e ~100 μL equivalenti di perle di vetro lavate con acido da 0,5 mm.
2. Rimuovere gli inserti contenenti il tessuto dal terreno utilizzando una pinzetta ed eliminare l'eventuale sospensione microbica rimanente dall'inserto. Quindi, tieni premuto, capovolto, all'altezza degli occhi per facilità. Utilizzando un ago da 19 G, affettare con cura il tessuto e la membrana dal fondo dell'inserto e trasferirlo nel tampone RLT.
   1. Omogeneizzare il tessuto a 30 s utilizzando un omogeneizzatore da banco a frusta di microsfere, quindi estrarre l'RNA dal lisato seguendo le istruzioni del produttore del kit di estrazione dell'RNA (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: L'RNA estratto viene utilizzato per la sintesi del cDNA per profilare l'espressione dei geni delle citochine e delle chemochine come marcatori di infiammazione utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) o il sequenziamento dell'RNA. La qPCR si ottiene utilizzando array multiplex come l'array di profilatori PCR RT₂ contenente pozzetti con primer già pronti per geni specifici o il reagente a base di verde SYBR con sequenze di primer progettate internamente e ddH₂O³ privo di nucleasi.
3. Raccogliere i terreni tissutali esausti rimanenti (~850-900 μL) per le analisi proteomiche utilizzando metodologie a basso e alto rendimento come ELISA, saggi immunologici multiplex o analisi di biomarcatori proteici multiplex⁷.
4. Utilizzando i terreni di coltura esausti, valutare una serie di marcatori associati all'infiammazione a livello proteico. I mezzi esausti possono essere utilizzati direttamente per le metodologie di cui sopra (fase 3.3) o conservati a -20 °C o -80 °C. Evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento dei mezzi per tali analisi.
   NOTA: Potrebbe essere necessario diluire il terreno 1:10 a seconda dello stimolante tissutale per un'accurata profilazione proteomica utilizzando ELISA.

Risultati

In questo esperimento, HOE è stato esposto a 7 specie di biofilm sonicato contenente l'organismo rappresentativo del passaggio dalla salute orale all'infiammazione delle gengive (nota come gengivite). Questa malattia deriva dall'infiammazione del tessuto epiteliale gengivale o orale a causa di perturbazioni microbiche dovute all'accumulo di placca dentale sulla superficie del dente. Dopo la stimolazione, il tessuto e i terreni esauriti vengono utilizzati per le analisi trascrizionali e proteomiche, come discusso in precedenza. Per questo esperimento, l'espressione genica di un pannello di biomarcatori infiammatori è stata rilevata nel tessuto dopo la stimolazione con biofilm sonicato (Figura 2). Ciò è stato ottenuto utilizzando un array di profilatori RT₂ PCR personalizzato contenente 16 geni diversi e l'espressione genica è stata mostrata come variazione di piega rispetto al tessuto non stimolato in seguito alla normalizzazione del gene GAPDH. La stimolazione microbica ha aumentato l'espressione di tutti i geni ad eccezione di CXCL5, con differenze statistiche osservate per NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B e TLR4 (Figura 2A). La maggiore variazione di piega è stata osservata per CCL2, CXCL1 e CSF3, con aumenti rispettivamente di 16,9, 10,3 e 15,1 (Figura 2B).

I terreni HOE esauriti sono stati utilizzati per le analisi proteomiche per rilevare le proteine prodotte e rilasciate dal tessuto dopo la stimolazione. Questo è utile per determinare se l'espressione genica è correlata alla produzione di proteine. Per fare ciò, l'espressione genica di IL8 e il rilascio della proteina IL-8 sono stati valutati nel tessuto di controllo e nel tessuto stimolato con sonicazione del biofilm (Figura 3). L'espressione genica è stata valutata utilizzando la qPCR basata su SYBR-green con primer per IL8 e GAPDH come precedentemente descritto³. L'espressione dell'mRNA IL8 nell'HOE è aumentata di 8,67 volte dopo la stimolazione con biofilm sonicato (Figura 3A). A livello proteico, i livelli di IL-8 sono stati quantificati utilizzando un kit ELISA per IL-8. La concentrazione di IL-8 nei terreni esauriti è aumentata da ~1,005 ng/mL nel tessuto di controllo a ~4,245 ng/mL nel tessuto stimolato con sonicazione del biofilm (Figura 3B).

Figura 1: Diverse applicazioni per modelli di co-coltura di tessuti organotipici. Sospensioni standardizzate di microrganismi vengono applicate direttamente al tessuto per studiare le interazioni specie-ospite (A). Questi sono spesso utilizzati per valutare la colonizzazione microbica in un breve periodo di tempo (ad esempio, <24 ore). I biofilm complessi vengono sonicati per studiare gli effetti delle cellule disperse o degli aggregati di biofilm sui tessuti (B). Questo è importante in quanto in precedenza è stato dimostrato che tali cellule hanno fenotipi unici rispetto alle controparti planctoniche o a biofilm; a tal fine, i biofilm intatti possono essere aggiunti direttamente al tessuto utilizzando ulteriori inserti più piccoli per creare un'esposizione adiacente con l'ospite (C). Infine, le cellule planctoniche vengono aggiunte al tessuto in terreni di coltura appropriati per valutare la colonizzazione microbica, la formazione di biofilm e le dinamiche di crescita sul tessuto (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Espressione genica del tessuto HOE in seguito alla stimolazione con biofilm sonicato a 7 specie. Variazione del ripiegamento dell'espressione dell'mRNA di un totale di 15 geni infiammatori normalizzati al gene housekeeping, GAPDH, in tessuto HOE in campioni di controllo non stimolati e che sono stati esposti a 100 μL di biofilm sonicato (A) a 7 specie. I tre geni (CCL2, CXCL1, CSF3) con le più alte variazioni nell'espressione dell'mRNA sono mostrati in (B). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un test T parametrico non accoppiato, con variazioni significative rappresentate rispettivamente come *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. I dati sono stati tracciati e analizzati utilizzando software statistici e grafici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Espressione genica di IL8 e livelli di proteina IL-8 prodotti dal tessuto HOE. Variazione del ripiegamento dell'espressione dell'mRNA di IL8 nel tessuto HOE come determinato dalla qPCR (A) basata su SYBR-green e dai livelli di proteina IL-8 quantificati dai terreni tissutali esauriti utilizzando la metodologia ELISA (B). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un test T parametrico non appaiato, con variazioni significative rappresentate rispettivamente come *p < 0,05 e ****p < 0,0001. I dati sono stati tracciati e analizzati utilizzando software statistici e grafici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, vengono descritte le metodologie per produrre un modello complesso di biofilm multispecie rappresentativo della gengivite per la co-coltura con tessuto HOE per valutare la risposta dell'ospite a seguito di stimolazione microbica. Questo protocollo può essere adattato per l'uso nello studio delle interazioni ospite-patogeno tra cellule planctoniche, biofilm di specie singole, doppie o miste o cellule disperse in biofilm con tessuto epiteliale proveniente da diverse nicchie ecologiche del corpo umano. L'uso di modelli tissutali per studiare le interazioni ospite-patogeno fornisce un importante progresso rispetto ai precedenti sistemi di co-coltura che sono limitati a monostrati 2D che non sempre ricapitolano veramente la situazione in vivo, per cui il tessuto epiteliale contiene più strati cellulari 16,17,18. Inoltre, le sfide associate alla crescita in vitro di modelli di tessuto multistrato sono numerose, con l'uso di più linee cellulari e/o la crescita di strati cellulari in un'interfaccia aria-liquido soggetta a contaminazione. I tessuti disponibili in commercio forniscono una piattaforma riproducibile con modelli di qualità costantemente elevata che sono comparabili tra repliche e lotti, come mostrato in precedenti pubblicazioni ^3,7.

Per la sezione "preparazione di comunità microbiche per la co-coltura", l'inclusione di questi microrganismi per il modello di gengivite a 7 specie è stata scelta sulla base di commensali e patogeni comunemente identificati associati al passaggio dalla salute orale alla malattia. Come per tutti i sistemi modello di biofilm complessi in vitro, l'inclusione di microrganismi è diretta da studi sul microbioma relativi alla particolare nicchia ecologica sana o malata. A tal fine, noi e altri abbiamo segnalato l'uso di un modello di biofilm associato alla salute orale contenente microrganismi commensali (ad esempio, Streptococcus e Rothia spp.)^3,40,41. Inoltre, è possibile aggiungere ulteriori agenti patogeni a questi modelli per creare biofilm associati ad altre malattie. Ad esempio, tre microrganismi possono essere aggiunti alle 7 specie qui descritte per creare un modello di malattia associata alla parodontite³, mentre il patogeno fungino Candida albicans può essere aggiunto per aumentare la polimicrobialità e aggiungere uno strato di complessità interregno³³. Infatti, la promozione delle interazioni fungine-batteriche può avere enormi implicazioni su vari risultati sperimentali utilizzando tali modelli di biofilm in vitro rispetto ai biofilm solo batterici⁴². In definitiva, si raccomanda vivamente di prendere in attenta considerazione la creazione di un nuovo modello di biofilm multispecie per tali studi. Mentre i microrganismi inclusi dovrebbero essere facilmente identificabili da ricerche approfondite in letteratura, per la maggior parte delle nicchie e/o delle malattie, questi potrebbero non integrarsi bene in un modello complesso in vitro per diversi motivi. Di seguito vengono illustrate alcune altre potenziali considerazioni che è necessario fare:

Dinamica di formazione del biofilm
La formazione di biofilm in vivo comporta spesso una colonizzazione precoce, intermedia e tardiva da parte di particolari microrganismi. La formazione della placca dentale sopra- e sottogengivale è fortemente caratterizzata dall'attacco iniziale della pellicola salivare trovata sullo smalto da specie pioniere (ad esempio, specie di Streptococcus ), con patogeni intermedi e successivi che richiedono questi come impalcatura per la colonizzazione⁴³. Un fenomeno simile è stato proposto nell'ambiente vaginale durante la vaginosi batterica, per cui si ritiene che la Gardnerella vaginalis sia il colonizzatore iniziale, seguita dai successivi anaerobi⁴⁴. Tuttavia, è importante notare che questo potrebbe non essere il caso di altre malattie in altre nicchie ecologiche.

Densità di semina per ogni microrganismo
I microrganismi avranno dimensioni e/o dinamiche di crescita diverse se coltivati in vitro; Pertanto, è importante tenerne conto durante il processo di standardizzazione. Ad esempio, C. albicans è 100-150 volte più grande delle cellule batteriche^45,46, quindi potrebbe giustificare l'aggiunta a una concentrazione inferiore, ad esempio 1 x 10⁶ cellule/mL, a tali modelli di biofilm.

Antagonismo di specie
Alcuni microrganismi (tra cui la stessa specie ma isolati diversi, ceppi di laboratorio e/o clinici) utilizzati per questi modelli possono competere con altri durante la formazione del biofilm, portando all'inibizione della crescita di alcune specie microbiche⁴⁷. Uno studio di Sadiq et al. ha evidenziato come diverse combinazioni di microrganismi possano influenzare la biomassa del biofilm derivante dalla sinergia (o antagonismo) ^microbica48. Sebbene lo studio di tali interazioni all'interno di un modello di biofilm possa essere di interesse per i gruppi di ricerca (ad esempio, la sperimentazione di un trattamento pre- o probiotico), altri potrebbero non tenere conto di tale antagonismo, che potrebbe influire sulla complessità multi-specie durante la creazione del modello.

Durata della maturazione del biofilm
È fondamentale ottimizzare i tempi di maturazione del biofilm in quanto ciò può dipendere dalle dinamiche di crescita dei microrganismi inclusi e dal sistema modello (compresi i substrati) utilizzato per la coltura. Tempi di maturazione più lunghi potrebbero portare a una migliore colonizzazione dei patogeni successivi, ma a una maggiore morte cellulare all'interno dei modelli, in particolare dei colonizzatori precedenti. Al contrario, tempi di incubazione più brevi potrebbero essere importanti se si desidera studiare gli effetti di modelli di biofilm immaturi sull'ospite. Uno studio di Brown et al. ha descritto come lo stesso modello di biofilm della ferita di 10 specie avesse profili infiammatori diversi nelle cellule THP-1 umane quando maturate per 24 ore, 48 ore e 72 ore, suggerendo che meno maturo è il biofilm, più è pro-infiammatorio⁷. Risultati simili potrebbero essere osservati in modelli di tessuto multistrato. È anche importante notare che i cambi quotidiani regolari dei terreni sono una necessità per ridurre al minimo la morte cellulare nel biofilm, sebbene questo possa essere modificato a seconda dei regimi di trattamento in corso, ad esempio se si valutano gli effetti di interventi antimicrobici prolungati.

Per la sezione "manipolazione organotipica dei tessuti, configurazione sperimentale e processamento dei tessuti", i tempi di incubazione possono essere regolati in base alle esigenze del ricercatore. Le interazioni ospite-patogeno possono essere studiate in punti temporali precedenti, ad esempio da 1 a 12 ore, a punti temporali successivi di 48 ore e 72 ore, a seconda della domanda di ricerca. In secondo luogo, vengono forniti tutti i terreni di mantenimento contenenti antibiotici; Pertanto, al momento dell'ordine, è necessario richiedere all'azienda di rimuoverli a seconda del disegno sperimentale. Sebbene il terreno sottostante l'inserto non entri in contatto diretto con la periferia superiore del tessuto, a meno che non venga inflitta una ferita nel modello ^6,8, la rimozione degli antibiotici può meritare di essere presa in considerazione se si studia l'invasione microbica nel tessuto.

Il materiale microbico utilizzato per la stimolazione della co-coltura può anche essere modificato, come discusso sopra, con lo scopo di valutare planctonico, surnatanti di biofilm esausti (filtrati e non filtrati), biofilm interi o incubazioni soniche di biofilm con il tessuto. Ad esempio, prove precedenti hanno dimostrato che i modelli tissutali come quelli forniti da EpiSkin forniscono modelli utili per studiare le interazioni tra funghi planctonici e ospite: è stato dimostrato che le cellule di C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur e Trichophyton rubrum si attaccano e interagiscono con gli strati di tessuto periferico in HOE, Epidermide umana ricostruita (RHE) o Epitelio vaginale umano, con alcuni di questi studi che mostrano la stimolazione di una risposta dell'ospite a seguito di infezione fungina 1,5,6,11,12,49. Pubblicazioni simili esistono per le interazioni batterio-ospite, ad esempio, la formazione di biofilm di Cutibacterium acnes, un patogeno comune associato al microbiota del cuoio capelluto nella forfora, è stata studiata sulla superficie di RHE, quando coltivato da solo e con l'organismo fungino della pelle, Malassezia restricta¹⁰. Altri hanno studiato la capacità di Staphylococcus spp. di legarsi all'RHE, misurando le caratteristiche fisico-chimiche e microbiologiche di questa interazione batterico-ospite⁵⁰. N'Diaye e i coautori hanno esplorato come il neuropeptide di derivazione umana, Calcitonin Gene-Related Peptide, ha influenzato la virulenza di Staphylococcus aureus nel modello tissutale RHE⁵¹. Altri hanno studiato gli effetti protettivi degli interventi probiotici sull'infezione da Pseudomonas aeruginosa dell'epitelio corneale umano¹⁴. Nel frattempo, da una prospettiva polimicrobica, diversi gruppi hanno studiato gli effetti dei biofilm di specie miste su diversi substrati tissutali 2,3,7,13.

Nel complesso, questi protocolli e studi a cui si fa riferimento sopra documentano la vasta gamma di applicazioni dei modelli di tessuto organotipico per studiare le interazioni ospite-patogeno. Sebbene gli studi abbiano dimostrato che i modelli EpiSkin, in particolare il modello di pelle RHE, hanno una buona applicabilità per testare i prodotti cosmetici per corrosione/irritazione 52,53,54,55, esistono alcune limitazioni tra questi e gli espianti di tessuti ex vivo del mondo reale o altri fornitori di tessuti disponibili in commercio ^56,57. Un'ovvia limitazione sarebbe che tutti i modelli di tessuto disponibili in commercio sono generati da linee cellulari in un ambiente sterile e "privo di germi", il che significa che il tessuto non è mai stato esposto a perturbazioni microbiche: ciò potrebbe esacerbare qualsiasi risposta infiammatoria nell'ospite, ben oltre ciò che si vedrebbe in vivo o in seguito alla stimolazione di espianti di tessuto ex vivo ⁵⁷. Al contrario, questi sistemi modello di laboratorio non conterranno strati connettivi sottostanti o vascolarizzazione che si assocerebbero al tessuto in vivo, caratteristiche che possono essere preservate durante l'espianto di tessuto ex vivo e caratteristiche che influiscono sulle risposte infiammatorie. In effetti, una recente revisione sistematica ha evidenziato che è necessario prendere in considerazione l'utilizzo di modelli di tessuto con vascolarizzazione appropriata creati utilizzando varie tecnologie ingegneristiche, inclusi i biomateriali⁵⁸. Ad esempio, uno studio recente ha utilizzato una matrice a base di fibrina incorporata con fibroblasti gengivali e cellule endoteliali microvascolari per creare un equivalente del tessuto gengivale vascolarizzato. Gli autori hanno descritto una risposta infiammatoria differenziale nel modello in seguito all'esposizione a microrganismi associati alla salute o alla malattia⁵⁹. Da un punto di vista commerciale, esistono oggi modelli più complessi, come il "modello T-Skin", che contiene un tessuto a tutto spessore costituito da un derma composto da fibroblasti sovrapposti all'epidermide. Sarebbe interessante vedere come questi modelli complessi si confrontano con i sistemi di sola epidermide.

Sebbene nessun modello sia perfetto, i modelli di tessuto organotipico rappresentano alternative promettenti per i test preclinici, in linea con il quadro delineato dalle tre R, per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento nell'intraprendere la ricerca sugli animali. A tal fine, sebbene i modelli animali forniscano importanti informazioni sulla complessa natura fisiopatologica delle malattie umane correlate al biofilm, presentano evidenti svantaggi. Questi modelli 3D sono facilmente manipolabili, consentendo modifiche grandi e sottili alle indagini senza l'approvazione etica. La combinazione di questi modelli con i complessi sistemi di biofilm esistenti descritti sopra può migliorare notevolmente la nostra comprensione delle interazioni ospite-patogeno e prevedere meglio il successo di nuove terapie prima delle indagini in vivo .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dischi di idrossiapatite (HA) da 13 mm Plasma	Biotal Limited	n/a (su ordinazione)	Substrato per la formazione di biofilm orali, che imita la superficie del dente
Ago da 19 G (40 mm)	VWR	613-2028	Utilizzato per facilitare la rimozione dei dischi HA dalle piastre e per ritagliare il tessuto dagli inserti
piastre per microtitolazione a fondo piatto trattate con TC a 24 pozzetti con coperchi	Forniture per Laboratorio Scientifico	3524 (confezione da 100)	Piastre per la coltura di biofilm ed esperimenti di co-coltura tissutale
Perle di vetro lavate con acido (425-600 μ m)	Merck: Sigma-Aldrich	G8772	Per la lisi tissutale per migliorare la resa dell'estrazione dell'RNA
Actinomyces naeslundii DSM 17233	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso
Bead Mill 24 Omogeneizzatore (o equivalente)	Fisher Scientific	15-340-163	Per la lisi dei tessuti per migliorare la resa dell'estrazione dell'RNA
Bijoux  (7 ml)	Greiner Bio-One	189170 (700 per sacchetto)	Utilizzato per la sonicazione del biofilm
Kit di sintesi di cDNA (ad alta capacità)	Thermo Fisher Scientific	4368814 (per 200 reazioni)	Sintesi di cDNA da base di RNA tissutale
Columbia Blood Agar (CBA)	Thermo Fisher Scientific	CM0331B (per 500 grammi)	Utilizzato per preparare piastre CBA per la coltura di microrganismi aerobi
Sangue di cavallo defibrinato	E& O Laboratories	DHB	Utilizzato per integrare le piastre CBA e FAA per la coltura di microrganismi aerobici e anaerobici
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS: senza CaCl2 e MgCl2)	Merck: Sigma-Aldrich	DB537	dPBS per la co-coltura cellulare con biofilm sonicato
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953	American Type Culture Collection	n/a	Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso
GraphPad Prism (Versione 10)GraphPad	Software, Inc	n/a	Per la creazione di grafici e l'analisi dei dati
Kit ELISA per IL-8 umano (kit ELISA non rivestito con piastre)	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	88-8086-86 (per test 10 x 96)	Kit ELISA e piastre per la valutazione delle proteine dei terreni tissutali esausti
Epitelio orale umano (HOE)	Episkin	n/a (su ordinazione)	Il tessuto epiteliale utilizzato per il sistema modello di co-coltura
Anse di inoculazione (monouso, 10 &; micro; L, o equivalente)	Fisher Scientific	12870155 (confezione da 1000)	Per colture microbiologiche in terreni solidi e liquidi
Piastre qPCR a 96 pozzetti MicroAmp Fast Reaction (0,1 mL)	Thermo Fisher Scientific	4346907 (per 10 piastre)	Per la profilazione dell'espressione genica qPCR dei tessuti
Microbank Diagnostics		PL.170	Conservazione e ciroconservazione di microrganismi
Acqua priva di nucleasi	Thermo Fisher Scientific	AM9935 (10 x 1,5 mL)	Acqua di grado RT-PCR per esperimenti qPCR
Piastre di Petri (90 mm)	Fisher Scientific (Sterilin)	11309283 (confezione da 500)	Utilizzato per la preparazione di piastre di agar per coltura microbica
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014 (confezione da 100 compresse)	PBS per la standardizzazione dei microrganismi e le fasi di lavaggio del biofilm
Rneasy mini kit	Qiagen	74106 (per 250 reazioni)	Kit di estrazione dell'RNA su colonna per tessuti
Roswell Park Memorial Institute 1640	medio Merck: Sigma-Aldrich	R7755-10L (per 10 L)	Terreni per la coltura di biofilm
Array di profilatori RT2	Qiagen	330171 (su misura)	Array qPCR contenente primer già pronti per la profilazione dell'espressione genica
Base di agar anaerobo Schaedler	Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)	91019 (per 500 g)	Utilizzato per preparare piastre di agar anaerobiche Fastdious
Schaedler brodo anaerobo	Thermo Fisher Scientific	CM0497B (per 500 g)	Terreno liquido per la crescita di microrganismi anaerobi
Tubo O-Ring Beadbug con tappo a vite	Forniture per laboratorio scientifico	Z763837-1000EA (confezione da 1000)	Per l'uso nell'omogeneizzatore Bead Mill 24, per la lisi dei tessuti
Bagno di sonicazione	Fisher Scientific (Fisherbrand)	n/a	Per la sonicazione di biofilm da dischi HA
Streptococcus intermedius DSM 20753	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso
Streptococcus mitis NCTC 12261	National Collection of Type Cultures	n/a	Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso
Streptococcus oralis NTCC 11427	Collezione Nazionale di Colture Tipo	n/a	Uno dei microrganismi utilizzati per il modello di biofilm complesso
SYBR-green (qPCRBIO, SyGreen Mix, Hi-ROX)	PCR Biosystems	PB20.12	SYBR-green mix per qPCR
Brodo Todd Hewitt	Merck: Sigma-Aldrich	T1438	Terreni per la coltura di biofilm
Brodo di soia triptonico (TSB) medio	Merck: Sigma-Aldrich	22092 (per 500 g)	Terreno liquido per la crescita di microrganismi aerobici
Pinzette (150 mm, acciaio inossidabile, seghettato)	RS-Pro	545-187	Utilizzato per spostare dischi HA e inserti di tessuto/estratti di tessuto
Tubi universali (30 ml)	Greiner Bio-One	201150 (400 per sacchetto)	Recipienti per la coltura di microrganismi in coltura liquida
Veillonella dispar NCTC 11831	National Collection of Type Cultures	n/a'Uno	dei microrganismi utilizzati per il complesso modello di biofilm
β-metacaptoetanolo	Merck: Sigma-Aldrich	M3148	RNasi deactivation in tissue samples