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Articolo metodologico

Libreria ATAC-Seq Preparazione di neutrofili derivati dal midollo osseo murino

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DOI:

10.3791/67490

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3 gennaio 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto delinea un protocollo per la preparazione di una libreria ATAC-seq di neutrofili da midollo osseo murino, con l'obiettivo di garantire una vitalità ottimale dei neutrofili e un'elevata qualità della libreria. Offre istruzioni dettagliate sulla preparazione del BMC, lo smistamento immunomagnetico e la costruzione di librerie, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i neofiti dello studio dei neutrofili.

Abstract

Il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (ATAC-seq) è una tecnica potente e ad alto rendimento per valutare l'accessibilità della cromatina e comprendere la regolazione epigenomica. I neutrofili, in quanto tipo di leucocitario cruciale nelle risposte immunitarie, subiscono sostanziali cambiamenti architettonici della cromatina durante la differenziazione e l'attivazione, che hanno un impatto significativo sull'espressione genica necessaria per le loro funzioni. ATAC-seq è stato determinante nella scoperta di fattori di trascrizione chiave nella maturazione dei neutrofili, nella rivelazione di firme epigenomiche specifiche del patogeno e nell'identificazione di bersagli terapeutici per le malattie autoimmuni. Tuttavia, la sensibilità dei neutrofili all'ambiente esterno complica la produzione di dati ATAC-seq di alta qualità. Qui, proponiamo un protocollo scalabile per la preparazione di librerie ATAC-seq da neutrofili derivati da midollo osseo di roditori, caratterizzato da una migliore separazione immunomagnetica per garantire una vitalità cellulare ottimale e librerie di alta qualità. Vengono discussi in dettaglio gli elementi vitali che influenzano la qualità della biblioteca e i principi di ottimizzazione per l'estensione metodologica. Questo protocollo supporterà i ricercatori che desiderano studiare l'architettura della cromatina e la riprogrammazione epigenomica dei neutrofili, facendo avanzare gli studi in immunologia di base e clinica.

Introduzione

I neutrofili sono uno dei tipi di cellule immunitarie più abbondanti e cruciali nei vertebrati, costituendo il 50%-70% dei leucociti umani1. I neutrofili svolgono un ruolo centrale nel rilevamento e nell'eliminazione dei microrganismi negli ospiti. Durante la sepsi, i neutrofili maturi sono tra i primi soccorritori2. Si mobilitano rapidamente nei siti di infezione tramite la chemiotassi3, dove combattono gli agenti patogeni ingerendo microrganismi (fagocitosi), producendo specie reattive dell'ossigeno dipendenti dalla NADPH ossidasi (esplosioni respiratorie), secernendo granuli (degranulazione) e formando trappole extracellulari neutrofile (NET) che catturano e uccidono i batteri extracellulari una volta arrivati al sito di infiammazione4. I neutrofili immaturi vengono anche rapidamente mobilizzati dal midollo osseo alla circolazione periferica dalle chemochine 5,6. Questi neutrofili attratti dal sito infettivo rilasciano anche citochine, che sono coinvolte in diversi processi fisiologici, come l'emopoiesi, l'angiogenesi e la guarigione delle ferite 7,8. I pazienti affetti da malattie congenite o acquisite che provocano una diminuzione della conta dei neutrofili sono più suscettibili alle infezioni 9,10. Tuttavia, l'attivazione dei neutrofili è un'arma a doppio taglio. L'attivazione e il rilascio eccessivi di citochine possono causare danni ai tessuti e agli organi, portando a disfunzioni multiorgano se le infezioni non vengono prontamente controllate11,12. Inoltre, i neutrofili contribuiscono anche a varie malattie infiammatorie e autoimmuni e possono influenzare la progressione del cancro e le metastasi13,14. Ciò sottolinea la necessità di studiare la regolazione dell'attività dei neutrofili per bilanciare un'efficace risposta immunitaria e prevenire danni all'ospite.

Nei neutrofili, l'architettura della cromatina subisce cambiamenti distinti e dinamici nella loro differenziazione, migrazione e attivazione, esercitando ruoli regolatori fondamentali per tutta la durata della vita cellulare. Questo viaggio, dal grande nucleo rotondo ricco di eucromatina dei mieloblasti a un nucleo più frastagliato nei mielociti e nei metamielociti, e poi a cellule in banda a forma di C o S e altamente lobulate con cromatina densamente impacchettata nei neutrofili polimorfonucleati15,16, è una testimonianza della complessità della biologia dei neutrofili. La configurazione specializzata della cromatina garantisce l'espressione selettiva di geni essenziali per la funzione dei neutrofili, come quelli coinvolti nella produzione di granuli e le rapide risposte trascrizionali necessarie per un'efficace eliminazione dei patogeni17. Quando i neutrofili vengono mobilizzati nei siti infiammatori tramite chemiotassi, la migrazione transendoteliale esercita pressione sul complesso linker nucleoscheletro/citoscheletro (LINC), provocando il rimodellamento della cromatina e un maggiore potenziale di attivazione18. Nella sepsi, i neutrofili attivati mostrano uno "spostamento nucleare-sinistro", con una morfologia anormale della cromatina, come nuclei bilobati o non lobati e condensazione della cromatina significativamente più sciolta19. Ciò si traduce in una maggiore accessibilità all'interno delle regioni geniche associate alla risposta infiammatoria, inducendo così un'espressione significativa di questi geni. Se le infezioni non sono debitamente controllate, la citrullinazione degli istoni e la successiva decostruzione della cromatina sono necessarie per formare NET20,21. Pertanto, la comprensione dell'architettura della cromatina dei neutrofili è fondamentale per far progredire la biologia dei neutrofili e sviluppare trattamenti per le malattie infiammatorie e autoimmuni, offrendo speranza per il futuro trattamento della malattia.

L'accessibilità della cromatina funge da metrica per l'architettura della cromatina a livello epigenomico. Indica come le regioni genomiche siano fisicamente consentite a potenziatori, promotori, isolanti e fattori leganti la cromatina e come questi elementi influenzino l'espressione genica22. Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (ATAC-seq) è una tecnica ampiamente utilizzata per valutare l'accessibilità della cromatina in tutto il genoma23. Non richiede una conoscenza preliminare degli elementi regolatori, il che lo rende un potente strumento per la ricerca epigenetica. Questo metodo prevede l'isolamento di nuclei di campioni, la frammentazione del DNA genomico mediante trasposasi Tn5 e l'aggiunta di primer di sequenziamento per la preparazione della libreria, il sequenziamento e l'analisi dei dati23. ATAC-seq è stato determinante nello studio della mappatura dei nucleosomi, dell'analisi del legame dei fattori di trascrizione, dei meccanismi regolatori in vari tipi di cellule o malattie, dell'identificazione di nuovi potenziatori, della scoperta di biomarcatori, ecc.22,23. Viene spesso combinato con altre tecniche, come il sequenziamento dell'RNA, per un'analisi completa dell'espressione genica.

ATAC-seq ha migliorato le nostre conoscenze sulla biologia dei neutrofili scoprendo precisi meccanismi epigenetici in salute e malattia. Ha rivelato diversi fattori di trascrizione chiave (ad esempio, RUNX1, KLF6, PU.1, ecc.) nella maturazione dei neutrofili e nelle risposte effettrici24,25, ha scoperto firme patogeno-specifiche con potenziale biomarcatore nella sepsi26, ha chiarito i meccanismi epigenomici della memoria immunitaria innata12 e ha identificato bersagli terapeutici nella leucemia mieloide acuta pediatrica (AML)27. Tuttavia, come componente cellulare prominente nella sorveglianza immunitaria, i neutrofili mostrano un'elevata sensibilità al loro ambiente esterno e quindi rappresentano una sfida per la produzione di dati ATAC-seq di alta qualità. In circostanze fisiologiche, l'emivita mediana dei neutrofili umani è di 3,8 giorni, mentre l'emivita media dei neutrofili di topo è di 12,5 ore. È interessante notare che la loro emivita è considerevolmente più breve se studiata in vitro28,29. Durante il funzionamento in vitro di neutrofili isolati, l'esposizione a microrganismi o pattern molecolari associati a patogeni (PAMP), nonché procedure sperimentali ridondanti e operazioni difficili, possono provocare un'attivazione aberrante dei neutrofili e una diminuzione della vitalità cellulare a causa dell'apoptosi o della NETosi. Le cellule decedute ospitano comunemente quantità significative di DNA non cromatinizzato altamente suscettibile a Tn5, aumentando di conseguenza il rumore di fondo di ATAC-seq23.

Qui, proponiamo un protocollo scalabile per la preparazione di librerie ATAC-seq ottimizzate per neutrofili derivati da campioni di midollo osseo di roditori. La Figura 1 presenta una panoramica grafica del protocollo, che comprende la separazione immunomagnetica dei neutrofili dal midollo osseo, seguita da ATAC-seq. Il miglioramento della selezione immunomagnetica garantisce la vitalità ottimale dei neutrofili prima dell'estrazione del nucleo per la libreria ATAC-seq, assicurando così l'alta qualità delle librerie e facilitando l'incorporazione di ulteriori valutazioni dei neutrofili nello schema. L'implementazione di questo protocollo aiuterà i ricercatori a comprendere le caratteristiche dell'architettura della cromatina e i meccanismi di riprogrammazione epigenomica dei neutrofili quando esposti a varie sfide microambientali. Si prevede che questo avrà ampie applicazioni negli studi di immunologia di base e clinica.

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Protocollo

Tutte le procedure per gli animali presentate di seguito sono conformi alle linee guida e ai regolamenti nazionali in materia di etica e benessere degli animali, che sono stati approvati dal Comitato etico per la ricerca sulla cura degli animali della Capital Medical University, Pechino, Cina (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Preparazione di sospensioni di cellule del midollo osseo (BMC)

  1. Alcuni topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane di peso corporeo di 19-21 g. Eutanasia dei topi utilizzando una camera di CO2 , seguita da lussazione cervicale dopo che il riflesso profondo è scomparso. Disinfettali con spray all'etanolo al 70% su un tappetino da dissezione.
  2. Usa piccole forbici e pinze per separare con cura il femore dall'articolazione dell'anca e dalla tibia, rimuovi la pelle attaccata e il muscolo scheletrico e sciacqua il femore con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) in una capsula di Petri di 10 cm.
  3. Tagliare le epifisi del femore, inserire delicatamente un ago da 28 G collegato a una siringa da 2 ml nella cavità del midollo e sciacquare il midollo osseo con PBS freddo contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS).
  4. Ripetere il passaggio precedente fino a quando il fluido rosso scuro lavato diventa traslucido. Di solito sono necessari tre getti.
    NOTA: Evitare di inserire l'ago troppo in profondità nella cavità del midollo osseo per garantire un'acquisizione cellulare ottimale.
  5. Utilizzare un filtro cellulare da 70 μm per filtrare la sospensione cellulare in una provetta di smistamento cellulare attivata da fluorescenza (FACS) (5 mL).
  6. Lisi gli eritrociti nelle BMC con un tampone di lisi eritrocitaria commerciale senza poliformaldeide.
    1. Centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti a 25 °C, rimuovere con cura il surnatante, lasciando circa 100 μL di liquido sul fondo, e picchiettare delicatamente la provetta per allentare il pellet.
    2. Aggiungere 2 mL di tampone di lisi, diluito dal tampone di lisi degli eritrociti (10x), e mescolare capovolgendo la provetta tre volte. Quindi, centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare picchiettando delicatamente.
    3. Lavare due volte le cellule con il terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e risospenderle in un volume di 2 mL.
      NOTA: Quando si tratta di grumi cellulari non sparsi, si consiglia di utilizzare un puntale per pipette da 200 μl per prelevarli, invece di filtrare le sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Questo metodo può ridurre la perdita cellulare.
  7. Calcolare la vitalità cellulare e il numero totale di cellule viventi per campione con colorazione con blu di tripano.

2. Marcatura immunomagnetica di neutrofili con biglie magnetiche anti-Ly6G

  1. Risospendere le cellule del midollo osseo (~2 x 107 cellule vive per topo) in 2 mL di terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 25 °C.
    NOTA: Dato il fabbisogno limitato di 1 x 105 cellule per ATAC-seq, i neutrofili in eccesso possono essere assegnati per ulteriori analisi epigenomiche (ad esempio, ChIP-seq e Hi-C) o valutazioni della funzione immunitaria (ad esempio, produzione di citochine, fagocitosi e NET) utilizzando neutrofili ottenuti dallo stesso topo.
  2. Aspirare la maggior parte del surnatante, lasciando circa 100 μl, e picchiettare delicatamente la provetta per allentare il pellet.
  3. Aggiungere 30 μl di perle Ly6G e mescolare con i BMC picchiettando delicatamente.
    NOTA: Le perline magnetiche devono essere agitate per un minimo di 10 secondi prima dell'uso. Dopo l'aggiunta delle perle ai BMC, si raccomanda di astenersi dal vortice.
  4. Incubare la provetta a 25 °C per 15 minuti.
  5. Aggiungere 2 mL di PBS per risospendere le microsfere e le cellule, quindi centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 25 °C.
  6. Aspirare la maggior parte del surnatante, lasciando circa 100 μl, e picchiettare delicatamente la provetta per allentare il pellet. Aggiungere ulteriore PBS per un volume finale di 1 mL.
    NOTA: Quando si tratta di grumi cellulari non sparsi, si consiglia di utilizzare un puntale per pipette da 200 μl per prelevarli, invece di filtrare le sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Questo metodo può ridurre la perdita cellulare.

3. Separazione dei neutrofili con smistamento cellulare immunomagnetico

  1. Pretrattare la colonna MS con PBS.
    1. Posizionare la colonna MS all'interno del campo magnetico di un separatore di smistamento cellulare ad attivazione magnetica (MACS) compatibile. Posizionare una provetta da 5 mL non occupata sotto il fluido che fuoriesce dalla colonna MS.
    2. Sciacquare la colonna con 500 μL di PBS. Ripetere questo passaggio dopo il flusso completo di PBS nella colonna MS.
      NOTA: Il PBS deve essere lasciato fluire gradualmente, goccia dopo goccia, nella provetta da 5 mL di smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) attraverso la colonna MS. Assicurarsi che l'aria non penetri nella colonna, poiché le bolle d'aria potrebbero ostruire la colonna.
  2. Applicare la sospensione BMC marcata magneticamente alla colonna MS aggiungendo 500 μl alla volta, riempiendola immediatamente una volta che il serbatoio della colonna è vuoto.
    NOTA: Assicurarsi che le sospensioni cellulari siano prive di massa cellulare. Se necessario, posizionare una nuova provetta FACS da 5 mL sotto la colonna MS per raccogliere le cellule non marcate (ad es. monociti e linfociti) prima di questa fase.
    NOTA: Prendere nota della portata delle goccioline. Una portata lenta potrebbe suggerire che la colonna di smistamento è ostruita.
  3. Lavare la colonna MS aggiungendo 500 μL di PBS ogni volta che il serbatoio è vuoto, ripetendo questo processo due volte.
    NOTA: L'aggiunta prematura di PBS può impedire l'ingresso di alcune cellule nella colonna di smistamento, compromettendo potenzialmente la purezza dello smistamento cellulare.
  4. Raccogli i neutrofili marcati magneticamente.
    1. Una volta esaurito il serbatoio della colonna, rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarla con cura su una provetta da 5 mL.
      NOTA: Prima della rimozione della colonna, assicurarsi che non vi siano residui di liquido al suo interno per evitare la perdita di neutrofili dovuta alla scarica di goccioline durante il processo. Il residuo nella colonna può essere rimosso utilizzando una pipetta.
    2. Erogare 2 mL di PBS sulla colonna, quindi spingere immediatamente e con decisione lo stantuffo nella colonna per espellere i neutrofili marcati magneticamente.
      NOTA: Per acquisire una quantità sufficiente di neutrofili, assicurarsi che il volume di eluizione sia adeguato e rimanere corti quando si spinge lo stantuffo nella colonna.
  5. Utilizzare un emocitometro per enumerare le cellule isolate. Identificare la purezza dei neutrofili isolati prelevando 100 μL della sospensione cellulare post-selezione e analizzandola con citometria a flusso.

4. Estrazione del nucleo

  1. Centrifugare le 50.000 sospensioni monocellulari contenenti i neutrofili a 500 x g per 5 minuti a 4 °C in una provetta da 0,2 mL, quindi scartare il surnatante.
  2. Risospendere i neutrofili in 50 μL di tampone di lisi pre-raffreddato (fare riferimento alla Tabella 1), mescolare delicatamente la soluzione con una pipetta e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
    NOTA: Se il volume del campione è inferiore a 5 μl, è consentito aggiungere direttamente il tampone di lisi. La concentrazione della sospensione cellulare non supera 1 x 107 cellule/mL.
  3. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante e raccogliere il nucleo. Posizionare il tubo sul ghiaccio prima di iniziare le procedure successive.
    NOTA: Per ridurre al minimo la perdita di campione, indicare il lato della parete della provetta in cui si accumulano i pellet e aspirare delicatamente il liquido dal lato opposto quando si rimuove il surnatante.

5. Tagmentazione nucleosoma-legata con trasposasi

  1. Preparare la miscela di reazione di tagmentazione contenente Tn5 trasposasi in una provetta per reazione a catena della polimerasi (PCR) secondo le linee guida del kit di preparazione della libreria di DNA (fare riferimento alla Tabella 2) e preriscaldare le microsfere di purificazione dell'amplicone refrigerate a 25 °C per almeno 30 minuti.
  2. Risospendere il nucleo neutrofilo con 50 μL di miscela di reazione di tagmentazione e agitare delicatamente con una pipetta, seguita da una centrifugazione per 5 secondi utilizzando una centrifuga portatile (~2600 x g).
  3. Incubare la provetta di reazione in uno strumento PCR a 37 °C per 30 minuti.
  4. Aggiungere 100 μl di perle di purificazione dell'amplicone pre-vortexed al lisato, quindi mescolare accuratamente le microsfere magnetiche nella soluzione pipettando su e giù 10 volte.
    NOTA: Le microsfere magnetiche sono appiccicose e possono attaccarsi facilmente ai puntali delle pipette, quindi assicurarsi di aspirare il giusto volume ed erogarle lentamente dai puntali durante il trasferimento delle microsfere.
  5. Incubare la provetta di reazione a 25 °C per 5 minuti, quindi centrifugarla per 5 s con una centrifuga portatile (~2600 × g).
  6. Purificare il frammento di DNA interrotto posizionando la provetta di reazione su una rastrelliera magnetica fino a quando la soluzione non diventa limpida (circa 5 minuti). Quindi, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare le perle magnetiche.
  7. Lavare ogni volta la corda magnetica con 200 μL di etanolo all'80% appena preparato, mantenendo la provetta di reazione sul rack magnetico per 30 s. Evitare di disturbare le perline quando si aggiunge l'etanolo. Ripetere la procedura descritta al punto 5.7.
  8. Centrifugare la provetta di reazione con una centrifuga portatile (circa 2600 × g), aspirare l'etanolo con puntali per pipette da 10 μl, quindi asciugare le microsfere magnetiche per 3-5 minuti aprendo il coperchio.
    NOTA: La durata dell'asciugatura delle perle magnetiche può variare da regione a regione a causa delle variazioni dei livelli di umidità. Le perline devono essere asciugate fino a quando non perdono la loro lucentezza. Un'essiccazione eccessiva può complicare il processo di eluizione, mentre un'essiccazione inadeguata può comportare la presenza di residui di alcol, influenzando gli esperimenti successivi. Inoltre, il posizionamento orizzontale del rack magnetico favorisce maggiormente l'asciugatura uniforme delle perline magnetiche.
  9. Dopo aver rimosso la provetta di reazione dal rack magnetico, aggiungere 26 μl di ddH2O per coprire le biglie magnetiche, pipettando verso l'alto e verso il basso per garantire una miscelazione accurata. Quindi, incubare a 25 °C per 2 minuti.
    NOTA: Prolungare la durata dell'incubazione in modo appropriato se le biglie magnetiche sono eccessivamente essiccate.
  10. Centrifugare brevemente la provetta di reazione con una centrifuga portatile (circa 2600 × g) e separare le microsfere magnetiche utilizzando una rastrelliera magnetica fino a quando la soluzione diventa limpida (circa 5 minuti).
  11. Trasferire con cautela il surnatante da 24 μl nella nuova provetta per PCR.

6. Costruzione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS)

  1. Preparare la miscela di reazione PCR in una provetta sterilizzata utilizzando frammenti di DNA purificato e primer contenenti adattatori di sequenziamento (fare riferimento alla Tabella 3).
  2. Condurre la reazione PCR seguendo le procedure raccomandate (fare riferimento alla Tabella 4), che richiedono in genere circa 1 ora.
    NOTA: L'esperimento può essere temporaneamente interrotto dopo questa procedura e i prodotti PCR possono essere conservati a -20 °C o almeno 2 settimane.
  3. Aggiungere 27,5 μl di perle di purificazione con amplicone pre-vortex a 50 μl di prodotti per PCR, quindi miscelare accuratamente le microsfere magnetiche nella soluzione pipettando su e giù 10 volte.
    NOTA: Il rapporto errato tra le microsfere magnetiche e i prodotti PCR può causare discrepanze nelle lunghezze dei frammenti selezionati. Utilizzare ddH2O per riempire il volume evaporato del prodotto PCR a 50 μl. Assicurarsi di aspirare il giusto volume di microsfere magnetiche e di erogarle lentamente dai puntali della pipetta per ridurre al minimo le microsfere che possono essere attaccate.
  4. Incubare la provetta di reazione a 25 °C per 5 minuti, quindi centrifugarla per 5 s con una centrifuga portatile (circa 2600 x g).
  5. Purificare il DNA della libreria posizionando la provetta di reazione su un rack magnetico fino a quando la soluzione non diventa limpida (circa 5 minuti). Quindi, trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta PCR sterilizzata e scartare le microsfere magnetiche.
  6. Aggiungere 50 μl di perle di purificazione di ampliconi pre-vortex al surnatante, quindi mescolare accuratamente le microsfere magnetiche nella soluzione pipettando su e giù 10 volte.
  7. Incubare la provetta di reazione a 25 °C per 5 minuti, quindi centrifugarla per 5 s con una centrifuga portatile (circa 2600 x g).
  8. Posizionare la provetta di reazione su una rastrelliera magnetica fino a quando la soluzione diventa limpida (circa 5 minuti), quindi rimuovere con cura il surnatante senza disturbare le sfere magnetiche.
  9. Lavare la corda magnetica due volte con 200 μL di etanolo all'80% appena preparato, mantenendo la provetta di reazione sulla griglia magnetica per 30 secondi. Evitare di disturbare le perline quando si aggiunge l'etanolo.
  10. Asciugare le perline magnetiche per 5 minuti mentre si apre il coperchio.
  11. Dopo aver rimosso la provetta di reazione dal rack magnetico, aggiungere 22 μl di ddH2O per coprire le microsfere magnetiche, pipettando su e giù per 10 volte per garantire una miscelazione accurata. Quindi, incubare a 25 °C per 5 minuti.
  12. Centrifugare brevemente la provetta di reazione con una centrifuga portatile (circa 2600 × g) e separare le microsfere magnetiche utilizzando una rastrelliera magnetica fino a quando la soluzione diventa limpida (circa 5 minuti).
  13. Trasferire con cura il surnatante da 20 μl in una nuova provetta sterilizzata per PCR e conservarlo a -20 °C.
    NOTA: Per ottenere una libreria con una distribuzione della lunghezza più concentrata, prendere in considerazione l'utilizzo di un kit di recupero del gel per ordinare il prodotto amplificato. In alternativa, se non ci sono requisiti specifici per l'intervallo di distribuzione della lunghezza, il prodotto amplificato può essere purificato direttamente utilizzando un kit di purificazione a microsfere magnetiche o a colonna senza selezione della lunghezza.

7. Controllo di qualità e sequenziamento della biblioteca

  1. Utilizza piattaforme di analisi di frammenti di DNA per valutare la distribuzione della lunghezza del DNA della libreria.
  2. Utilizza le piattaforme NGS per eseguire il sequenziamento ad alto rendimento sulle librerie che hanno superato l'ispezione di qualità.

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Risultati

Il protocollo delineato è stato impiegato per isolare i neutrofili dal midollo osseo di topi C57BL/6 e confrontare la loro rispettiva varianza nell'accessibilità della cromatina pre e post stimolazione del lipopolisaccaride (LPS) tramite ATAC-seq. Tipicamente, 2 x 107 BMC possono essere raccolti da entrambi i femori di un topo C57BL/6 di 6-8 settimane e, successivamente, possono essere isolati 2-5 x 106 neutrofili. Tra queste, 1 x 105 cellule sono impiegate per ATAC-seq, mentre le cellule...

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Discussione

Questo manoscritto riporta un protocollo sperimentale per la preparazione di librerie ATAC-seq ottimizzate per neutrofili derivati da campioni di midollo osseo di roditori. Poiché i neutrofili sono cellule immunitarie altamente suscettibili e prontamente attivabili, gli sforzi di ottimizzazione hanno dato priorità al mantenimento della vitalità dei neutrofili isolati. Un trattamento improprio può portare alla NETosi e ad altre forme di morte cellulare, provocando il rilascio di quantità ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca e Sviluppo della Commissione Municipale per l'Istruzione di Pechino (KZ202010025041) e dell'Istituto Cinese per la Ricerca Medica di Pechino (Sovvenzione n. CX24PY29).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,4% Trypan BlueScientificT10282
1x soluzione salina tamponata con fosfatoBiosharpBL302A
20 bp– Marcatore di allineamento da 5000 bp Analizzatoredi frammenti di DNA biotticoC109102-100Aprodotti di supporto
Marcatore di dimensioni 5k (scala standard da 50 bp)Analizzatoredi frammenti di DNA biotticoC109101-100Aprodotti di supporto
Perle di purificazione Amplicons BeckmanA63881Amplicons Purification Beads è un kit di purificazione dell'acido nucleico per ottenere prodotti di DNA di alta qualità.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mousemiltenyi130-120-337Le Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, topo sono state sviluppate per la selezione positiva o la deplezione di neutrofili di topo da sospensioni di singole cellule di midollo osseo di topo.
Anti-topo CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
Anti-topo CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
Anti-topo Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J topi, tipo selvatico, 8 settimane, maschioL'Istituto di Scienze Animali da Laboratorio, Accademia Cinese delle Scienze MedicheL'Istituto di Scienze Animali da Laboratorio, Accademia Cinese di Medicina Prodotti
DNA
Sciences LPS ultrapuro derivato da E. coli (sierotipo0111: B4)del DNA Sigma-AldrichCat#L-2630
vazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt è un kit di saggi quantitativi a fluorescenza del DNA a doppio filamento (dsDNA) semplice, sensibile e accurato.
Tampone per lisi eritrocitaria (10x)BioLegendCat#420301
Siero fetale bovinoGibcoCat#10099141C
Colonne di separazione MSmiltenyi130-042-201Le colonne MS sono progettate per la selezione positiva delle cellule.
RPMI 1640 medioGibcoC11875500BT
S2 Ago per elettroforesi su gel.Prodotti di supporto per analizzatori di frammenti di DNAbiopticiC105101
Strumenti chirurgici: bisturi, forbici da dissezione, forbici da microdissezione, pinze fini, pinze anatomiche smussate, portaaghiFisherScientific https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-toolsPuò essere acquistato da altri fornitori qualificati
Siringa (1  mL)Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464Può essere acquistato da altri fornitori qualificati
Kit di preparazione della libreria DNA TruePrepTM V2 per IlluminavazymeTD501-01Kit di preparazione della libreria DNA TruePrep V2 per Illumina è un kit appositamente sviluppato appositamente per la piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento di Illumina. Utilizzando il kit, il DNA può essere preparato in librerie di sequenziamento dedicate alla piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento di Illumina.
TruePrepTM Index Kit V2 per IlluminavazymeTD202TruePrep Index Kit V2 per Illumina è un kit per il TruePrep DNA Library Prep Kit V2 per Illumina. Può essere utilizzato per preparare 96 diverse librerie di indici a doppia terminazione.
di supporto per l'analizzatore di frammenti di DNA bioptico C104406 tampone di separazione del Reagente quantitativo

Riferimenti

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