Questo protocollo presenta metodi per valutare la distribuzione e la quantità di deposizione di ferro nei tessuti, in particolare nel cervello. Il protocollo descrive in dettaglio le procedure per la preparazione del campione, la colorazione Perls/DAB, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati.
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Articolo metodologico
Valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD mediante colorazione Perls/DAB
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il morbo di Alzheimer (AD), una comune malattia neurodegenerativa, è la principale causa di demenza negli anziani. La deposizione di ferro è strettamente legata alla patogenesi dell'AD. Nel cervello di AD, livelli elevati di ferro sono fortemente correlati con patologie caratteristiche dell'AD, tra cui placche di β-amiloide, grovigli neurofibrillari tau e apoptosi. Prove crescenti suggeriscono che lo stress ossidativo, dovuto al metabolismo del ferro disregolato, svolge un ruolo importante nella fisiopatologia dell'AD. Comprendere il ruolo dell'accumulo di ferro nella patologia dell'AD è, quindi, fondamentale per il trattamento dell'AD. Un protocollo completo di colorazione del ferro è essenziale per rilevare l'espressione e la distribuzione del ferro nel cervello. Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per valutare la quantità e la distribuzione della deposizione di ferro nel cervello. Descriviamo i processi coinvolti nella preparazione dei reagenti, nel trattamento dei topi e nella preparazione delle sezioni cerebrali. Inoltre, presentiamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la rilevazione istochimica del ferro in sezioni di tessuto cerebrale, accompagnato da un quadro analitico sistematico che integra sia la valutazione quantitativa che la valutazione morfologica per garantire un'interpretazione completa dei risultati della colorazione. Questo protocollo sperimentale aiuterà i ricercatori a comprendere le deposizioni di ferro nel cervello e a sostenere la ricerca sull'AD.
Introduzione
Il morbo di Alzheimer (AD) è la malattia neurodegenerativa più comune ed è diventato un problema serio per la società. La prevalenza dell'AD aumenta notevolmente con l'età di 1,2,3,4 anni. I principali segni patologici della malattia di Alzheimer (AD) includono la deposizione di placche di β-amiloide (Aβ) e grovigli neurofibrillari (NFT) dovuti alla fosforilazione aberrante delle proteine tau. L'Aβ è generato attraverso la scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) da parte degli enzimi β-secretasi e γ-secretasi. La disregolazione nella produzione o nella clearance di Aβ porta al suo accumulo nel cervello, formando placche amiloidi, che sono riconosciute come uno dei primi marcatori patologici dell'AD. Queste placche non solo causano danni neuronali diretti, ma avviano anche una cascata di effetti dannosi, tra cui neuroinfiammazione, stress ossidativo e disfunzione sinaptica. Collettivamente, questi processi contribuiscono alla morte neuronale e al progressivo declino cognitivo osservato nell'AD5. Nonostante decenni di ricerca mirati principalmente ai segni patologici della malattia di Alzheimer (AD), tra cui la deposizione di placche amiloide-β e l'aggregazione iperfosforilata della proteina tau, le scoperte terapeutiche clinicamente significative rimangono sfuggenti, con gli interventi esistenti che dimostrano un'efficacia limitata nel modificare la progressione della malattia6.
Il ferro è un metallo importante per il mantenimento della funzione cerebrale ed è coinvolto nel trasporto dell'ossigeno, nella sintesi del DNA, nella respirazione mitocondriale, nella sintesi della mielina, nella sintesi dei neurotrasmettitori e nel metabolismo. Tuttavia, il ferro diventa dannoso quando le concentrazioni superano la capacità di sequestro cellulare 6,7,8. Un aumento della deposizione di ferro, solitamente co-localizzato con placche di Aβ, è stato osservato sia nelle regioni corticali che in quelle ippocampali del cervello in pazienti con AD 9,10. Attraverso la reazione di Fenton11, il ferro libero intracellulare può generare radicali ossidrilici (•OH) e specie reattive dell'ossigeno. Queste sostanze nocive non solo inducono la neuroinfiammazione attivando le cellule gliali, ma attaccano anche le biomolecole della cellula attraverso lo stress ossidativo, interrompendo la normale funzione cellulare e portando alla disfunzione sinaptica 8,12. Inoltre, l'aumento del ferro è direttamente coinvolto nello sviluppo dei segni patologici dell'AD: il ferro contribuisce alla produzione di Aβ12 e aumenta anche la disfunzione della proteina tau, portando a grovigli neurofibrillari13.
Sono state sviluppate diverse tecniche per valutare il contenuto di ferro nel cervello, tra cui la risonanza magnetica per immagini (MRI), nonché metodi chimici e istochimici14. La quantificazione in vivo dei livelli di ferro intracerebrale mediante risonanza magnetica è clinicamente importante per i pazienti con invecchiamento e neurodegenerazione15. La risonanza magnetica ha il vantaggio di essere non invasiva e altamente sensibile: può rilevare la deposizione di ferro nelle prime fasi della malattia. In particolare, la tecnica dell'aumento dell'R2 campo-dipendente (FDRI) è in grado di distinguere tra diverse forme di ferro, come il ferro ferritina e il ferro eme16. Tuttavia, la risonanza magnetica non è in grado di rilevare l'accumulo di ferro a livello cellulare ed è costosa, quindi viene utilizzata principalmente nelle indagini cliniche17.
La misurazione colorimetrica è un metodo chimico che determina la concentrazione di una sostanza (come il ferro) misurando l'intensità del colore prodotto dalla reazione della sostanza in soluzione con un agente cromogenico18. Questo metodo è facile da eseguire e utilizza reagenti e strumentazione a basso costo, il che lo rende adatto a laboratori con budget limitati18. Tuttavia, l'accuratezza e la sensibilità di questo metodo sono molto limitate, poiché i risultati sono soggetti all'influenza di fattori ambientali, del tempo di sviluppo del colore e del giudizio soggettivo dell'operatore. La spettrometria di assorbimento atomico a fiamma (FAAS) è un altro metodo che può essere utilizzato per valutare i livelli di ferro19. In questo metodo, una soluzione campione chiarificata si ottiene bruciando il tessuto di interesse in un forno ad alta temperatura. Il campione viene quindi disciolto utilizzando acido cloridrico e la concentrazione di ferro nella soluzione viene determinata mediante spettrometria di assorbimento atomico. Questo metodo è altamente sensibile e adatto a tutti i tipi di campioni biologici19. Tuttavia, il processo richiede molto tempo e attrezzature costose, quindi il suo utilizzo è limitato.
La colorazione Perls/DAB per rilevare il ferro ferrico non eme è il metodo di rilevazione del ferro più comunemente usato a causa della sua elevata specificità e facilità di implementazione rispetto ad altri metodi istochimici14. A differenza dell'analisi colorimetrica, la colorazione di Perls è un metodo di colorazione istochimica qualitativa che si basa sulla reazione tra ioni ferro e ferrocianuro di potassio per generare un precipitato blu. Viene utilizzato per visualizzare al microscopio la presenza e la distribuzione del ferro nei tessuti. Inoltre, questo metodo ci permette di distinguere la deposizione di ferro in diversi tipi cellulari e di osservare la distribuzione subcellulare della deposizione di ferro, fornendo un metodo per lo studio del20 d.C. La colorazione di Perls rileva principalmente il ferro ferrico non eme e dipende dalla formazione del complesso blu di Prussia:
(Blu di Prussia)
Tuttavia, la tradizionale colorazione di Perls è inefficace per rilevare la localizzazione del ferro a bassi livelli di ferro. Quando viene aggiunta la diaminobenzidina (DAB), reagisce con l'esacianoferrato ferrico per formare un composto marrone, aumentando la specificità del test21.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come valutare la quantità e la distribuzione della deposizione di ferro nel cervello di un modello murino di AD. In questo protocollo, topi transgenici 5×FAD (C57BL/6J) di 8 mesi sono stati utilizzati come modello murino di AD e sono stati confrontati con topi wild-type della stessa età. I dettagli delle procedure per la preparazione del reagente chimico, il sezionamento del cervello, l'esecuzione della colorazione Perls/DAB e l'analisi delle immagini scattate dopo la colorazione sono presentati qui.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina di Xuzhou e con le normative governative cinesi per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Perfusione di animali
- Preparare il fissativo: Sciogliere il 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato all'1× (PBS) (vedi Tabella 1).
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg). Una volta che il topo è stato anestetizzato, fissarlo al vassoio per la chirurgia di perfusione con quattro perni per fissare gli arti.
ATTENZIONE: Per garantire un'anestesia adeguata, verificare la perdita di risposte al pizzicamento delle dita dei piedi, al rilassamento dei muscoli degli arti e al respiro profondo, lento e costante. - Taglia il petto con le forbici per esporre il cuore e taglia l'atrio destro. Iniettare 20 ml di PBS 1× nel ventricolo sinistro con una siringa per lavare il sangue. Quindi, iniettare 20 ml di PFA al 4% per il fissaggio.
NOTA: Controllare la profondità e la direzione dell'ago per evitare di perforare il setto interventricolare. Ricorda che una perfusione ottimale è caratterizzata da un fegato pallido e arti rigidi dopo il tremore iniziale. - Decapitare il topo perfuso, tagliare l'osso attorno al cranio con un paio di forbici sottili, sollevare con cura il cranio usando una pinza smussata ed estrarre il cervello. Quindi, immergere il cervello in PFA al 4% a 4 °C per una notte.
ATTENZIONE: Fai attenzione al 4% di PFA, che è un forte irritante per le vie respiratorie. Indossare una maschera appropriata ed eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.
NOTA: Il metodo di eutanasia è stato approvato dall'IACUC del programma di cura e utilizzo degli animali della Xuzhou Medical University Linee guida per l'eutanasia: topi / ratti.
2. Criosezione cerebrale
- Disidratare il cervello con soluzioni graduate di saccarosio (15% e 30%) a 4 °C per 24 ore per ogni fase. Il cervello dovrebbe finalmente sprofondare sul fondo della soluzione di saccarosio.
- Emisectare il cervello lungo la fessura interemisferica con un bisturi. Mettere la metà sinistra in una provetta da microcentrifuga da 5 mL riempita con 1 mL di soluzione di saccarosio al 30% e un volume uguale di composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) per migliorare il contatto tra l'OCT e il cervello.
- Tagliare il tessuto estraneo dall'emisfero sinistro con una lama di rasoio e spostarlo sulla piattaforma OCT.
- Incorporare il tessuto nell'OCT con il supporto di una parete circolare in foglio di alluminio.
- Congelare il tessuto in un microtomo criostato a -22 °C per almeno 1 ora e impostare la temperatura della testa di taglio a -19 °C.
NOTA: Ricordarsi di preraffreddare il vetro antirollio e le spazzole nel criostato insieme al campione. - Montare il blocco di tessuto congelato. Taglia nuovamente il blocco di tessuto in una posizione appropriata a seconda dell'area di interesse e poi inizia a sezionare il cervello in sezioni sagittali spesse 20 μm.
NOTA: Se le sezioni si piegano, utilizzare spazzole morbide per aprire le sezioni. - Raccogli ogni sezione sui vetrini rivestiti di gelatina e spalma su di essa una goccia di 1× PBS. Capovolgere la sezione del cervello con un pennello sottile e poi montare rapidamente la sezione sul vetrino.
- Asciugare le parti raccolte a temperatura ambiente per una notte e conservarle a −20 °C.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa per un massimo di 2 settimane. Un tempo di conservazione più lungo può interferire con la qualità del tessuto e quindi influenzare l'esito dell'esperimento.
3. Colorazione Perls'/DAB
- Preparare le seguenti soluzioni: ferrocianuro di potassio al 2% (K4[Fe(CN)6]·3H2O), acido cloridrico (HCI) al 2% e soluzione DAB al 20× (vedere Tabella 1).
- Mettere un vetrino contenente sezioni in un barattolo colorante riempito con 1× PBS e posizionare il barattolo su uno shaker orbitale per 5 minuti per lavare via l'OCT dal fazzoletto.
NOTA: Regolare attentamente la velocità dell'agitatore orbitale (velocità consigliata: 20 giri/min) per evitare che il tessuto cada dal vetrino ad alta velocità. - Mescolare 20 mL di soluzione di ferrocianuro di potassio al 2% e un volume uguale di acido cloridrico al 2% in una provetta da centrifuga da 50 mL.
- Utilizzare una pinza di plastica per trasferire il vetrino nella provetta da 50 mL e quindi riscaldare la provetta a bagnomaria a 60 °C per 30 minuti.
- Sciacquare il vetrino con 1× PBS e tamponare la soluzione in eccesso con carta velina.
- Utilizzare una pipetta per aggiungere 50 μl di soluzione DAB a ciascuna sezione del cervello e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione DAB in eccesso con una pipetta e quindi lavare il vetrino 3 volte in PBS.
- Disidratare le sezioni con soluzioni alcoliche graduate (50%, 70%, 95%, 100%) e xilene (100%, 100%). Incubare i vetrini per 3 minuti ciascuno.
- Sigillare le sezioni con gomma neutra22 e quindi posizionare il vetrino coprioggetti.
- Asciugare i vetrini in una cappa aspirante per 24 ore prima di riporli in una scatola per vetrini da microscopio.
4. Imaging
- Accendi il microscopio, regola la luminosità della sorgente luminosa e metti a fuoco la sezione del cervello sotto un obiettivo con ingrandimento di 4×.
- Acquisisci l'immagine con il software di controllo della fotocamera e regola le impostazioni dei parametri per evitare la sovraesposizione. Le impostazioni specifiche (10×, 40× obiettivo) sono mostrate nella Figura 1.
NOTA: Evitare di utilizzare il bilanciamento del bianco automatico per garantire lo stesso tempo di esposizione per ogni immagine. - Passa a un obiettivo con ingrandimento di 10×, sposta il tavolino del microscopio per mettere a fuoco le aree con segnali di colorazione Perls/DAB elevati, in particolare l'ippocampo e la corteccia cerebrale, e acquisisci le immagini (Figura 1A).
- Passa a un obiettivo con ingrandimento 40x per acquisire immagini con chiari segnali di colorazione.
- Salva ogni immagine come TIFF a 8 bit ed esporta le immagini per ulteriori analisi.
5. Analisi delle immagini
- In ImageJ/Fiji, selezionare Plug-in > stitching > Stitching Griglia/Collezione nel menu, quindi selezionare Posizione sconosciuta per scegliere le immagini da unire (Figura 2A).
- Scegliere File > Salva come > Tiff per salvare l'immagine finita come TIFF (Figura 2B).
- Utilizzare ImageJ/Fiji per aprire un'immagine e assicurarsi che il formato dell'immagine sia RGB Color (Figura 2C).
- Selezionare Plug-in > IHC Profiler Image (Immagine profilo IHC Profiler ) nel menu, quindi scegliere Modalità > Immagine colorata citoplasmatica e l'impostazione predefinita di Deconvoluzione del colore H DAB (Figura 2D). Quindi converti il formato dell'immagine in scala di grigi a 8 bit.
- Convertire i valori di grigio dell'immagine in valori OD selezionando Analizza > Calibra > OD non calibrato (Figura 2E).
- Utilizzare la funzione Soglia per selezionare l'area di colorazione positiva Perls/DAB, quindi regolare le barre di scorrimento orizzontali fino a coprire tutti i punti marroni del segnale (Figura 2F).
- Fare clic su Analizza > Imposta misurazioni, quindi selezionare le opzioni Area, Valore medio di grigio, Densità integrata e, soprattutto, Limita alla soglia per escludere il rumore di fondo (Figura 2G).
- Selezionare Analizza > misura per ottenere la tabella dei risultati (Figura 2H).
- Raggruppa i risultati e utilizza un software statistico per eseguire analisi statistiche. Nel nostro caso, abbiamo confrontato l'accumulo di ferro nell'ippocampo e nella corteccia di topi transgenici 5xFAD con quello nel controllo negativo (topi wild-type). Per i confronti a tre gruppi, è stata utilizzata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per i dati della distribuzione gaussiana con la stessa deviazione standard.
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Risultati
Per studiare la distribuzione e l'accumulo di ferro in un modello murino di AD, abbiamo eseguito la colorazione Perls/DAB in fette sagittali di topi 5xFAD di 8 mesi. Come mostrato nella Figura 3, i segnali di colorazione di Perls/DAB sono stati osservati in topi 5xFAD e wild-type di 8 mesi e in topi wild-type di 2 mesi. Nei topi 5xFAD, sono stati osservati segnali di colorazione Perls/DAB elevati nell'ippocampo e nella corteccia, specialmente nel subiculum dell'ippocampo. I topi wild-type so...
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Discussione
La deposizione di ferro è strettamente associata al morbo di Alzheimer. Da un lato, può portare alla produzione di Aβ attraverso molteplici meccanismi, tra cui l'aumento dell'espressione della proteina precursore dell'amiloide{NOTA:20}23, e anche l'aumento dell'attività della γ-secretasi, che può portare a un'accelerazione della produzione di Aβ24; D'altra parte, la perossidazione lipidica indotta dall'aumento del ferro può promuovere la po...
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Dichiarazioni
Questa ricerca è stata supportata da un progetto generale della Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione: 32271010).
Ringraziamenti
Durante la preparazione di questo lavoro gli autori hanno utilizzato DeepSeek per migliorare il linguaggio e la leggibilità. Dopo aver utilizzato questo strumento/servizio, gli autori hanno rivisto e modificato il contenuto secondo necessità e si assumono la piena responsabilità del contenuto della pubblicazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 M PBS | biosharp | BL601A | Aggiungere acqua deionizzata per ottenere la soluzione |
| 4% PFA | Beyotime | P0099 | Ripristino a 4 gradi C per l'uso |
| 20X soluzione DAB | Bioss | C-0003 | Mix 10 μ l. soluzione A, 10 μ l soluzione B e 180 μ l PBS |
| Alcohol | Supelco | 107017 | |
| HCL | Sigma | 7647-01-0 | Aggiungere acqua distillata a 50 ml |
| ketamina | China National Medicines | H20193336 | 100 mg/kg per anestetizzare |
| il microscopio | Olympus | CX43 | |
| Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| soluzione di ferrocinide di potassio | Sigma | 14038-43-8 | Aggiungere acqua distillata a 50 ml |
| saccarosio | Sigma | 57-50-1 | |
| xilazina& nbsp; | Y-S Biotechnology | YS-(BC)-2842 | 15 mg/kg per anestetizzare |
| xileni Sigma | 1330-20-7 |
Riferimenti
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